Методы идентификации и количественного анализа микропластиков в пищевых продуктах Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Для корреспонденции

Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой

токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий

ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва,

Устьинский проезд, д.2/14

Телефон: (495) 698-53-71

E-mail: [email protected]

https://orcid.org/0000-0002-3671-6508

Гмошинский И.В.1, Шипелин В.А.1 3, Колобанов А.И.1, Соколов И.Е.1, Маисая К.З.1, Хотимченко С.А.1, 4

Методы идентификации и количественного анализа микропластиков в пищевых продуктах

Федеральное государственное бюджетное учреждение Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский экономический университет имени Г.В. Плеханова», 115093, г. Москва, Российская Федерация

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы», 117198, г. Москва, Российская Федерация

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation

Russian University of Economics named after G.V. Plekhanov, 115093, Moscow, Russian Federation

Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba, 117198, Moscow, Russian Federation

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation

Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках программы поисковых научных исследований (тема Минобрнауки России № FGMF-2023-0005). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Хотимченко С.А.; сбор данных - Колобанов А.И., Соколов И.Е., Маисая КЗ.; написание текста - Гмошинский И.В.; редактирование - Шипелин В.А.; утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.

Для цитирования: Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Колобанов А.И., Соколов И.Е., Маисая КЗ., Хотимченко С.А. Методы идентификации и количественного анализа микропластиков в пищевых продуктах // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 87-102. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-87-102

Статья поступила в редакцию 26.06.2023. Принята в печать 26.09.2023.

Funding. The research was carried out at the expense of a subsidy for the fulfillment of the state task within the framework of the program of exploratory scientific research (topic of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation No. FGMF-2023-0005). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Contribution. The concept and design of the study - Khotimchenko S.A.; data collection - Kolobanov A.I., Sokolov I.E., Maisaya K.Z.; writing the text - Gmoshinski I.V.; editing - Shipelin V.A., approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.

For citation: Gmoshinski I.V., Shipelin V.A., Kolobanov A.I., Sokolov I.E., Maisaya K.Z., Khotimchenko S.A. Methods for the identification and quantification of microplastics in foods (a review). Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 87-102. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-87-102 (in Russian) Received 26.06.2023. Accepted 26.09.2023.

Methods for the identification and quantification of microplastics in foods (a review)

Gmoshinski I.V.1, Shipelin V.A.1-3, Kolobanov A.I.1, Sokolov I.E.1, Maisaya K.Z.1, Khotimchenko S.A.1, 4

2

3

4

2

3

4

Неблагоприятное воздействие микропластика (МП), содержащегося в пищевых продуктах, на организм недавно было идентифицировано как новый источник рисков для здоровья человека. Для оценки и минимизации этих рисков необходимо определение величины экспозиции с помощью чувствительных и специфичных методов.

Цель работы - обоснование методических подходов к идентификации и количественному определению МП в пищевой продукции на основе анализа данных литературы.

Материал и методы. Отбор литературы проводили с использованием международной реферативной базы PubMedс2014 по 2023 г. по ключевым словам, соответствующим контексту темы исследования. Всего отобрано 159 источников, из них в обзор включены 94 оригинальные и обзорные работы по критериям их релевантности рассматриваемой проблеме, научной достоверности и полноты. Результаты. В настоящее время предложены разнообразные подходы, позволяющие выделять МП из сложных биоорганических матриксов (таких, например, как морепродукты), классифицировать их по химическому составу и количественно оценивать содержание через массу или число частиц. Среди наиболее разработанных физико-химических методов анализа МП представлены инфракрасная спектрометрия с преобразованием Фурье и рамановская микроспектрометрия, пиролизная газовая хроматография - масс-спектрометрия, термогравиметрический анализ, а также подходы, основанные на жидкостной хроматографии, микрофлуориметрии, аналитической сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии и др. Нерешенные проблемы в области исследований МП в пищевых продуктах включают большую трудоемкость и низкую производительность применяемых технологий идентификации, отсутствие референтных и стандартных образцов МП, сложность приме -няемого оборудования, что затрудняет его использование в целях рутинного гигиенического контроля. Недостаточно изучен вопрос о влиянии степени старения МП на результаты его качественного и количественного определения. Известные надежды в области разработки экспресс-анализа МП возлагаются на использование аптамеров.

Заключение. Современные аналитические методы позволяют определять содержание МП в объектах окружающей среды, однако требуется дальнейшее совершенствование и валидация этих методов применительно к оценке содержания МП в пищевой продукции различных видов.

Ключевые слова:микропластики; пищевая продукция; выявление; количественный анализ; инфракрасная спектрометрия; Раман-эффект; хроматография; электронная микроскопия; апта-меры

The adverse effects of microplastics (MP) found in food on the health have recently been recognized as a new source of human health risks. In order to evaluate and minimize them, it is necessary to evaluate the exposure using sensitive and specific methods. The aim of the research was the substantiation of methodological approaches to the identification and quantification of microplastics in food based on the analysis of literature data.

Material and methods. Literature selection was carried out using the PubMed international reference database for the period from 2014 to 2023 using keywords corresponding to the context of the research theme. A total of 159 sources were selected, of which 94 original and review papers were included in the review according to the criteria of their relevance to the problem under consideration, scientific reliability and completeness. Results. At present, various approaches have been developed that make it possible to isolate MPs from complex bioorganic matrices (such as, for example, seafood), classify them by chemical composition, and quantify their content through the mass or number of particles. Among the most developed physic-chemical methods for the analysis of MPs are Fourier transform IR spectrometry and Raman microspectrometry, pyrolysis gas chromatography - mass spectrometry, thermogravimetric analysis, as well as approaches based on liquid chromatography, microfluorimetry, analytical scanning and transmission electron microscopy and others. Unsolved problems in the field of MP research in food include the high laboriousness and low performance of the identification technologies used, the lack of reference and standard samples of MP, the complexity of the equipment used, which makes it difficult to use it for routine hygienic control. The issue of the influence of MP aging degree on the results of its qualitative and quantitative determination has not been sufficiently studied. Some hopes in the field of development of rapid analysis of MTs are pinned on the use of aptamers.

Conclusion. Existing analytical methods make it possible to determine the content of MPs in environmental objects, but further improvement and validation of these methods is required in relation to the assessment of the content of MPs in various types of food. Keywords: microplastics; food; detection; quantitative analysis; IR spectrometry; Raman effect; chromatography; electron microscopy; aptamers

Воздействие микропластика (МП), содержащегося в пищевых продуктах, на человека рассматривается в настоящее время как серьезная проблема гигиены питания [1]. По состоянию на 2023 г. в реферативной базе данных PubMed зарегистрировано в общей сложности более 12 000 публикаций, определяемых по ключевым словам (microplastic* OR nanoplastic*) (рис. 1), из них 99% датируются последним десятилетием (2014-2023 гг.).

Общепризнано, что главной причиной глобального загрязнения окружающей среды МП и нанопластиками (НП) является ненадлежащая утилизация бытовых пластиковых отходов [2].

МП и НП, содержащиеся в пищевой продукции, были идентифицированы как источник риска для здоровья человека на основе данных токсикологических экспериментов на in vitro и in vivo моделях [3, 4], свидетельствующих о различиях в общетоксическом, имму-нотоксическом действии, репродуктивной токсичности в зависимости от состава и размера пластиковых частиц. Мелкие частицы МП, особенно НП, способны преодолевать эпителиальный барьер кишки и могут быть выявлены в крови и моче здоровых людей. Имеется ограниченный набор клинических наблюдений о патогенетической связи МП с воспалительными заболеваниями толстой кишки. МП могут выступать в роли векторов тяжелых металлов, полициклических ароматических углеводородов, хлорорганических пестицидов, фталатов [5], способствующих их поступлению в организм. В составе биопленок на поверхности МП возможна персистенция патогенных микроорганизмов и горизонтальная (межвидовая) передача микробных факторов вирулентности и антибиотикоустойчивости [6].

МП и НП повсеместно обнаруживаются в воде морей, океанов и пресноводных водоемов, атмосферном воздухе, организмах гидробионтов-фильтраторов. Сообщается об обнаружении МП в таких видах пищевой продукции, как рыба, нерыбные продукты промысла, столовая соль, мед, напитки (пиво, вино, чай), питьевая вода [1]. Источником этих МП может быть как окружающая среда, так и миграция фрагментов пластиковых упаковочных материалов и укупорочных средств.

Согласно принятой классификации, пластиковые частицы и волокна размером в диапазоне от 1 мкм до 5 мм и <1 мкм определяются, соответственно, как МП и НП [2]. В зависимости от источника происхождения выделяют первичные МП, добавляемые в определенные виды продукции (косметика, чистящие средства) и вторичные МП, образующиеся при фрагментации более крупных пластиковых отходов [7].

МП, обнаруживаемые в объектах окружающей среды, имеют разнообразную морфологию, представляя собой волокна, филаменты, частицы сферической и неправильной формы, пленки и образования неопределенной структуры [8]. Они могут быть бесцветными или окрашенными в синий, красный, зеленый, розовый, черный цвета [1]. По химическому составу МП, обнаруженные в окружающей среде, соответствуют ассортименту полимеров, массово производимых промышленностью.

Á

Год / Year

Рис. 1. Наукометрический тренд (число публикаций), посвященных проблеме микро- и нанопластиков (итоги за 2023 г. не подведены)

Fig. 1. Scientometric trend (number of publications) devoted to the problem of micro- and nanoplastics (the results for 2023 have not been summed up)

По данным анализа 201 пищевого продукта, наиболее типично присутствие МП, образованных полиэфирами [полиэтилентерефталат (ПЭТ) и др.], полипропиленом (ПП), поливинилхлоридом (ПВХ), полистиролом (ПС), фторопластами, полиамидами (ПА), полиэтиленом (ПЭ), сополимером стирол-акрилонитрила, поли-н-бутилмета-крилатом [9].

