CC BY
212
СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Выбор метода определения бактериальных эндотоксинов
О. В. ШАПОВАЛОВА, Н. П. НЕУГОДОВА, Г. А. САПОЖНИКОВА
Научный центр экспертизы средств медицинского применения МЗ РФ, Москва
Choosing Bacterial Endotoxin Detection Method
O. V. SHAPOVALOVA, N. P. NEUGODOVA, G. A. SAPOZHNIKOVA Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, Moscow
Для обнаружения и количественного определения бактериальных эндотоксинов используются различные методы испытаний: гель-тромб тест, который является арбитражным и основан на образовании геля, а также фотометрические (инструментальные) методы, определяющие интенсивность окраски или мутности в испытуемых растворах. В настоящей статье рассматриваются особенности современных методов обнаружения бактериальных эндотоксинов, их преимущества и недостатки. На основании информационного анализа и практического опыта установлены основные критерии выбора метода определения пирогенных примесей. Гель-тромб тест и фотометрические определения бактериальных эндотоксинов достаточно надёжны и воспроизводимы. При наличии необходимого оборудования и реактивов выбор остаётся за аналитиком. В единичных случаях применяют инструментальные методы благодаря их высокой чувствительности, позволяющей избежать влияния мешающих факторов в испытаниях ЛАЛ-теста.
Ключевые слова: бактериальные эндотоксины, гель-тромб тест, фотометрические методы, турбидиметрический, хромогенный, мешающие факторы.
Various test methods are used to detect and quantify bacterial endotoxins: a gel-clot test, which is arbitral and is based on the formation of a gel, and photometric (instrumental) tests that determine the intensity of the color or turbidity in the test solutions. In this article we consider the features of modern methods for detecting bacterial endotoxins, their advantages and disadvantages. Based on information analysis and practical experience, the main criteria for choosing a method for determining pyrogenic impurities are established. The gel-clot test and photometric determinations of bacterial endotoxins are sufficiently reliable and reproducible. The choice is left for the analyst when all necessary equipment and reagents are available.Instrumental methods are used in rare case due to their high sensitivity, which allows to avoid the influence of interfering factors in the LAL-test.
Keywords: bacterial endotoxins, gel-clot test, photometric methods, turbidimetric, chromogenic, interfering factors
Введение
В государственную фармакопею Российской Федерации XIII издания в Общую Фармакопейную Статью (ОФС) «Бактериальные эндотоксины» впервые включены фотометрические методы. В статье наряду с визуальными методами А (качественный гель-тромбтест) и В (количественный гель-тромб тест) достаточно подробно описаны методы (С, Б, Е и Б), которые в отличие от гель-тромб теста, позволяют количественно-оценить содержание бактериальных эндотоксинов (БЭ) [1, 2]. Таким образом, предусмотрено четыре модификации фотометрических методов: турбидиметрические и хромогенные тесты, выполняемые способом кинетического определения или по конечной точке. Турбидиметричес-кий метод основан на переходе в реакционную смесь коагулогена, содержащегося в ЛАЛ-реак-тиве, на каогулин-гель и помутнение её. Хромо-генный — на окрашивании реакционной смеси после расщепления синтетического пептид-хро-
© Коллектив авторов, 2018
Адрес для корреспонденции: 127051 Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2. НЦЭСМП
могенного комплекса, где коагулоген заменён на искусственный хромогенный субстрат. Хромо-генный субстрат представляет собой простой полипептид с хромофором на конце [3].
Каждый из методов оценки БЭ имеет свои особенности, знание которых позволит выбрать оптимальный вариант для анализа испытуемого образца. Для принятия решения, каким методом проводить определение содержания БЭ в образцах лекарственного средства, следует ответить на следующие вопросы:
1. Какие предъявлены нормативные требования и норма предельного содержания БЭ, если таковые имеются?
2. Какое в наличии материально-техническое оснащение?
3. Каковы физико-химические свойства испытуемого образца (мутность, цвет, вязкость и пр.)?
4. Какое количество испытуемых образцов необходимо оценить единовременно?
5. Какая чувствительность метода требуется?
6. Есть ли необходимость в получении количественных результатов?
7. Есть ли необходимость в хранении результатов на электронном носителе [4]?
Гель-тромб тест (Методы А и В)
Наиболее распространённым в фармакопейном анализе способом определения содержания БЭ в лекарственных средствах является гель-тромб тест. В данной модификации результат реакции эндотоксина с ЛАЛ-реактивом оценивается визуально по образованию твёрдого геля, который остается на дне пробирки после её переворачивания на 180°С. В связи с тем, что концентрация БЭ, определяемая в ЛАЛ-тесте, зависит от чувствительности используемого ЛАЛ-реактива, минимальная измеряемая концентрация БЭ составляет 0,015 ЕЭ/мл, что соответствует максимальной чувствительности ЛАЛ-реактива (1=0,015 ЕЭ/мл) [5].
