CC BY
232
СОВМЕСТНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ С ДРУГИМИ УЧРЕЖДЕНИЯМИ
УДК 615.074/372:577.112.6/27
Г.Н. Афиногенова, Н.М. Пустошилова, М.П. Смолина, А.В.Рябченко
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ В ПРЕПАРАТАХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
ООО НПО «Биотест», Новосибирск
ООО «Центр инженерной иммунологии», Новосибирск ЗАО «Вектор-Медика», п. Кольцово, Новосибирская область ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Для количественного определения эндотоксинов в терапевтических препаратах рекомбинантных белков применяется ЛАЛ-тест, который считается наиболее надежным способом проверки лекарственных средств на присутствие пирогенных примесей. В настоящей работе мы провели сравнение ранее разработанной нами методики определения пирогенности в препаратах рекомбинантных цитокинов, основанной на использовании типичных химических реакций углеводов, с широко используемым ЛАЛ-тестом. Показано, что разработанный метод позволяет выявлять примеси эндотоксина с чувствительностью 30 пг/мг препарата и сравним с ЛАЛ-тестом, чувствительность которого составляет 10 пг/мг препарата.
Ключевые слова: эндотоксин, рекомбинантые белки
Современное производство ряда медицинских препаратов связано с применением технологии рекомбинантных ДНК, которая предполагает использование микробных клеток в качестве продуцентов. Остаточные компоненты микроорганизмов могут вызывать побочные эффекты при применении таких фармпрепаратов. Внедрение этих лекарственных средств в медицинскую практику требует разработки и совершенствования адекватных методов контроля их качества для безопасности человека.
Одним из контролируемых примесных компонентов инъекционных лекарственных препаратов, подлежащих строгой регламентации, являются бактериальные эндотоксины, которые являются основным структурным компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Эндотоксин, или липополисахарид (ЛПС) устойчив к физическим и химическим воздействиям, поскольку по своему физиологическому назначению обеспечивают высокую стабильность бактерий во внешней среде и в условиях организма [1, 2].
В зависимости от вводимой дозы эндотоксины могут вызывать лихорадку, изменение метаболизма липидов и углеводов, усиление активации системы комплемента и факторов свертывания крови, что может заканчиваться таким грозным осложнением, как диссеминированное внутрисо-судистое свертывание, эндотоксический шок [3].
Существует несколько способов определения липополисахаридов, которые имеют свои достоинства и недостатки [4, 5]. Ранее нами был описан метод определения примесей эндотоксинов в растворах белков, основанный на типичных химических реакциях углеводов [6]. Предлагаемый метод по чувствительности (30 пг/мг препарата) сравним с высокочувствительным ЛАЛ-тестом (1-10 пг/мг), лишен его недостатков, таких как: требование высокой стерильности растворов и инструментов, необходимость предварительного изучения влияния препарата белка на ЛАЛ-реа-гент. Кроме того, известно, что некоторые белки могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие на проведении реакцию связывания эндотоксинов с ЛАЛ-реактивом [7, 8]. В данной работе проведено сравнение двух указанных методов при определении содержания ЛПС в субстанциях рекомбинантных цитокинов.
Материалы и методы исследования
Материалы. В работе использовали рекомбинантные белки, полученные по разработанной промышленной технологии. Рекомбинантный человеческий Г-КСФ получен по технологии ГНЦ ВБ «Вектор» [9]. Рекомбинантный человеческий интерферон-а2Ь произведен фирмой ЗАО «Вектор-Фарм» [10]. Рекомбинантный человеческий ФНО-альфа предоставлен ООО «ЦИИ иммунологии».
ЛПС из клеток E. coli шт. 055:В6, гидразид биотина, конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза, нитроцеллюлозная мембрана GSWP0 с диаметром пор 22 цм, 3-бром-индолилфосфат, нитротетразолевый синий и полиадениловая кислота (полиА) — фирмы «Sigma» (США).
Набор для определения эндотоксинов методом ЛАЛ-тест предоставлен фирмой «CAPE COD Inc», регистрационное удостоверение М3 РФ № 99/74 от 07.06.1999 г. Чувствительность ЛАЛ-реактива — 0,03 Единиц Эндотоксина/мл, ЕЭ/мл.