Создание надежных, высокочувствительных и, по возможности, универсальных методов идентификации и количественного определения МП представляется ключом к решению проблемы их контроля и гигиенического нормирования [10]. В связи с этим предметом настоящего обзора являются методы анализа МП и НП в объектах окружающей среды и пищевой продукции.

Цель работы - обоснование методических подходов к идентификации и количественному определению МП в пищевой продукции на основе анализа данных литературы.

Отбор литературы проводили с использованием международной реферативной базы PubMed с 2014 по 2023 г. по ключевым словам, соответствующим контексту темы исследования. Всего отобрано 159 источников, из них в обзор включены 94 оригинальные и обзорные работы по критериям их релевантности рассматриваемой проблеме, научной достоверности и полноты.

Методы выделения микро- и нанопластиков из сырья и пищевой продукции

Оценка содержания МП в пищевых продуктах затруднена его низким удельным содержанием и трудностью выделения из ряда природных матриц. Разра-

ботка протоколов концентрирования и изоляции МП для целей анализа требует учета особенностей как МП, так и природного матрикса, в который они включены. Хотя для выделения МП из гомогенных чистых водных растворов (например, МП в морской соли, растворенной в воде) требуется всего несколько простых операций, некоторые другие пищевые матрицы содержат большое количество биополимеров, которые трудно отделить от синтетических пластиковых частиц. Примером этого могут служить такие объекты, как водоросли, морские беспозвоночные, мясо, рыба, овощи [4].

Фильтрация

Лидирующим по производительности и эффективности методом выделения МП из жидких продуктов является фильтрация. При невысоком содержании растворенных органических веществ их разложение при этом может не потребоваться. Так, определение содержания МП в пиве привело к близким результатам как при использовании раствора для разложения, так и без него [11].

Качество и степень полноты выделения МП из пищевых продуктов зависят от размера пор фильтрующего материала. МП в белом вине, собранном в разных регионах Италии, были отфильтрованы с помощью мембран 0,7 и 0,1 мкм, и конечная концентрация составила соответственно 31 и 182 частицы/л [12]. Определенное в пиве содержание МП было выше при использовании мембран 0,8 мкм (64 частицы/л) [13], чем мембран 11 мкм (4,05 частицы/л) [14]. Количество МП, отфильтрованных мембранами <5 мкм, было значительно выше, чем количество МП размером >5 мкм (p<0,05) во всех образцах двустворчатых моллюсков [1].

После выделения МП на мембранном фильтре его необходимо собрать для исследования, что может быть не просто. Затруднения вызывает возможная адгезия МП к материалу фильтра; при сопоставимости размеров частиц МП с порами фильтра часть МП может оставаться в них, задерживаясь механически. В качестве способа исследования МП был предложен вариант проведения измерений непосредственно на фильтре. В последнем случае большое значение имеет выбор материала фильтра. Так, по данным M.G.J. Loder и соавт. [15], поликарбонатные мембраны, фильтры на основе эфиров целлюлозы, фильтры из стекловолокна дают низкое качество результатов анализа МП методом инфракрасной (ИК) спектрометрии (см. ниже) из-за помех, вызванных поглощением ИК-излучения материалом фильтров. Значительное улучшение результата было достигнуто путем использования фильтров из оксида алюминия.

В работе [16] выделение МП из бутилированной минеральной воды проводили на полимерных фильтрах, покрытых слоем алюминия, после чего изучали содержание МП непосредственно на фильтре. Для концентрирования МП, содержащихся в растворах столовой морской соли, M.E. Iniguez и соавт. применили фильтры

из нитрата целлюлозы [17]. А. Карр!ег и соавт. [18] предложили кремниевую (в1) фильтрующую подложку с диаметром пор 10 мкм, полученную методом фотолитографического микроструктурирования, которая гарантирует прозрачность для широкой средней ИК-области 4000-600 см-1. J.C. Рга1а и соавт. [12] проводили фильтрацию виноградных вин через стеклянный фильтр с размером пор 0,7 мкм или фильтр из оксида алюминия с размером пор 0,1 мкм.

При выделении МП, имеющих большой разброс по размеру частиц, из сложных биологических матриксов, таких как мидии, могут применяться подходы, связанные с каскадной фильтрацией через фильтры различной пористости. Так, в работе [19] образец после разложения биологического матрикса пропускали через сетку из нержавеющей стали с размером ячеек 50 мкм и затем через фильтр из оксида алюминия АпосЛвс® с диаметром пор 0,2 мкм.

Фракционирование по плотности

Принцип метода разделения по плотности состоит в том, что МП всплывают благодаря силе Архимеда в растворе солей, имеющем большую плотность, чем сам МП, и, напротив, седиментируют в среде органических растворителей с низкой плотностью. Первое действие позволяет отделить МП от минеральных частиц, таких как силикаты, диоксид титана, стекло, костные остатки [1], второе позволяет сконцентрировать МП в малом объеме. Например, в растворах хлорида натрия (ЫаС!) различной концентрации (1,00-1,20 г/см3) всплывают МП ПП и ПА, имеющие плотность 0,801,13 г/см3. Наиболее удобен такой подход при выделении МП из столовой соли, когда сам матрикс образца при его растворении в воде служит средством фракционирования [17]. Однако выделение МП, состоящих из ПВХ и ПЭТ с плотностью ~1,40 г/см3, при этом могло быть затруднительным. В этих случаях может быть использован раствор йодида натрия (плотность до 1,8 г/см3), хотя он дороже, химически более агрессивен и токсичен, чем ЫаС! [1]. Возможно использование в качестве фракционирующей среды раствора поливольфрамата натрия [20] с плотностью 1,8 г/см3, что сдерживается высокой ценой данного реактива. Наилучшие результаты при фракционировании МП в широком интервале их плотностей были достигнуты с использованием хлорида цинка ^пС!2), имеющего растворимость до 79% в воде и дающего растворы с плотностью до 1,96 г/см3 [21].

Для выделения первичных МП ПЭ из средств личной гигиены их диспергировали в делительной воронке в растворе ЫаС! плотностью 1,01 г/см3 или диоксане (плотность 1,03 г/см3), добавляли 3-метил-4-бутанол для подавления пены, сливали суспензию осадка и средний жидкий слой, после чего добавляли ацетон, в котором МП седиментировали и могли быть собраны в носике делительной воронки [22].

При использовании для выделения МП органических жидкостей необходимо учитывать растворимость в них

некоторых МП, например ПС в ацетоне и диоксане, что может привести к потерям аналита. Данные для выделения и фракционирования МП по плотности приведены на рис. 2.

Использование гидрофобных взаимодействий

Поверхность большинства МП гидрофобна, что создает условия для их концентрирования в пенах, образованных водными растворами поверхностно-активных веществ за счет сил капиллярности, что известно как процесс пенной флотации [3]. Определенные перспективы представляет комбинирование принципа флотации, основанного на гидрофобном взаимодействии, с магнитной сепарацией. Так, в работе [23] наноча-стицам железа придавали гидрофобные свойства путем их обработки алкилсиланом, после чего происходила их адгезия к МП, который затем мог быть собран на поверхности жидкости с помощью магнита, чем достигалось количественное извлечение различных МП с размером от 10 мкм до 1 мм.

Для выделения НП была предложена основанная на гидрофобном взаимодействии экстракция в точке помутнения. С применением реагента на основе поверхностно активного вещества Triton х-45 достигнуто 500-кратное обогащение для НП ПС (размером примерно 65 нм) и полиметилметакрилата (ПММА) (85 нм) без изменения их морфологии и размера [24].

Визуальное фракционирование и отбор

Спектральной или химической идентификации МП обычно предшествует их ручной разбор на фильтрах по морфологическим признакам [20, 25]. Наименьший размер МП, подлежащих фракционированию при наблюдении невооруженным глазом, составляет, по-види-мому, около 1 мм [26]. Частицы в интервале 0,05-0,5 мм могут быть с успехом разобраны с использованием бинокулярного или оптического микроскопа [1]. Однако для МП меньшего размера и тем более НП данный подход, по-видимому, неприменим, не только из-за «ненаблюдаемости» очень мелких (субмикронных) частиц на светооптическом уровне, но и из-за помех со стороны электризации частиц [25]. Следует учесть также большую субъективность метода визуального отбора [4].

Деструкция биологического матрикса

Разложение органического матрикса является обязательной стадией выделения МП из плотных пищевых продуктов животного и растительного происхождения, включая гидробионты, овощи и фрукты, мясные изделия, молоко. При этом должна осуществляться количественная деструкция биополимеров до водорастворимых мономеров [4]. Важно, чтобы при применении таких реагентов одновременно не происходило растворения самих МП или существенного изменения свойств их поверхности [1]. Сообщается об использовании при выделении МП кислот: азотной, хлорной [27] и их смеси [28]; щелочей: КОН [27], NaOH [29]; перекиси

1,6 1,5 1,4 1,3

со §1,2

с^ 1,1

s

о

1

"О

0,9 0,8 0,7 0,6

ZnCI2 5 моль/л ZnCI2 5 moll!

ПА (капрон) РА

Этилацетат

, / k пвх

t / ПЭТ PVC PET

Ethyl acetate РР

Ацетонитрил

Acetonitrile

\

NaCI насыщ. NaCI saturated

\ Ацетон Acetone

ПЭ ВД, в среднем / РЕ HD, avg. ^ ПЭ НД, в среднем / РЕ LD, avg. \ Метанол / Methanol Этанол / Ethanol

Рис. 2. Принцип фракционирования микропластиков в растворах солей и органических растворителях с различной плотностью

ПА - полиамид; ПК - поликарбонат; ПВХ - поливинилхлорид; ПП - полипропилен; ПС - полистирол; ПЭ ВД - полиэтилен высокого давления; ПЭ НД - полиэтилен низкого давления; ПЭТ - полиэтилентерефталат.