Гель-тромб тест может быть выполнен в виде качественного анализа (метод А), устанавливающего соответствие образца заявленной норме предельного содержания БЭ, поэтому его часто называют «предельным» или «разрешающим/запрещающим». Концентрацию БЭ в испытуемых образцах можно определить методом В, например с помощью, двукратных разведений испытуемого образца [6].
Методы А и В являются наиболее доступными, для них не требуется считывающего прибора. Кроме того, выполнение гель-тромб теста возможно не только для истинных прозрачных и бесцветных растворов, но и для непрозрачных или окрашенных образцов, а так же для суспензий [7, 8].
Несмотря на большие преимущества метода А и В, гель-тромб тест имеет следующие ограничения:
1) не автоматизированный тест, где учёт результатов проводят визуально и интерпретируют субъективно;
2) невозможно определить точное содержание БЭ;
3) наличие значительной погрешности (двукратная ошибка опыта);
4) метод требует существенных финансовых и трудовых затрат при определении большого числа образцов лекарственных средств (на производстве).
Фотометрические методы
Для всех четырёх методов определения БЭ предусмотрены испытания с использованием фотометрического прибора (например, автоматический фотометр для микропланшет ЕЬх808) и построением калибровочной кривой стандарта эндотоксинов в различных концентрациях.При этом целесообразно использовать программное обеспечение, которое позволяет фиксировать результаты и хранить их в дальнейшем на бумажном и/или электронном носителе.
Турбидиметрический метод с пределом обнаружения 0,01 ЕЭ/мл основан на развитии мутности реакционной смеси пропорционально увеличению концентрации БЭ, посредством высвобождения коагулогена из ЛАЛ-реактива. Испытуемые пробы переносят в ячейки микропланшета
и помещают его в прибор, где происходит считывание результатов. Оптимальная длина волны — 360 нм. Концентрация БЭ рассчитывается с учётом калибровочной кривой [9, 10].
Хромогенный тест, с пределом обнаружения 0,005 ЕЭ/мл, очень схож с турбидиметрическим с той лишь разницей, что для его проведения используется специальный ЛАЛ-реактив с хромо-генным субстратом, благодаря которому измеряется интенсивность окрашивания реакционной смеси в жёлтый цвет.
Оба теста выполняют в двух модификациях: как кинетические или по конечной точке.
Методы по конечной точке (Е, Б) это первые, из предложенных инструментальных методов. Применение их в настоящее время незначительно, и на практике применяют только хромогенный метод по конечной точке, например, для анализа иммунобиологических препаратов и препаратов крови. Испытания более трудоёмкие в исполнении, так как предусматривают строго регламентированное многократное добавление реактивов: для начала реакции ЛАЛ-реактива с БЭ и её остановки.
Кроме этого следует отметить и другие недостатки методов Е и Б:
1. Узкий диапазон чувствительности (от 1,0 ЕЭ/мл до 0,1 ЕЭ/мл или от 0,1 ЕЭ/мл до 0,01 ЕЭ/мл), в соответствии с которыми требуются дополнительные разведения образцов.
2. Реагент для остановки реакции может вызвать выпадение осадка.
3. Возможны ошибки оператора в ходе трудоёмкого процесса.
В кинетических методах (С и Б) фотометр измеряет оптическую плотность через фиксированные промежутки времени и определяет её изменение с меньшей погрешностью измерения по сравнению с гель-тромб тестом. Анализ считается завершенным, когда оптическая плотность достигает наименьшего значения концентрации БЭ на калибровочной кривой [11, 12].
Диапазон стандартной калибровочной кривой может составлять 100 ЕЭ/мл — 0,005 ЕЭ/мл, что позволяет определять БЭ в лекарственных средствах, обладающих мешающими факторами. Благодаря высокой чувствительности этих методов (С и Б) факторы, усиливающие или ингиби-рующие реакцию с ЛАЛ-реактивом, возможно устранить с помощью разведений водой для ЛАЛ-теста, не превышая при этом значения максимально допустимого разведения (МДР).
Фотометрические методы анализа зависят от условий выполнения испытаний, таких же как и в гель-тромб тесте, и подвержены влиянию особых факторов, например, наличия пузырьков в ячейках микропланшета, мутности, вязкости раствора и т.п.
В результате теоретического и практического анализа всех характеристик методов ЛАЛ-теста
СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Основные критерии выбора метода определения БЭ
Критерии выбора Гель-тромб тест
Техническое оснащение
Свойства испытуемых образцов
Кратность МДР и наличие мешающих факторов
Количество испытуемых образцов
Наличие программного обеспечения
можно установить несколько основных критериев выбора соответствующего теста для определения БЭ в конкретном испытуемом образце (таблица).
В случае сомнений или разногласий окончательное заключение принимают на основании результатов, полученных при проведении испытания методом А [1].