Методы. Определение примеси ЛПС методом биотинилирования проводили, как описано в работе [6]. Выделенные примесные ЛПС из препаратов белков подвергали двум последовательным реакциям: окислению с помощью перйодата натрия и биотинилированию с помощью гидразина биотина. Полученные биотинилированные ЛПС наносили на нитроцеллюлозную мембрану, продукты реакции проявляли в системе стрептавидин-щелочная фосфатаза, используя красители бром-хлор-индолилфосфат и нитротетрозолевый синий. Фильтр с окрашенными продуктами реакции сканировали, и интенсивность продуктов реакции оценивали с помощью компьютерной программы Gel Pro 4. По результатам строили график логарифмической зависимости интенсивности окрашивания пятен стандартного ряда от концентрации ЛПС в пятне.
Определение содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-реагента проводили полуколичественным методом «гель-тромб» в соответствие с требованиями ОФС
[11]. Испытуемые препараты проверяли в ряду последовательных двукратных разведений с обязательной постановкой заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива, контроля ингибирования, отрицательного и положительного контроля. Ингибирующее действие испытуемого образца определяли для всех разведений.
Значение максимально допустимого содержания эндотоксинов в исследуемых цитокинах рассчитывали по формуле, изложенной в работе
[12].
Д = К X С г< л
где А — максимально допустимое содержание эндотоксинов в исследуемых цитокинах, выраженное в единицах эндотоксина на 1 мл, ЕЭ/мл,
К — пороговая пирогенная доза (ЕЭ/кг/час); для растворов, предназначенных для парентерального введения — 5 ЕЭ/кг/час [13],
С — концентрация препарата в растворе, мг/мл;
М — максимальная доза исследуемого препарата для парентерального введения, мг/кг/ час.
Максимально допустимое разведение (МДІ каждого препарата рассчитывали по формуле:
МДР = ^— [2],
где А — максимально допустимого содерж; ния эндотоксинов,
X — чувствительность ЛАЛ-реактива.
Испытуемые препараты проверяли в разведі ниях, равных максимально допустимым разведі ниям, выше и ниже этого значения.
Результаты и обсуждение
Современная биотехнология позволяет ПОЛ} чать лекарственные препараты с использование не только природного и синтетического сырь; но и применять технологии с использованием качестве продуцентов эукариотических и прс кариотических клеток. В конечном продукті полученном с помощью этих методов, возможн присутствие примесей фрагментов клеток-прод} центов и их производных, в частности одного и компонентов наружной клеточной стенки бакте рий — ЛПС.
Для испытания препаратов на присутстви ЛПС в настоящее время используют два утверж денных метода: тест на присутствие пирогеної проводимый на кроликах, и определение эндс токсинов с помощью ЛАЛ-теста. Тест на кроли ках достаточно прост, но имеет ряд недостаткої Он используется как разрешающий или запре щающий тест и часто зависит от индивидуаль ных особенностей животного. В настоящее врем, тест определения примеси эндотоксина в анали зируемых препаратах, проводимый на кролика заменяет ЛАЛ-тест. ЛАЛ-тест достаточно прос в применении, позволяет быстро полуколичест венно и количественно определить содержани примеси эндотоксина.
Одним из недостатков российской системі регулирования правил введения ЛАЛ-теста і отечественную фарминдустрию является отсутс твие утвержденных правил расчета предельноп содержания бактериальных эндотоксинов в ле карственном препарате. Максимально допусти мое содержание эндотоксинов (А) для изучаемы: препаратов определяли на основании литератур ных источников по применению цитокинов, в со ответствии с методикой. Расчеты вели с учето» дозы и способа введения цитокинов по формула*
1 и 2.
ФНО-альфа
Максимальная доза (М) вводимого препарат; составляет 150 мкг/ м2 /час [14], или М= 3,8 мкг, кг/час. Отсюда А = 1316 ЕЭ/мл, МДР для ФНО альфа — 43866.
Г-КСФ
Максимальная доза препарата составляет 10 мкг/кг/час [15] , А = 500 ЕЭ/мл, МДР для Г-КСФ - 16666.
Интерферон-а2Ь
С = 40x106 Ед/мл,
М = 6 х106 Ед/час на человека или 0,08 х106 Ед/кг/час [16], А = 2352 ЕЭ/мл, МДР для интер-ферона-а2Ь — 78400.
Известно, что растворы белков очень часто ингибируют реакцию взаимодействия эндотоксина и ЛАЛ-реактива, поэтому предварительные анализы были построены таким образом, чтобы выявить возможное ингибирование. В таблицах 1-3 приведены результаты испытания нескольких растворов цитокинов из серии образцов. В приведенных примерах стандартные контроли не указаны.
Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что препарат ФНО-альфа ингибирует реакцию до разведения 1:750. Для правильной интерпретации результатов, следует брать разведение вдвое больше того разведения, при котором исчезает ингибирующее действие. Для ФНО-альфа это значение равно 1:1500. Содержание бактериальных эндотоксинов, определенное реакцией взаимодействия эндотоксина и ЛАЛ-реактив, в проверяемой серии равно (60±2,5) ЕЭ/мг, или учитывая паспортные данные используемого ЛАЛ-теста, 6 нг/мг. Испытуемая серия содержит примесь эндотоксина, не превышающую допустимые концентрации. Результаты, полученные для ФНО-альфа серия № 2, приведены в таблице 4.
Проведение предварительного испытания реакции ингибирования препаратом Г-КСФ (таблица 2) показало, что он не ингибирует реакцию. Содержание бактериальных эндотоксинов в проверяемой серии равно (15±1,5) ЕЭ/мг, или учитывая паспортные данные ЛАЛ-теста -1,5 нг/мг. Похожие результаты получены для серии № 2. Исследуемые образцы белка содержит примесь эндотоксина, не превышающую допустимые концентрации.
Судя по результатам, приведенным в таблице 3, препарат интерферона-альфа2 не ингибирует реакцию. Содержание бактериальных эндотоксинов в проверяемой серии равно (450+28) ЕЭ/мл, или 45 нг/мг. Аналогичные результаты получены для интерферона-альфа 2 серии № 2 и 3.
Таким образом, исследуемые образцы белков содержат примесь эндотоксина, не превышающую допустимый уровень.
Параллельно с определением примеси эндотоксина в препаратах с помощью ЛАЛ-теста, концентрацию ЛПС определяли методом биотинили-рования его полисахаридного участка. Количество
Таблица 1
Результаты испытания ингибирующего воздействия различных разведений субстанции ФНО-альфа (серия № 1, МДР = 43866) на реакцию взаимодействия эндотоксина и ЛАЛ-реактива
Разведение испытуемого препарата
1 : 100 1 :200 1:750 1:1500 1:2000 1:3000 1:12000 1:24000
+ + + + + - -
Разведение испытуемого препарата
с контрольным стандартом эндотоксина в концентрации 1 к
- - + + + + + +
Таблица 2
Результаты испытания ингибирующего воздействия различных разведений субстанции Г-КСФ (серия № 1, МДР = 16600) на реакцию взаимодействия эндотоксина и ЛАЛ-реактива
Разведение испытуемого препарата
1: 100 1:250 1:500 1: 1000 1:12000 1:16000
+ + + - - -
Разведение испытуемого препарата
с контрольным стандартом эндотоксина в концентрации 1 к
+ + + + + +
Таблица 3
Результаты испытания ингибирующего воздействия различных разведений субстанции интерферона-альфа 2 (серия № 1, МДР = 78400) на реакцию взаимодействия эндотоксина и ЛАЛ-реактива
Разведение испытуемого препарата
1:500 1:1000 1:2000 1:2600 1:3330 1:4000 1:8000
+ + + + + - -
Разведение испытуемого препарата с контрольным стандартом эндотоксина в концентрации 2 X
+ + + + + + +
ЛПС в образцах определяли, используя калибровочный график стандартного ряда концентраций ЛПС (Рис. 1). Из рисунка видно, что рабочий диапазон концентраций, при котором сохраняется линейная зависимость, находится в пределах от 15 до 10000 пг/пятно. Чувствительность данного метода составляет 20-30 пг ЛПС в виде пятна на
log пг/мл
Рис 1. Калибровочный график стандартного ряда зависимости оптической плотности проявленного пятна от концентраций ЛПС в растворе белка. Коэффициент корреляции >0,99
Таблица 4
Анализ содержания примеси эндотоксина в субстанциях препаратов цитокинов методом биотинилирования ЛПС и ЛАЛ-тестом
Разведение препарата, ингибирующее реакцию Содержание эндотоксина
Название препарата Предельное содержание эндотоксинов Е.Э/мг ( нг/мг) ЛАЛ-тест Е.Э./мг (нг/мг) Метод биотинилирования (нг/мг) Отношение метода биотинилирования к ЛАЛ-тесту
ФНО-альфа № 1 1:750 1316 (131,6) 60±2,5 (6) 20± 1,5 3,3
ФНО-альфа №2 1:750 1316 (131,6) 90±3 (9) 28± 1,5 3,1
Г-КСФ №1 не ингибирует 500 (50) 15±1,5 (1,5) 6±1 4
Г-КСФ №2 не ингибирует 500 (50) 30±3,7 (3,0) 11 ±2 2,7
ИНФ-а2Ь №1 не ингибирует 1785 (178,5) 450±28 (45) 211±12,5 3,8
ИНФ-а2Ь №2 не ингибирует 1785 (178,5) 488± 31 (48,8) 223±16 3,8
ИНФ-а2Ь №3 не ингибирует 1785 (178,5) 218±13 (21,8) 31+2,6 1,4
нитроцеллюлозной мембране. Данной чувствительности достаточно для определения примеси ЛПС в образцах лекарственных препаратов.