Fig. 2. The principle of microplastic fractionation in salt solutions and organic solvents with different densities

PA - polyamide; PC - polycarbonate; PP - polypropylene; PE HD -high-pressure polyethylene; PE LD - low-pressure polyethylene; PET - polyethylene terephthalate; PS - polystyrene; PVC - polyvinyl chloride.

водорода [27] и ее комбинации с азотной кислотой [30]; реактива Фентона [смеси Н202 с солями Ре(И)] [31], а также последовательной обработки этими реагентами в различных комбинациях [32]. Использование химического гидролиза имеет преимущества в виде невысокой стоимости реагентов, простоты и воспроизводимости и вместе с тем может вызывать изменение цвета, химическую модификацию и даже полное разрушение МП, состоящих из полиэфиров и полиамидов [33], образование обильной пены, затрудняющей работу [34].

Ферментативное расщепление с использованием цел-люлаз [35], липаз [36], протеаз микробного происхождения (в частности протеиназы К) [37] проводится при невысоких температурах, в отсутствие корродирующих агентов и окислителей, что в наибольшей степени способствует сохранности МП. Недостатком этого метода является высокая стоимость ферментов и в ряде случаев недостаточная эффективность (например, при разложении костной и соединительной ткани), что может приводить к плохой воспроизводимости результата. Компромиссом в этом вопросе является комбинирование методов ферментативного гидролиза с кислотной и щелочной деструкцией [4].

Особенности выделения нанопластиков

Для НП значительная часть приведенных выше методов выделения может быть непригодной из-за малого размера частиц, повышенной растворимости в кислотах и щелочах, потерь из-за адсорбции.

Принцип каскадной мембранной фильтрации НП основан на использовании фильтров с последовательно уменьшающимся размером пор, что может предотвратить засорение наиболее мелкопористых фильтров крупными частицами [38]. Кроме того, при выделении и концентрировании НП были использованы ультрафильтрация [39], ультрацентрифугирование [40] и выпаривание растворителя [41], т.е. подходы, хорошо зарекомендовавшие себя в аналитических исследованиях наночастиц искусственного происхождения, а также рассмотренный выше метод экстракции при точке помутнения [24]. Если информация о количестве и размере частиц не требуется и необходимо определить только массу полимера, то может применяться экстракция органическими жидкостями, растворяющими определенный полимер [42], кислотный или щелочной гидролиз полимеров, включая ПА, ПЭТ и ПК [43].

В качестве перспективного метода выделения НП рассматривается проточное полевое фракционирование, которое использует эффект перпендикулярной силы, воздействующей на частицы в потоке. В зависимости от коэффициента диффузии, определяемого такими характеристиками, как размер, форма и плотность, частицы удерживаются в канале прибора в течение разного времени и могут быть разделены [44].

Гидродинамическая хроматография, основанная на различии в подвижности частиц разного размера в ламинарном потоке жидкости, была использована для фракционирования НП ПС (200-900 нм) и полиакрилата (60-80 нм) [45]. Практическая применимость метода, однако, зависит от недостаточно изученного вопроса о взаимодействии частиц НП, имеющих различный рельеф поверхности (шероховатость), с неподвижной фазой колонки.

В работе А. Уа!8е81а и соавт. [46] для выделения НП было применено сочетание ферментативного расщепления биологического матрикса, ультрафильтрации и улавливания частиц на подложке, образованной массивом полостей с определенными субмикрометровыми глубиной и диаметром. Подобная структура была создана на кремниевых чипах с помощью сканирующего электронного микроскопа, оснащенного фокальным ионным пучком. После накопления НП на подложке, движущей силой чего являлись капиллярные взаимодействия, анализ НП в полостях осуществляли с помощью рамановской микроспектрометрии.

Методы идентификации, качественного и количественного анализа микро- и нанопластиков

Световая микроскопия

Световая микроскопия МП с целью их идентификации, характеристики и подсчета числа частиц осуществля-

ется, как правило, непосредственно на фильтрах, на которых происходило осаждение частиц [4]. При этом используется как вариант микроскопии в отраженном свете, так и темнопольной флюоресцентной микроскопии, требующей дополнительного окрашивания. Теоретически предел обнаружения МП по их размеру должен составлять порядка 0,5 мкм, что соответствует дифракционному пределу волн видимого света, однако на практике бывает трудно идентифицировать МП размером менее 100 мкм по их морфологическим признакам [3]. При световой микроскопии можно оценить форму МП (частицы, филаменты, волокна, пены, пленки, образования неправильной формы), размер (в случае волокон - длину и диаметр), цвет, прозрачность, рельеф поверхности (шероховатость), что позволяет иногда идентифицировать МП [1, 20, 25]. Подсчитав число и размер частиц МП в образце и задаваясь величиной его плотности, можно оценить его массовое содержание [3, 25]. Имеются исследования, в которых микроскопическая идентификация МП была использована в качестве единственного аналитического метода [47]. Однако частота ошибок при идентификации МП методом световой микроскопии обычно превышает 20% [3] и может доходить до 70% [48], вследствие как пропуска частиц по причине невнимательности оператора, так и ошибочного отождествления [49]. По данным R. Lenz и соавт. [50], только для 64% частиц и 75% волокон, идентифицированных при световой микроскопии как МП, это было впоследствии подтверждено с помощью рамановской микроспектрометрии. Было показано, что частота ошибок субъективной визуальной идентификации по сравнению с пиролизной газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией или рамановской микроспектрометрией составляет соответственно 53 и 32% [20]. Ввиду этого в настоящее время светооптическую микроскопию используют в основном как подготовительную стадию для анализа МП более специфичными методами колебательной спектрометрии или химического анализа [2].

Значительно повысить точность анализа МП можно путем их окрашивания специфическими, так называемыми сольватохромными красителями, изменяющими максимум своего спектра эмиссии флюоресценции в разном химическом окружении [51]. Первая работа такого рода была выполнена A.L. Andrady и соавт. в 2011 г. (цит. по [3]) с красителем нильским красным (Nile red, NR). Были также предложены для детекции МП некоторые другие красители (масляный красный EGN, эозин B, бенгальская роза, желтый хостасол 3G) [21]. Окрашивание при помощи NR не только позволяет различать МП с точностью до типа их химического состава (поли-олефины, полиароматические, полиэфиры/полиамиды), но и служит индикатором старения МП и образования биопленок [21].

Оптимальная концентрация NR при окрашивании образцов МП в водной суспензии или непосредственно на фильтре составляет порядка 0,01 мг/см3; время обработки - не более 30-60 мин. Ввиду практически

полной нерастворимости NR в воде, его вносят в виде маточного раствора в диметилсульфоксиде или другом амфифильном растворителе. Нижний предел детекции по размеру частиц составляет порядка 100 мкм [21]. При использовании обычной флюоресцентной микроскопии спектр эмиссии NR, связанного с МП, мог быть приближенно оценен так называемым индексом флюоресценции, рассчитываемым в программе ImageJ как отношение суммы «красных» и «зеленых» пикселей к числу «красных» в выделенной области.

Как показали T. Maes и соавт. [21], наблюдается достоверная положительная корреляция между этим показателем и величиной краевого угла смачивания, характеризующего гидрофобность полимера. По мнению авторов, этого достаточно для предварительной химической идентификации МП и его дифференцирования от частиц естественного происхождения, таких как панцири микроводорослей, целлюлоза, хитин и кварц. Однако метод не был в достаточной степени валидирован.

Красители NR и пирен применяли для обнаружения МП ПС на поверхности кристаллов морской соли, кремнезема и кварца [52]. Оба зонда демонстрировали флюоресценцию на кремнеземе и кварце, тогда как на NaCl отмечалось сильное гашение флюоресценции. При связывании с МП ПС максимум спектра NR смещался в коротковолновую область по сравнению с флюоресценцией несвязанного красителя, а отношение полос I1/I3 флюоресценции пирена уменьшалось.

На величину окрашивания МП может повлиять степень их старения и наличие на их поверхности адсорбционных слоев и бактериальных биопленок. Тем не менее микрофлуориметрия с NR может рассматриваться как простой недорогой метод скрининга и полуколичественной оценки содержания МП в объектах окружающей среды и пищевой продукции. Значительного улучшения характеристик метода можно предположительно достичь с использованием флюоресцентной лазерной конфокальной микроскопии.

Электронная микроскопия

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) позволяет изучать размер, форму, рельеф поверхности МП [53]. На практике для определения химического состава МП SEM сочетают с энергодисперсионной рентгеновской спектрометрией (EDx) [3] или фотоэлектронной рентгеновской спектрометрией (XPS) [4]. По сравнению с оптической микроскопией SEM лучше дифференцирует МП от частиц природного происхождения из-за более высокого увеличения и более четкого изображения [53]. Практическое разрешение SEM может достигать 0,1 мкм, что пригодно для исследования не только МП, но, в некоторой степени, и НП [40, 54]. Сообщается об успешной оценке с помощью SEM степени выветривания МП [55], их биодеградации [56] и микробной колонизации [2].

Примером использования SEM при анализе МП в пищевой продукции является исследование миграции МП из полиамидных (капроновых) пакетиков для

заварки чая [57]. МП анализировали после их осаждения на кремниевых подложках с помощью SEM (при увеличении от 1:1000 до 1:100 000) и XPS. Было показано, что 1 пакетик может выделять на чашку до 1,2х107 частиц МП размером более 1 мкм и до 3х106 частиц НП размером менее 1 мкм, причем по составу эти частицы были охарактеризованы как ПА.