Заключение
Все методы достаточно надёжны и воспроизводимы. При наличии необходимого оборудования и реактивов выбор остаётся за аналитиком. В единичных случаях применяют инструментальные методы благодаря их высокой чувствительности, позволяющей избежать влияние мешающих факторов в испытаниях ЛАЛ-теста. Так, при определении БЭ в образцах лекарственных средств, где отмечаются значительное влияние мешающих факторов и норма с наименьшим значением предельного содержания БЭ (например, «Яблочная кислота», «Ян-ЛИТЕРАТУРА
1. ГФ XIII «Бактериальные эндотоксины» ОФС. 1.2.4.0006.15 / GF XIII «Bakterial'nye endotoksiny» OFS.1.2.4.0006.15 [in Russian]
2. Неугодова Н.П., Рябцова М.С., Сапожникова Г.А. Основные требования к биологическим показателям при оценке качества лекарственных средств. Возможности валидации биологических методов контроля. Ведомости Научного Центра Экспертизы Средств Медицинского Применения. — 2016. — № 3. — С. 3—7. / Neugodova N.P., Ryabtsova M.S., Sapozhnikova O.A. Osnovnye trebovaniya k biologicheskim pokaza-telyam pri otsenke kachestva lekarstvennykh sredstv. Vozmozhnosti validatsii biologicheskikh metodov kontrolya. Vedomosti Nauchnogo TSentra Ekspertizy Sredstv Meditsinskogo Primeneniya 2016; 3: 3—7. [in Russian]
3. Ситников А. Г., Травина Л.А., Багирова В.Л.ЛАЛ — тест. Современные подходы к определению пирогенности. М.: 1997. — С. 19—26. / Sitnikov A. O., Travina L.A., Bagirova V.L. LAL — test. Sovremennye podkhody k opredeleniyu pirogennosti. M.: 1997; 19—26.
4. ResearchGate [Электронный ресурс] — Режим доступа: https://www.researchgate.net/publication/299507542_LAL_Choice_of _Test_Method — LAL: Choice of Test Method — (Дата обращения: 28.11.2017). [in Russian]
5. Sandle T. Pyrogens, Endotoxin and the LAL Test: An Introduction in Relation to Pharmaceutical Processing.Global BioPharmaceutical Resources Newsletter. 2012; 1—16.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Шаповалова Ольга Владимировна — ведущий эксперт лаборатории фармакологии Испытательного центра экспертизы качества ЛС, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва Неугодова Наталья Петровна — к. б. н., начальник лаборатории фармакологии Испытательного центра экспер-
Инструментальные методы
тарная кислота», «Йопромид») наиболее целесообразно применение высокочувствительных фотометрических кинетических методов. В опытах гель-тромб теста образцы данных лекарственных средств сложно оценивать в связи с небольшой кратностью разведения (небольшого значения максимально допустимого разведения) основных растворов и влиянием мешающих факторов.
Значительная экономия материальных ресурсов и трудозатрат наблюдается при использовании инструментальных методов на производстве или при одновременной оценке большого числа образцов одного и того же наименования.
В случаях, когда необходимо определение количественного содержания БЭ, преимущество однозначно на стороне инструментальных методов. Согласно современным требованиям к фиксированию и учёту результатов будущее за фотометрическими методами.
6. Dawson M. E. A Wealth of Options Choosing an LAL Test Method. LALUpdate 1995; 13: 3: 6.
7. Joiner T. J., Kraus P.F., Kupies T.C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products.International Journal of Pharmaceutical Compounding.2002; 6: 6: 408—409.
8. Timothy J. Joiner, Paul F. Kraus, Thomas C. Kupiec, PhD «Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products», International Journal of Pharmaceutical Compounding, Vol. 6 No. 6 November/December 2002, р.408—409.
9. Barnard Health Care [Электронныйресурс] Режимдоступа: https://www.barnardhealth.us/limulus-amebocyte/overview-of-promi-nent-lal-tests.html — Overview Of Prominent LAL Tests — (Датаобра-щения: 23.02.2017).
10. Berzofsky R. N. Endotoxin detection in pharmaceuticals and medical devices with kinetic-QCL, a kinetic-quantitative chromogenic limulus amebocyte lysate assay. ALTEX 1995; 12 (2): 93—97.
11. Williams K.L. Endotoxins Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation third Edition, 2007.
12. Bacterial endotoxins — Test methodologies, routine monitoring, and alternatives to batch testing, Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI), 2002/R2010.
тизы качества ЛС, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва Сапожникова Галина Алексеевна — ведущий эксперт лаборатории фармакологии Испытательного центра экспертизы качества ЛС, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Инкубирующий прибор (термоблок)
Вертикальный фотометр для микропланшет с перемешиванием и подогревом
Возможность определения БЭ в любом растворе
Сложно оценивать мутные, вязкие, цветные растворы и растворы, образующие пену
Подвержен влиянию мешающих факторов
Высокая чувствительность позволяет увеличить кратность разведения и уменьшить влияние мешающих факторов
Количество, анализируемых образцов зависит от возможности инкубационного прибора (бани или термоблока)
На одном микропланшете можно оценить качество около 20 образцов
Не предусмотрено, только визуальная оценка результатов
Автоматический учёт; результаты фиксируются и архивируются с помощью компьютерной программы