Результаты эксперимента по определению содержания примеси ЛПС в субстанциях разными методами различных серий рекомбинантных цитокинов приведены в таблице 4. Из таблицы видно, что количество эндотоксинов в исследованных препаратах цитокинов колеблется в пределах от 6 до 223 нг/мг препарата, определенное методом биотинилирования, и 1,5-48 нг/мг, определенное ЛАЛ-тестом. Полученные результаты позволяют говорить о достаточно высоком качестве препаратов рекомбинантных белков.
В более ранних работах мы приводили сравнение двух методов по определению эндотоксина на примере рекомбинантного белка ФНО-альфа. В статье были приведены данные о том, что количество примеси ЛПС, определенное ЛАЛ-тестом на 2-3 порядка меньше, чем определенное методом биотинилирования. Подобное расхождение объяснялось эффектом ингибирования белком реакции ЛАЛ-теста и недостаточной базой для проведения ЛАЛ-теста.
Результаты проведенной работы по определению примеси ЛПС в семи образцах цитокинов также подтвердили эту закономерность. Количество примеси ЛПС определенное методом биотинилированием превышает в 2-3 раза количество примесей, обнаруженных с помощью ЛАЛ-теста. Вероятно, на реакцию биотинилирования ЛПС влияют другие факторы. Как известно, реакция периодатного окисления не является специфичной для ЛПС. Цис-гликолиевые группы полисахаридов и полисахаридов, входящих в состав многих молекул, в частности РНК, также могут подвергаться окислению перйодатом на-
трия и в конечном результате могут давать дополнительное окрашивание [17]. Здесь уместно заметить, что содержание примеси молекул РНК в препаратах рекомбинантных белков не регламентируется Фармкомитетом М3 и СР РФ.
В связи с изложенным мы поставили перед собой задачу исследовать возможное влияние цис-гликолевых групп РНК на реакцию биотинилирования. В качестве модели РНК использовали полиадениловую кислоту (поли-А). Чтобы исключить влияние возможных примесей ЛПС в препарате поли-А на реакцию, предварительно определили содержание в образце эндотоксина. Было установлено, что количество ЛПС в препарате поли-А не превышает фоновых значений.
Полученные результаты позволили приступить к решению выше упомянутой задачи. Препарат поли-А, в расчетной молярной концентрации, равной концентрации стандартного ряда ЛПС, подвергли той же процедуре биотинилирования, что и искомый ЛПС. Результаты опыта показали, что присутствие в растворе молекул поли-А, в количестве равном количеству взятого для стандартного ряда ЛПС в реакции, может давать добавочную оптическую плотность в пятне до 30%, что и отражается на данных опыта (Таблица 4). Дополнительное исследования методом добавки образца поли-А к известному количеству ЛПС в растворе, подтвердил это предположение.
Следует особо подчеркнуть, что до сих пор нет четко сформулированных требований относительно того, перевод каких препаратов на ЛАЛ-тест может считаться предпочтительным. Таким образом, предложенный нами метод биотинилирования углеводных компонентов ЛПС для определения примеси бактериальных эндотоксинов в субстанциях рекомбинантных цитокинов
может занять достойное место в перечне методов определения качества лекарственных препаратов. Чувствительность метода приближается к таковой ЛАЛ-теста, поскольку предел обнаружения примеси ЛПС методом биотинилирования составляет 30 пг/мл, а с помощью ЛАЛ-теста — 1-10 пг/мл. Таким образом, несмотря на то, что метод биотинилирования углеводных компонентов не является абсолютно специфичным по отношению к молекулам ЛПС, высокая чувствительность этого метода, дает основание применять его (в случае невозможности применения ЛАЛ-теста) для определения эндотоксинов в лекарственных препаратах, полученных в биотехнологическом производстве.