Особенностью стандартной SEM является ее проведение в глубоком вакууме (давление 10-4 Па и ниже), а также то, что изучаемый образец должен быть безводным. Легкоплавкие и термически лабильные МП (например, ПВХ) могут расплавляться или сжигаться электронными пучками [2]. Кроме того, оптимальные результаты SEM достигаются на токопроводящих образцах, тогда как подавляющее большинство МП являются изоляторами. Поэтому для улучшения качества SEM-изображений может потребоваться напыление на поверхность образца металлов (Au, Al, Pt) или углерода [3]. Частично преодолеть эти трудности можно с помощью методов SEM «под переменным давлением» [51] и SEM «в окружающей среде» (Environmental SEM, или ESEM) [58].

При использовании метода SEM возможны проблемы, связанные с химической идентификацией МП. Так, в комментарии [59] на работу [57] указывается, что частицы, мигрировавшие из пакетиков для чая, могли быть в действительности не МП, а микрокристаллами мономера (s-аминокапроновой кислоты), образующегося при деполимеризации полиамидного волокна.

Вследствие указанных ограничений SEM при изучении МП часто дополняют спектральными методами [51, 53, 54].

Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM), в отличие от SEM, применялась для характеристики МП и НП в ограниченном числе работ. Например, F. Watteau и соавт. [60] применяли TEM в комбинации с EDx и пиро-лизной газовой хроматографией - масс-спектрометрией для обнаружения МП на ультратонких срезах почвы и компоста из бытовых отходов. Несмотря на большую трудоемкость TEM и ее малую разработанность применительно к природным объектам, сельскохозяйственному сырью и пищевым продуктам, этот метод имеет определенные перспективы при выявлении наиболее мелких МП и НП из-за практически полного отсутствия ограничения по минимальному размеру частиц МП. Так, J. Gigault и соавт. [61] использовали TEM в комбинации с динамическим рассеянием света для наблюдения за присутствием НП в воде в условиях его деградации под действием ультрафиолетового излучения.

Инфракрасная спектрометрия с Фурье-преобразованием

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT-IR), относящаяся к семейству методов колебательной спектроскопии, - это один из наиболее широко применяемых методов идентификации, анализа структуры и количества МП [62], в том числе в составе пищевых продуктов [63]. FT-IR относится к неразру-шающим методам; образец может быть изучен много-

кратно либо впоследствии подвергнут исследованию другими, например химическими, методами (см. ниже). При проведении РТ-!Я образец облучают полихроматическим ИК-излучением в диапазоне волновых чисел 400-4000 см-1, при этом регистрируют изменение интерференции световых волн прошедшего через вещество и контрольного (опорного) лучей в интерферометре с подвижным зеркалом (так называемый интерферометр Майкельсона). Получаемая при этом зависимость интенсивности объединенного пучка от разности хода волн 2 этих лучей представляет собой Фурье-образ объекта, который с помощью обратного преобразования Фурье может быть представлен как сумма гармонических функций, соответствующих полосам поглощения в ИК-спектре [64].

Поглощение ИК-излучения органическими молекулам обусловлено наличием колебательных квантовых переходов, зависящих от дипольного момента химических связей [64]. При этом если в области приблизительно 4000-2500 см-1 располагаются полосы поглощения простых (валентных) колебаний связей С-С; С-О; С=О; С-Н; О-Н, Ы-Н [15], то более длинноволновая область 2500400 см-1 соответствует совокупности разнообразных сложных по конфигурации «крутильных», «веерных», «ножничных», «маятниковых» колебаний молекулы, что проявляется в сложном наборе пиков, представляющем характеристический «спектральный отпечаток» полимера [20]. Наиболее распространенным при анализе МП аппаратурным оформлением метода является РТ-!Я-микроспектрометрия, при которой РТ-!Я-спектрометр интегрирован с оптическим микроскопом [2]. Существуют 3 основных режима РТ-!Я: зеркальное отражение, пропускание и нарушенное полное внутреннее отражение (НПВО)1.

Режим отражения обычно используется для анализа относительно крупных, толстых, непрозрачных единичных частиц МП. При этом могут возникать проблемы, такие как слабый сигнал, высокий уровень шума, плохое совпадение с базами данных стандартных образцов и низкая точность [3].

Режим пропускания обладает высокой чувствительностью, для него менее важен размер частиц МП, и он позволяет получать спектры высокого качества. Однако при толщине МП менее 5 мкм точность метода снижается [64].

Режим НПВО реализуется путем приведения частицы МП в контакт с зондом из ИК-прозрачного материала с высоким показателем преломления (например, алмаза, германия). Из-за эффекта НПВО часть ИК-сиг-нала, многократно отраженного на межфазной границе зонд-МП, теряется в степени, зависящей от длины волны излучения. Данный режим отличается наилучшим качеством получаемых спектров и минимальным количеством помех от примесей в изучаемом образце. Однако он применим только к МП, допускающим точное

индивидуальное плотное подведение к ним НПВО-зонда, и требует наибольшего времени для снятия спектра [2].

Основным ограничением метода РТ-!Я является наличие помех со стороны даже следовых количеств воды в образце, поскольку очень интенсивные и широкие полосы колебаний О-Н связей в ее молекуле способны перекрыть большую часть нужного для анализа спектра [26] в области простых (валентных) колебаний. С помощью РТ-!Я трудно анализировать непрозрачные или черные МП [65]. Наконец, по сравнению с конкурирующими методами (визуальная сортировка, темнопольная флюоресцентная микроскопия, рамановская микроспектрометрия; см. ниже) снятие спектра РТ-!Я для каждой индивидуальной частицы требует в 8-10 раз большего времени. РТ-!Я в режиме НПВО частично лишен этих недостатков, но он обычно используется для МП размером >500 мкм и, по-видимому, совершенно не подходит для идентификации МП размером <20 мкм [26]. Наконец, поскольку РТ-!Я в режиме НПВО исследует только тонкий приповерхностный слой образца, метод очень чувствителен к поверхностному старению МП и образованию на нем адсорбционных слоев и биопленок [3].

В большинстве работ РТ-!Я выполняют непосредственно на фильтрах, на которых проводилось осаждение МП из изучаемого образца. При проведении исследования в режиме отражения или НПВО материал фильтра (подложки) не имеет принципиального значения, если прибор точно фокусируется на выбранном МП. Однако возможно наличие помех со стороны ИК-спектра материала подложки, если частица МП слишком мала. В этом случае выходом из положения может быть использование фильтров с напыленным токопрово-дящим слоем металла [66].

Теоретическое пространственное разрешение метода микроРТ-!Я индивидуальных МП в вариантах пропускания и отражения ограничено дифракционным пределом световых ИК-волн, что составляет от 1,7 мкм при 4000 см-1 до 13 мкм при 500 см-1. Однако на практике с помощью РТ-!Я можно изучать только индивидуальные частицы диаметром не менее 10-20 мкм [64]. При снятии спектра РТ-!Я от выделенной области фильтра в режиме пропускания размер частиц не играет существенной роли (можно изучать одновременно множество мелких МП и даже НП при их достаточно большом числе на единицу площади), однако при этом: а) материал фильтра должен быть ИК-прозрачным [18] и б) должна иметься уверенность в химической гомогенности изучаемого МП [20].

Снятие спектров РТ-!Я от множества отдельных МП, осажденных на фильтре, может потребовать неприемлемо большого времени (десятки часов на 1 образец). Эти ограничения частично преодолеваются при спектрометрии РТ-!Я с так называемым матричным детектором в фокальной плоскости (РРА) [18]. Спектры при

1ATR-FT-IR в англоязычной литературе.

этом могут сниматься в режимах отражения и НПВО, однако чаще всего применяется режим пропускания, предъявляющий высокие требования к ИК-прозрачности подложки. Сообщается об использовании при этом ИК-прозрачных фильтров из кремния [20], оксида алюминия (мембраны Anodisk®) [67] или селенида цинка [68].

Дополнительным подходом к улучшению производительности FT-IR при исследовании МП на фильтрах является применение современных методов анализа больших массивов данных. Простым способом сокращения объема анализируемой информации может быть биннинг-объединение нескольких (обычно 4 или 16) измеренных пикселей детектора фокальной плоскости в один [15]. Алгоритмы поиска (Евклидово расстояние, корреляция Пирсона или классификация по числу ближайших соседей) используются для расчета индекса качества попадания (HQI) при сравнении ИК-спектра анализируемого МП с эталонными образцами [69]. Для этих целей разработаны и доступны готовые программные продукты, такие как алгоритм «Simple» [70]. Сообщается об использовании при идентификации МП технологий искусственного интеллекта типа «контролируемого обучения» [71] или «леса случайных решений» [19]. Частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (PLS-DA) и независимого моделирования классов (SIMCA) для оценки данных FT-IR в FPA был эффективен для идентификации и количественного определения МП размером <100 мкм, состоящих из 9 распространенных полимеров (ПА, ПК, ПЭ, ПЭТФ, ПММА, ПП, ПС, ПУ, ПВХ) [71]. Метод кластеризации со сверткой информации о FT-IR-спектрах образцов посредством анализа основных компонентов (PCA) и унифицированной аппроксимации и проекции многообразия (UMAP) предложен в работе L. Wander и соавт. [72].

Рамановская спектрометрия

Спектроскопия комбинационного рассеяния использует эффект неупругого взаимодействия фотонов с колебательными квантовыми уровнями молекул, при котором энергия вторичных (рассеянных) фотонов начинает несколько различаться (в большую или меньшую сторону) от исходной и в спектре излучения появляются дополнительные гармоники (полосы), являющиеся в совокупности специфическим «спектральным отпечатком» молекулы [48]. Поскольку энергия колебательных переходов обычно крайне мала по сравнению с энергией квантов рассеиваемого излучения и интенсивность дополнительных пиков также невелика, на практике для наблюдения комбинационного рассеяния (или Раман-эффекта, называемого так в честь открывшего это явление Ч.-В. Рамана) используют исключительно монохроматическое лазерное излучение (обычно в видимой области спектра, от 500 до 800 нм). Фундаментальное физическое различие между FT-IR и рамановской спектроскопией состоит в следующем: если ИК-поглощение зависит от изменения дипольного момента химической связи, то проявление Раман-эффекта обусловлено изменением поляризуе-

мости химической связи [20]. Поэтому если в первом случае наиболее интенсивные пики дают колебательные переходы полярных связей, т.е. С-О, С=О, С-Ы, О-Н, то во втором - связей С=С и ароматических ядер молекул.

В большинстве современных работ МП изучают с помощью микрорамановских спектрометров, интегрированных со светооптическим или конфокальным микроскопом, что позволяет подвести лазерный луч к каждой частице и снять ее спектр [25]. Типичный рамановский микроскоп оснащается 2 лазерами с длинами волн 785 нм (темно-красный) и 532 нм (зеленый) и дает оптическое увеличение в пределах х100-1000. Для более надежной идентификации МП его спектр снимают дважды при облучении обоими лазерами. Также сообщается о применении в рамановской микроспектрометрии лазеров с длиной волны 442, 455, 514,5 и 633 нм [2].

Рамановская спектрометрия имеет ряд преимуществ, из которых главным по сравнению с РТ-!Я является малый размер анализируемых частиц. Пространственное разрешение рамановского спектрометра составляет порядка 1 мкм, так как возбуждающий лазерный свет находится в видимой области. Поэтому раманов-ская спектроскопия легко используется для идентификации МП с размером частиц менее 20 мкм [64]. Имеются даже данные об успешном анализе индивидуальных частиц НП диаметром 500 нм [73]. Рама-новская спектрометрия характеризуется по сравнению с РТ-!Я более широким спектральным диапазоном (4000-40 см-1), меньшим уровнем сигнал/шум и наличием более узких спектральных полос и позволяет надежно идентифицировать ряд полимеров, дающих слабый или неспецифический отклик при РТ-!Я [20, 64]. Образцы для анализа рамановской спектроскопией не требуется глубоко обезвоживать перед исследованием ввиду сравнительно низкой чувствительности спектров к помехам со стороны ОН-групп воды.

Однако рамановская спектроскопия МП также имеет некоторые ограничения. Во-первых, использование метода исключается для образцов, обладающих флюоресценцией в видимой области, поскольку широкие полосы эмиссии флюоресценции способны полностью перекрыть и заглушить слабые линии рамановских спектров [64, 74]. Кроме того, рамановские спектры, создаваемые добавками в МП и адсорбированными примесями, могут перекрываться со спектрами самих полимеров, что мешает их идентификации [16]. Время снятия одного рамановского спектра относительно велико, поскольку может потребовать предварительного ручного выбора МП и его визуализации. На практике это приводит к тому, что анализу подвергают очень небольшую часть образца (<1% поверхности фильтра) [75], что связано с большой ошибкой при экстраполяции на остальную часть пробы [2]. Следует также учитывать, что мощный лазерный луч, сфокусированный на МП, может вызвать его нагрев, деформацию, плавление, фотодеградацию или термодеструкцию, что не позволяет считать метод в полном смысле неразрушающим [48, 64, 74].

Ввиду различных ограничений рамановской микроспектрометрии и РТ-!Я продуктивным является их комбинирование в 1 исследовании, когда первый метод применяется для анализа самой мелкой фракции пластиковых частиц (после их разделения на фильтрах), а второй, как правило, в варианте АТР-РТ-!Я, для изучения МП субмиллиметрового размера [20]. Была предложена также комбинация рамановской микроспектрометрии с химическим анализом пиролизной хроматографией - масс-спектрометрией, когда предварительная рамановская идентификация МП облегчала последующий анализ масс-спектров его пиролизных фрагментов [25].

Пиролизная газовая хроматография -масс-спектрометрия

Пиролизно-газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (Ру^С/МБ) является физико-химическим методом определения состава МП, состоящим в анализе летучих продуктов, образующихся при быстром (термический удар) нагреве образца до высокой температуры в специальной пиролитической камере, заполненной инертным газом (Не или Ы2), с последующей передачей этих летучих продуктов непосредственно в газовый хроматограф с масс-спектро-метрическим детектором [2, 4, 25]. Это деструктивный метод, приводящий к полному разрушению МП, поэтому каждая из частиц может быть проанализирована только однократно.

Спектр летучих фрагментов, регистрируемый на хро-матограмме, является химическим «молекулярным отпечатком» полимера, по которому он может быть идентифицирован с применением базы данных стандартных образцов [2]. Кроме того, измеряя площадь пиков для характерных продуктов пиролиза, при наличии калибровочных проб можно определить массу полимера в составе частицы МП [65].

Для идентификации и количественного определения полимеров на основе продуктов разложения системы Ру^С/МБ обычно оснащаются квадрупольным масс-анализатором. Однако есть данные, что способность обнаружения может быть повышена с помощью время-пролетной масс-спектрометрии [74].

В классическом варианте Ру^С/МБ выполняют, помещая в чашки для анализа единичные частицы МП, которые выделяют посредством ручного разбора визуально или под микроскопом [51]. При наличии в образце мелких частиц, особенно НП, их предварительный отбор и накопление в чашке может быть выполнен с использованием проточного цитометра или клеточного сортера [76]. Сообщается также, что НП для анализа могут быть выделены из природных объектов методом экстракции в точке помутнения [24] или посредством осаждения на мембране из перфторэтилена [74] и ультрафильтрации [77].

В целях улучшения хроматографического разделения продуктов пиролиза перед их введением в хроматограф рекомендуется проведение их химической деривати-

зации, в частности с использованием гидроксида тетра-метиламмония (ТМАН), что повышает чувствительность обнаружения некоторых полимеров (например, ПЭТ и ПК) [51].

Присутствие в составе полимеров низкомолекулярных примесей, в том числе красителей, пластификаторов, остаточных количеств мономера, может осложнить идентификацию МП по хроматограмме продуктов его пиролиза. Для преодоления этой проблемы применяют технологии так называемого двойного выстрела, когда Ру^С/МБ проводят в 2 стадии: первый раз при прогреве образца до 200-300 оС, когда из него отгоняются летучие и термолабильные примеси, и второй раз при нагреве приблизительно от 550 до 700 оС, что сопровождается деструкцией основной части полимера [25, 78].

При определении типа МП важную роль играет удачный выбор реперных летучих соединений, идентифицируемых по их моль-ионам. Так, для ПЭ характеристическим является образование летучих алкенов [1-нонена, 1-децена, 1-ундецена и их высших (С12-С16) гомологов], для ПП - 2,4-диметил-1-гептена, для ПС -стирола и 3-бутен-1,3-диилдибензола (димера стирола), для ПА - капролактама (или других мономеров - циклических лактамов), для ПММА - метилметакрилата, для ПК - фенола, п-крезола, п-этилфенола, п-винилфенола, бисфенола-А и др., для ПЭТ - бензола, ацетофенона, винилбензоата, бензойной кислоты, дивинилтерефта-лата [25].

Ру^С/МБ имеет ограничение по массе образца; обычно не представляется возможным из-за перегрузки хроматографической системы изучить частицы массой более 500 мкг без их дополнительной фрагментации [2], с другой стороны, минимальная масса частицы составляет около 1 мкг, что соответствует пределу детекции (LOD) [25]. Использование Ру^С/МБ хорошо дополняет спектральные методы, то есть РТ-!Я в режиме отражения, АТЯ-РТ-НЗ и рамановскую микроспектрометрию [25]. При этом индивидуальный МП предварительно исследуют в микроскопе (микроспектрометре) РТ-!Я, рамановском светооптическом или конфокальном микроскопе, после чего переносят его чашку для Ру^С/ МБ; частица при анализе полностью разрушается. Это значительно повышает достоверность идентификации. По данным [25], совпадение результатов Ру^С/МБ и рамановской микроспектрометрии в образце МП составило 92%, причем число частиц, однозначно идентифицированных первым методом, было больше, чем вторым.

Основным недостатком Ру^С/МБ является ее низкая производительность: цикл исследования 1 МП может занимать до 30 мин, что при наличии на фильтре большого числа визуально гетерогенных МП может привести к неприемлемо большому расходу времени на проведение исследования [2].

Методы термического анализа

Термический анализ основан на изучении взаимосвязи температуры нагрева с физическими характе-

ристиками (масса, теплоемкость и др.) образца [79]. В процессе нагрева полимеры в МП переходят из твердого состояния в жидкое или газообразное, вследствие чего при определенной температуре наблюдается поглощение тепла (эндотермический пик). По его размеру и положению можно установить состав и тип МП.

Методы термического анализа МП включают дифференциальную сканирующую калориметрию [3], термогравиметрический анализ с дифференциальной сканирующей калориметрией [79], термогравиметрический анализ с РТ-!Я [80] и термоэкстракционную десорбционную газовую хроматографию - масс-спек-трометрию [81].

Для анализа дифференциальной сканирующей калориметрией первичных МП, таких как ПЭ, необходимо относительно большое количество МП, выделенного из объекта исследования (1-20 мг) [3]. На практике метод используется главным образом для количественной оценки содержания предварительно идентифицированного МП.

Принцип термогравиметрического анализа с РТ-!Я заключается в том, что образцы подвергаются пиролизу при постепенном повышении температуры с образованием газов, которые анализируются с помощью спектрометра РТ-!Я [80]; в конечном итоге это позволяет определить химический состав МП [80, 82]. Но при проведении такого варианта исследования также предъявляются требования к гомогенности по химическому составу изучаемого образца.