METHODS FOR DETECTION OF THE BACTERIAL ENDOTOXINS IN THE RECOMBINANT PROTEIN PREPARATIONS.
G.N. Afinogenova, N.M. Pustoshilova, M.A. Smo-lina, A. V.Ryabchenko
The LAL-TEST which is considered the most reliable way of check of medical products on presence pyrogenic admixtures is applied, usually, to quantification of the endotoxins in the therapeutic recombinant protein preparations. In the present work we have carried out comparison the technique of pyrogenic admixtures test in the recombinant cytokines preparations developed by us before, based on use of typical chemical reactions of the carbohydrates, with widely used LAL-TEST. It is shown, that the developed technique allows to reveal endotoxins admixtures with sensitivity of 30 pg/mg of a preparation analyzed and is comparable with the LAL-TEST which sensitivity makes 10 pg/mg of a preparation.
Литература
1. Hitchcock, P. The protein component of. bacterial endotoxins / P. Hitchcoch, D. Morrison // Handbook of endotoxin. — 1984. — Vol. 1. — P. 339-375.
2. Rietsschel, E. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity / E. Rietsschel, F. Kirikae, A. Schade //Jmmunobiology. — 1993. — Vol. 187.
- P. 169-190.
3. Lamping, N. LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by LPS or gram-negative bacteria /
N. Lamping, N. Dettmer, D. Schroeder //J. Clin. Investig.
- 1998. - Vol. 101. - P. 2065-2074.
4. Глазова, Н.В. Анализ пирогенности в препаратах панкреатической рибонуклеазы / Н.В. Глазова, Т.Б. Ефимова, Л.В. Дмитренко // Хим.-фарм.журн. — 1991.
- № 1.-С. 79-81.
5. Аронова, Н.В. Использование препаратов ЛПС Trancisella tularensis в точечном твердофазном имму-ноферментном анализе / Н.В. Аронова, Н.В. Павлович // Журн. Микробиол. — 2000. — № 5. — С. 75-77.
6. Определение примесей липополисахаридов в препаратах белков / Л.Я Денисова, А.И. Закабунин, Г.Н. Афиногенова и др. // Журн. микробиол., эпидеми-ол. и иммунологии. — 1999. — № 5. — С. 109-112.
7. Bacterial endotoxins test. Р.1697-1699. USP 23 NF 18 1994. U.S. Pharmacopeial Convention. Jnc., Rockville MD.
8. Tanaka, S. Limulus test for detecting bacterial endotoxins / S. Tanaka, S. Iwanaga // Mehtods Enzymol.
- 1993. - Vol. 223. - P. 358-361.
9. Патент РФ № 220 Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора Г-КСФ / Н.М. Пустошилова, В.П. Романов; Опубликовано в БИ №10 10.04.03.
10. Получение интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного, субстанция / РП-39144577-003-2004.
11. Бактериальные эндотоксины / ОФС 42-0002-00.
- М., 2000.
12. Долгова, Г.В. Предельное содержание бактериальных эндотоксинов в лекарственных препаратах / Г.В. Долгова, Н.П. Неугодова, А.Г. Ситников // ЛАЛ-тест. — 2003. — №3. — С. 2-8.
13. Guideline on validation of the Limulus amebocyte lysate test as end-product endotoxin test for human and animal parenteral drags, biological products, and medical devices / U.S. Department of Health Servise, Public Health Servise, Food and Drug Administration, December 1987.
14. Mueller, H. G. Tumor necrosis factor as an antineoplastic agent: pit-falls and promises / H.G. Mueller,
H.R., Stennicke, L.H. Deveraux // Cell Mol. Life Sci. — 1998. - Vol. 54. - P. 1291-1998.
15. Welte, K. Filgrastim (r-metHuG-CSF): the first 10 years / K. Welte, J. Gabrilove, M. Bronchud // Blood.
- 1996. - Vol. 15. - P. 1907-1929.
16. Змыгова, A.B. Интерферонотерапия вирусных гепатитов: Пособие для врачей / А.В. Змыгова . — Новосибирск, 2002. — 138 с.
17. Методы исследования нуклеиновых кислот. -М., 1970.-С. 99-107.