Термогравиметрический анализ в сочетании с твердофазной экстракцией, термодесорбционной газовой хроматографией и масс-спектрометрией (TED-GC/MS) заключается в пиролизе образца в среде инертного газа (обычно Ы2) при постепенном повышении температуры, когда отходящие газообразные продукты улавливаются в твердофазном абсорбере, содержащем, например, волокна полидиметилсилоксана, накапливаются в них и затем анализируются газовой хроматографией с масс-спектрометрией [83]. Программа повышения температуры улавливаемых газов может быть установлена, например, как 25-650 или 350-600 °С в зависимости от прогнозируемого состава образца, его количества и требований к LOD.

По своим возможностям метод похож на Py-GC/MS, но отличается от него, во-первых, менее жесткими ограничениями по массе пробы в 1 анализе (можно исследовать образец массой >100 мг). Продукты пиролиза, накопленные на волокнах, можно, разделив на порции, подвергать анализу в нескольких повторах, что повышает воспроизводимость и достоверность исследования. Во-вторых, возможность гибко регулировать условия пиролиза позволяет проводить исследование при минимальной пробоподготовке и степени концентрирования МП (например, в образцах, содержащих порядка 0,5-1 мас.% для каждого типа анализируемого полимера) [2, 51].

Термогравиметрический анализ в сочетании с твердофазной экстракцией, термодесорбционной газовой

хроматографией и масс-спектрометрией был впервые применен для анализа проб окружающей среды (мидий и речных взвешенных частиц), содержащих ПЭ в количестве до 1 мас.% [83]. Согласно [81] пределы количественного определения (LOQ) для ПЭ, ПП и ПС составляли около 10, 1 и 0,2 мкг соответственно. Продемонстрирована применимость TED-GC/MS для количественного определения МП размером до 5 мкм в напитках, разлитых в пластиковые бутылки [84]. Величина LOQ составила менее 0,01 мкг/л в расчете на исходный напиток.

К недостаткам метода относится возможность непредвиденного влияния на результат анализа со стороны загрязнения установки при предыдущих циклах исследования, что характеризуется как «эффект памяти» [2]. Для предотвращения этого рекомендуется включать достаточное количество процедурных бланков (случайных пустых чашек) в серии измерений.

Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография для анализа МП в образцах из окружающей среды и продукции была использована в небольшом числе работ. Так, содержание МП, состоящих из ПА и ПЭТ, определяли после их, соответственно, кислотного и щелочного гидролиза с последующей химической дериватизацией методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [42]. LOQ составил 4 и 0,7 мкг/л для

2 полимеров соответственно. К сожалению, метод не подходит для многих практически важных МП, например для полиолефинов, ПВХ, ПС. Кроме того, необходимость использования дериватизации как дополнительной стадии пробоподготовки вносит свою погрешность при получении количественных результатов.

В исследовании !. НЫе^етег и соавт. [22] МП в косметической продукции определяли методом высокотемпературной гель-проникающей хроматографии. Выделенный из образца МП растворяли в трихлорбензоле и анализировали на колонке со стационарной фазой

3 PLGel Olexis при температуре 150 °С.

Другие методы

Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (!CP-MS) - это метод анализа элементного состава образцов путем их разложения на одноатомные ионы в индуктивно-связанной плазме с температурой порядка 10 000 оС и последующего их разделения в квадру-польном масс-спектрометре. Анализ возможен для МП, содержащих минеральные примеси, такие как катализаторы, агенты вулканизации, отверждения или вспенивания, пигменты, антипирены, термо- и фотостабилизаторы, антиоксиданты, биоциды, антискользящие добавки, смазки или наполнители [2]. Например, Ре, Т1 и Си часто входят в состав пигментов, а Вг и Zn -в состав антипиренов.

Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой в режиме детекции единичных частиц была протестирована для регистрации сферических полистирольных

микрочастиц с использованием в качестве маркерного иона изотопа углерода 13С+ [85]. При этом можно было получить информацию как о распределении частиц в диапазоне размеров 1,2-5 мкм, так и об их массовой концентрации.

На применение проточной цитометрии в целях отбора и сортировки частиц МП и НП было указано в разделе «Деструкция биологического матрикса». Однако этот метод может применяться и как самостоятельный для количественного подсчета мелких МП и анализа их распределения по размерам [51]. При этом используется вариант с одновременным измерением прямого и бокового рассеяния лазерного света частицами [86]. Сообщается о возможности количественной оценки содержания таким способом МП в диапазоне размеров 1-25 мкм [87]. Необходимой стадией такого исследования является идентификация химического состава МП одним из подходящих для этого независимых методов.

Динамическое рассеяние света - это простой и быстрый метод анализа распределения по гидродинамическому диаметру различных микро- и наночастиц в размерном интервале приблизительно от 1 нм до 10 мкм [87]. В недавней работе [88] сообщается об использовании динамического рассеяния света в качестве метода, дополняющего SEM и Py-GC/MS, при характеристике НП, выделенных из огурцов.

Перспективы использования аптамеров в анализе микропластиков

Простым решением проблемы анализа МП в составе природного биоорганического матрикса (включая пищевые продукты) было бы использование имму-нохимических методов. Однако, насколько известно, синтетические полимеры не вызывают образования антител у животных. Вместе с тем в последнее время теоретически рассматривается возможность использования для целей подобного исследования аптамеров. Аптамеры - это сравнительно короткие олигонуклео-тиды, отобранные из больших библиотек фрагментов РНК или ДНК на основе их специфической аффинности к разнообразным целевым лигандам [89]. Сворачиваясь в определенную третичную структуру, аптамеры образуют сайты прочного нековалентного связывания, использующего водородное и гидрофобное взаимодействия и силу Ван-дер-Ваальса [90]. Такой процесс молекулярного распознавания подобен взаимодействию антиген-антитело, из-за чего аптамеры иногда называют «искусственными антителами». По мнению Z. Huang и соавт. [91], с помощью технологии селекции in vitro можно отбирать аптамеры ДНК, способные специфически распознавать МП. Данная гипотеза пока не получила экспериментального подтверждения, однако на возможность существования нуклеотидных последовательностей, специфически распознающих определенные виды пластмасс, указывают результаты

недавней работы [92], в которой были определены термодинамические параметры взаимодействия с полимерами (полибутен, ПЭ, ПП, ПС и ПВХ) различных фрагментов генома вируса БАЯБ-СоУ-19.

Меры по обеспечению качества исследований микропластика

МП и НП присутствуют повсеместно в окружающей среде, они могут находиться в воздухе жилых и производственных помещений, мигрировать из упаковки и укупорочных средств; источником волокон МП является одежда из полимерных материалов. Вследствие этого в процессе изучения МП возможны артефакты, связанные с загрязнением изучаемого образца образующимися или вносимыми в процессе исследования посторонними МП. Необходима разработка комплекса мер по предотвращению пластикового загрязнения или контролю его наличия [1].

При проведении всех процедур, связанных с выделением и анализом МП, необходима постановка контрольных тестов (процедурных бланков) с образцами, содержащими все использованные компоненты и материалы, кроме собственно изучаемого источника МП. Реактивы и растворители, применяемые в исследовании, должны быть освобождены от посторонних микрочастиц путем микрофильтрации (через фильтры с диаметром пор порядка 0,2 мкм), а в случае изучения НП -также и ультрафильтрации. Все операции, выполняемые с объектами, содержащими МП, должны проводиться в ламинарных шкафах или боксах с фильтрацией воздуха. Желательной мерой также является работа в «чистых помещениях», снабженных системой очистки всего воздуха рабочей зоны от взвешенных аэрозольных частиц. При проведении пробоотбора и последующих манипуляций с МП не допускается использование пластмассовой посуды и укупорочных средств, следует использовать только стеклянную и металлическую посуду. Носимая персоналом спецодежда не должна содержать синтетических волокон; допускаются только ткани из целлюлозы. Если в каких-либо средствах индивидуальной защиты, например в перчатках, нельзя отказаться от полимерных материалов, они должны быть легко идентифицируемыми, как в случае перчаток из синего нитрила [2, 82, 93, 94].

Нерешенные проблемы в анализе микропластиков

МП создают риски для здоровья человека, представляя собой вместе с тем крайне гетерогенную группу объектов, включающую частицы и волокна различного химического состава, формы и размера [20, 25]. В настоящее время не до конца решен вопрос о том, в каких единицах следует выражать дозу МП. Большинство существующих методов позволяет оценивать ее как через массовую концентрацию, так и через число

частиц. Однако в случае крайне гетерогенного состава МП оба этих показателя могут оказаться в недостаточной степени информативными [4]. Так, результаты ряда модельных экспериментов in vitro и in vivo указывают на то, что наиболее токсичной может оказаться фракция МП самого малого размера и, в еще большей степени, - НП [1]. При этом существующие методы про-боподготовки, связанные с выделением МП на фильтрах с порами определенного размера, их визуальным или микроскопическим отбором и подсчетом, могут недооценивать или полностью игнорировать содержание в образце как раз самых мелких фракций [2]. Существующие методы определения состава либо неприменимы к НП (как это имеет место для FT-IR-спектроскопии, светооптической микроскопии), либо недостаточно чувствительны, чтобы исследовать единичные частицы (Py-GC/MS), либо недостаточно специфичны (в случае исследования с помощью SEM). В связи с этим в ряде работ предлагается оценивать содержание НП в объектах окружающей среды и продукции путем экстраполяции распределения по размерам, установленного для более крупных частиц, на нанодиапазон [4]. Однако такой подход может привести к очень большой ошибке в оценках [20]. Не до конца разработан также вопрос о методах оценки старения МП и о том влиянии, которое на этот процесс может оказать пробоподготовка, например гидролиз или окисление поверхностных слоев частиц МП под действием реагентов, используемых для разложения сложного органического матрикса продукта [1]. По-видимому, при работе с состарившимися МП необходимо вычленение в их составе структур с наибольшей устойчивостью к изменениям, которые могут являться маркерами идентификации при проведении исследований методами хроматографии.

Заключение

Как следует из данных литературы, в настоящее время разработано множество методов, позволяющих проводить анализ содержания МП и НП в пищевой продукции. Вместе с тем отсутствует какой-либо единый подход, позволяющий решить эту задачу универсальным образом. Большинство методов идентификации и количественного определения МП детально оценены и валидированы применительно к объектам окружающей среды, включая воды морей и океанов, пресноводных водоемов, сточные воды, донные и поверхностные отложения, стоки промышленных предприятий и очистных сооружений, морские и пресноводные организмы. Однако задачи исследования МП в составе именно пищевой продукции имеют свои особенности, ввиду чего следует выделить 2 группы проблем, относящиеся к различным видам пластикового загрязнения. Применительно к оценке содержания в пищевой продукции МП, мигрирующих из пластиковых упаковочных материалов и укупорочных средств, пакетиков для заварки чая и т.д., речь идет

об анализе главным образом гомогенных по химической природе МП, состав которых часто известен заранее. Лимитирующим фактором при этом является чувствительность обнаружения, поскольку количество мигрирующих МП может быть очень малым. В таком случае наиболее важную роль играют методы про-боподготовки - фильтрация, разделение МП по их плотности и гидрофобным свойствам, позволяющие извлечь и сконцентрировать их из большого объема продукта. После этого для выделеных МП могут быть подсчитаны размер и число частиц с использованием сравнительно малоспецифичных методов светооптиче-ской, флюоресцентной микроскопии, SEM и TEM. При наличии сомнения в надежности идентификации МП могут быть дополнительно проведены исследования с помощью рамановской микроспектрометрии, FT-IR (в том числе в режиме пропускания для образцов, состоящих из больших количеств мелких МП и НП), Py-GC/MS и других аналитических методов.

С другой стороны, при изучении загрязнения пищевой продукции МП и НП, поступающими из окружающей среды (как это имеет место в случае нерыбных продуктов промысла, столовой соли, меда и др.), критически важны не только подсчет и определение размера, но и идентификация неизвестных МП. В этом случае наибольшее значение приобретают методы высокоселективной спектральной и физико-химической идентификации, требующие большого числа стандартных образцов всевозможных МП, спектральных баз данных и математического аппарата для расшифровки результата. Существенные ограничения связаны при этом с используемыми методами пробоподготовки, такими как разрушение матрикса с помощью кислот, щелочей, окислителей и отчасти ферментных препаратов, когда поверхностные свойства, размер и структура МП могут изменяться, затрудняя его идентификацию. Наиболее продуктивным, как следует из данных литературы, является комплексный подход, сочетающий применение на одной и той же частице последовательно неразруша-ющих (FT-IR, рамановская микроспектрометрия) и разрушающих (хроматографических) тестов, что позволяет в большом числе случаев избежать неверной идентификации.

К проблемам, не решенным в полной мере применительно к анализу МП в составе пищевой продукции, относится, во-первых, недостаточно изученное влияние старения МП и его обрастания микробными биопленками на результаты его идентификации и анализа, а во-вторых, практически полное отсутствие надежных методов определения НП в составе сложных биоорганических матриксов, при том что значимость НП как потенциальных токсикантов является, по-видимому, наибольшей. Таким образом, разработка и валидация методов определения МП и НП в пищевой продукции, в том числе основанных на нетрадиционных принципах (таких как использование аптамеров), продолжает оставаться актуальной проблемой химии пищевых продуктов и гигиены питания.

Сведения об авторах

Гмошинский Иван Всеволодович (Ivan V. Gmoshinski) - доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3671-6508

Шипелин Владимир Александрович (Vladimir A. Shipelin) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», ведущий научный сотрудник научной школы «Химия и технология полимерных материалов» ФГБОУ ВО «РЭУ им. Г.В. Плеханова», доцент кафедры экологии и безопасности пищи РУДН (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0015-8735

Колобанов Алексей Иванович (Alexey I. Kolobanov) - лаборант-исследователь лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3986-1708

Соколов Илья Евгеньевич (Ilya E. Sokolov) - младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2819-6001

Маисая Кирилл Звиадович (KirillZ. Maisaya) - лаборант-исследователь лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6913-3547

Хотимченко Сергей Анатольевич (Sergey A. Khotimchenko) - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», профессор кафедры гигиены питания и токсикологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5340-9649

Литература/References

1. Bai C.L., Liu L.Y., Hu Y.B., Zeng E.Y., Guo Y. Microplastics: a review of analytical methods, occurrence and characteristics in food, and potential toxicities to biota. Sci Total Environ. 2022; 806 (pt 1): 150263. 11. DOI: https://doi.org/10.10167j.scitotenv.2021.150263

2. Ivleva N.P. Chemical analysis of microplastics and nanoplastics: challenges, advanced methods, and perspectives. Chem Rev. 2021; 121 (19):

11 886-936. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.1c00178 12.

3. Yong C.Q.Y., Valiyaveettil S., Tang B.L. Toxicity of microplastics and nanoplastics in mammalian systems. Int J Environ Res Public Health. 2020; 17 (5): 1509. DOI: https://doi.org/10.3390/yerph17051509

4. Hirt N., Body-Malapel M. Immunotoxicity and intestinal effects

of nano- and microplastics:a review of the literature. Part Fibre 13. Toxicol. 2020; 17 (1): 57. DOI: https://doi.org/10.1186/s12989-020-00387-7

5. Bhagat J., Nishimura N., Shimada Y. Toxicological interactions of microplastics/nanoplastics and environmental contaminants: current 14. knowledge and future perspectives. J Hazard Mater. 2021; 405: 123913. DOI: https://doi.org/10.1016/johazmat.2020.123913

6. Bowley J., Baker-Austin C., Porter A., Hartnell R., Lewis C. Oceanic 15. hitchhikers - assessing pathogen risks from marine microplastic. Trends Microbiol. 2021; 29 (2): 107-16. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.tim.2020.06.011

7. Huang Z., Hu B., Wang H. Analytical methods for microplastics 16. in the environment: a review. Environ Chem Lett. 2023; 21 (1): 383-401. DOI: https://doi.org/10.1007/s10311-022-01525-7

8. Kwon J.H., Kim J.W., Pham T.D., Tarafdar A., Hong S., Chun S.H.,

et al. Microplastics in food: a review on analytical methods and 17. challenges. Int J Environ Res Public Health. 2020; 17 (18): 6710. DOI: https://doi.org/10.3390/yerph17186710

9. Toussaint B., Raffael B., Angers-Loustau A., Gilliland D., Kestens 18. V., Petrillo M., et al. Review of micro- and nanoplastic contamination

in the food chain. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2019; 36 (5): 639-73. DOI: https://doi.org/10.1080/19440 049.2019.1583381

10. Rubio-Armendariz C., Alejandro-Vega S., Paz-Montelongo S., Gutiérrez-Fernandez A.J., Carrascosa-Iruzubieta C.J., Hardisson-de la 19. Torre A. Microplastics as emerging food contaminants: a challenge

for food safety. Int J Environ Res Public Health. 2022; 19 (3): 1174. DOI: https://doi.org/10.3 390/ijerph19031174

Diaz-Basantes M.F., Conesa J.A., Fullana A. Microplastics in honey, beer, milk and refreshments in Ecuador as emerging contaminants. Sustainability. 2020; 12 (14): 5514. DOI: https://doi.org/10.3390/ su12145514

Prata J.C., Paço A., Reis V., da Costa J.P., Fernandes A.J.S., da Costa F.M., et al. Identification of microplastics in white wines capped with polyethylene stoppers using micro-Raman spectroscopy. Food Chem. 2020; 331: 127323. DOI: https://doi.org/10.1016/j.food-chem.2020.127323

Lachenmeier D.W., Kocareva J., Noack D., Kuballa T. Microplastic identification in German beer — an artefact of laboratory contamination? Dtsch Lebensm. Rundsch. 2015; 111 (10): 437-40. DOI: https:// doi.org/10.5281/zenodo.1250715

Kosuth M., Mason S.A., Wattenberg E.V. Anthropogenic contamination of tap water, beer, and sea salt. PLoS One. 2018; 13 (4): e0194970. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0194970 Löder M.G.J., Kuczera M., Mintenig S., Lorenz C., Gerdts G. Focal plane array detector- based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Environ Chem. 2015; 12 (5): 563-81. DOI: https://doi.org/10.1071/EN14205 Oßmann B.E., Sarau G., Holtmannspötter H., Pischetsrieder M., Christiansen S.H., Dicke W. Small-sized microplastics and pigmented particles in bottled mineral water. Water Res. 2018; 141: 307-16. DOI: https://doi.org/10.1016/j.watres.2018.05.027 Iniguez M.E., Conesa J.A., Fullana A. Microplastics in Spanish table salt. Sci Rep. 2017; 7 (1): 8620. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-017-09128-x

Käppler A., Windrich F., Löder M.G., Malanin M., Fischer D., Labrenz M., et al. Identification of microplastics by FTIR and Raman microscopy:a novel silicon filter substrate opens the important spectral range below 1300 cm-1 for FTIR transmission measurements. Anal Bioanal Chem. 2015; 407 (22): 6791-801. DOI: https://doi.org/10.1007/ s00216-015-8850

Vinay Vinay Kumar B.N., Löschel L.A., Imhof H.K., Löder M.G.J., Laforsch C. Analysis of microplastics of a broad size range in commer-

cially important mussels by combining FTIR and Raman spectros- 39. copy approaches. Environ Pollut. 2021; 269: 116147. DOI: https://doi. org/10.1016/j.envpol.2020.116147

20. Kappler A., Fischer D., Oberbeckmann S., Schernewski G., Labrenz M., Eichhorn K.J., et al. Analysis of environmental microplastics by vibrational microspectroscopy: FTIR, Raman or both? Anal Bioanal 40. Chem. 2016; 408 (29): 8377-91. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-016-9956-3

21. Maes T., Jessop R., Wellner N., Haupt K., Mayes A.G. A rapid-screening approach to detect and quantify microplastics based on fluo- 41. rescent tagging with Nile Red. Sci Rep. 2017; 7: 44501. DOI: https://doi. org/10.1038/srep44501

22. Hintersteiner I., Himmelsbach M., Buchberger W.W. Characterization

and quantitation of polyolefin microplastics in personal-care products 42. using high-temperature gel-permeation chromatography. Anal Bioanal Chem. 2015; 407: 1253-9. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-014-8318-2

23. Grbic J., Nguyen B., Guo E., You J.B., Sinton D., Rochman C.M. Magnetic extraction of microplastics from environmental samples. 43. Environ Sci Technol Lett. 2019; 6 (2): 68-72. DOI: https://doi. org/10.1021/acs.estlett.8b00671

24. Zhou X.X., Hao L.T., Wang H.Y., Li Y.J., Liu J.F. Cloud-point extraction combined with thermal degradation for nanoplastic analysis using pyrolysis gas chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 2019; 44. 91 (3): 1785-90. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b04729

25. Hermabessiere L., Himber C., Boricaud B., Kazour M., Amara R., Cassone A.L., et al. Optimization, performance, and application of a pyrolysis-GC/MS method for the identification of microplastics. Anal 45. Bioanal Chem. 2018; 410 (25): 6663-76. DOI: https://doi.org/10.1007/ s00216-018-1279-0

26. Gong J., Xie P. Research progress in sources, analytical methods, eco-environmental effects, and control measures of microplastics. Chemosphere. 2020; 254: 126790. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.chemosphere.2020.126790 46.

27. Abbasi S., Soltani N., Keshavarzi B., Moore F., Turner A., Hassana-ghaei M. Microplastics in different tissues of fish and prawn from the Musa Estuary, Persian Gulf. Chemosphere. 2018; 205: 80-7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2018.04.076 47.

28. Devriese L.I., van der Meulen M.D., Maes T., Bekaert K., Paul-Pont I., Frère L., et al. Microplastic contamination in brown shrimp (Crangon crangon, Linnaeus 1758) from coastal waters of the Southern North Sea and Channel area. Mar Pollut Bull. 2015; 98 (1-2): 179-87. 48. DOI: https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2015.06.051

29. Bellas J., Martínez-Armental J., Martínez-Cámara A., Besada V., Martínez-Gómez C. Ingestion of microplastics by demersal fish from

the Spanish Atlantic and Mediterranean coasts. Mar Pollut Bull. 2016; 49. 109 (1): 55-60. DOI: https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2016.06.026

30. Karlsson T.M., Vethaak A.D., Almroth B.C., Ariese F., van Velzen M., Hassellov M., et al. Screening for microplastics in sediment, water, marine invertebrates and fish: method development and microplastic accumulation. Mar Pollut Bull. 2017; 122 (1-2): 403-8. DOI: https:// 50. doi.org/10.1016/j.marpolbul.2017.06.081

31. Zhang D., Cui Y., Zhou H., Jin C., Yu X., Xu Y., et al. Microplastic pollution in water, sediment, and fish from artificial reefs around the Ma'an Archipelago, Shengsi, China. Sci Total Environ. 2020; 703: 51. 134768. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scito tenv.2019.134768

32. Yu Z., Peng B., Liu L.Y., Wong C.S., Zeng E.Y. and validation of an efficient method for processing microplastics in biota samples. Environ Toxicol Chem. 2019; 38 (7): 1400-8. DOI: https://doi.org/10.1002/etc.4416 52.

33. Cole M., Webb H., Lindeque P.K., Fileman E.S., Halsband C., Galloway T.S. Isolation of microplastics in biota-rich seawater samples and marine organisms. Sci Rep. 2014; 4: 4528. DOI: https://doi.org/10.1038/ srep04528 53.

34. Munno K., Helm P.A., Jackson D.A., Rochman C., Sims A. Impacts of temperature and selected chemical digestion methods on microplastic particles. Environ Toxicol Chem. 2018; 37(1): 91-8. DOI: https://doi. org/10.1002/etc.3935 54.

35. Loder M.G.J., Imhof H.K., Ladehoff M., Loschel L.A., Lorenz C., Mintenig S., et al. Enzymatic purific ation of microplastics in environmental samples. Environ Sci Technol. 2017; 51 (24): 14 283-92. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.est.7b03055 55.

36. Mintenig S.M., Int-Veen I., Loder M.G.J., Primpke S., Gerdts G. Identification of microplastic in effluents of waste water treatment plants using focal plane array-based micro-Fourier-transform infrared imaging. Water Res. 2017; 108: 365-72. DOI: https://doi.org/10.1016/j. 56. watres.2016.11.015

37. Rist S., Steensgaard I.M., Guven O., Nielsen T.G., Jensen L.H., Moller L.F., et al. The fate of microplastics during uptake and depuration phases in a blue mussel exposure system. Environ Toxicol Chem. 2019;

38 (1): 99-105. DOI: https://doi.org/10.1002/etc.4285 57.

38. Hernandez L.M., Yousefi N., Tufenkji N. Are there nanoplastics in your personal care products? Environ Sci Technol Lett. 2017; 4 (7): 280-5. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.estlett.7b00187

Mintenig S.M., Baeuerlein P.S., Koelmans A.A., Dekker S.C., van Wezel A.P. Closing the gap between small and smaller: towards a framework to analyse nano- and microplastics in aqueous environmental samples. Environ Sci Nano. 2018; 5: 1640-9. DOI: https://doi. org/10.1039/C8EN00186C

Schwaferts C., Niessner R., Elsner M., Ivleva N.P. Methods for the analysis of submicrometer- and nanoplastic particles in the environment. TrAC Trends Anal Chem. 2019; 112: 52-65. DOI: https://doi. org/10.1016/j.trac.2018.12.014

Schmidt R., Nachtnebel M., Dienstleder M., Mertschnigg S., Schroettner H., Zankel A., et al. Correlative SEM-Raman microscopy to reveal nanoplastics in complex environments. Micron. 2021; 144: 103034. DOI: https://doi.org/10.1016/j.micron.2021.103034 Castelvetro V., Corti A., Ceccarini A., Petri A., Vinciguerra V. Nylon 6 and nylon 6,6 micro- and nanoplastics: a first example of their accurate quantification, along with polyester (PET), in wastewater treatment plant sludges. J Hazard Mater. 2021; 407: 124364. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jhazmat.2020.124364

Castelvetro V., Corti A., Bianchi S., Ceccarini A., Manariti A., Vinciguerra V. Quantification of poly(ethylene terephthalate) micro-and nanoparticle contaminants in marine sediments and other environmental matrices. J Hazard Mater. 2020; 385: 121517. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jhazmat.2019.121517

Schwaferts C., Sogne V., Welz R., Meier F., Klein T., Niessner R., et al. Nanoplastic analysis by online coupling of Raman microscopy and field-flow fractionation enabled by optical tweezers. Anal Chem. 2020; 92 (8): 5813-20. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b05336 Pirok B.W.J., Abdulhussain N., Aalbers T., Wouters B., Peters R.A.H., Schoenmakers P. J. Nanoparticle analysis by online comprehensive two-dimensional liquid chromatography combining hydrodynamic chroma-tography and size-exclusion chromatography with intermediate sample transformation. Anal Chem. 2017; 89 (17): 9167-74. DOI: https://doi. org/10.1021/acs.analchem.7b01906

Valsesia A., Quarato M., Ponti J., Fumagalli F., Gilliland D., Colpo P. Combining microcavity size selection with Raman microscopy for the characterization of nanoplastics in complex matrices. Sci Rep. 2021; 11 (1): 362. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-79714-z Rochman C.M., Tahir A., Williams S.L., Baxa D.V., Lam R., Miller J.T., et al. Anthropogenic debris in seafood:plastic debris and fibers from textiles in fish and bivalves sold for human consumption. Sci Rep. 2015; 5: 14340. DOI: https://doi.org/10.1038/srep14340

Loder M.G.J., Gerdts G. Methodology used for the detection and identification of microplastics-a critical appraisal. In: M. Bergmann, L. Gutow, M. Klages (eds). Marine Anthropogenic Litter. Cham: Springer, 2015: 201-27. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-319-16510-3_8 Song Y.K., Hong S.H., Jang M., Han G.M., Rani M., Lee J., et al. A comparison of microscopic and spectroscopic identification methods for analysis of microplastics in environmental samples. Mar Pollut Bull. 2015; 93 (1-2): 202-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j. marpolbul.2015.01.015

Lenz R., Enders K., Stedmon C.A., Mackenzie D.M.A., Nielsen T.G. A critical assessment ofvisual identification of marine microplastic using Raman spectroscopy for analysis improvement. Mar Pollut Bull. 2015; 100 (1): 82-91. DOI: https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2015.09.026 Primpke S., Christiansen S.H., Cowger W., De Frond H., Deshpan-de A., Fischer M., et al. Critical assessment of analytical methods for the harmonized and cost-efficient analysis of microplastics. Appl Spectrosc. 2020; 74 (9): 1012-47. DOI: https://doi.org/10.1177/0003702820921465 Costa C.Q.V., Cruz J., Martins J., Teodosio M.A.A., Jockusch S., Ramamurthy V., et al. Fluorescence sensing of microplastics on surfaces. Environ Chem Lett. 2021; 19: 1797-802. DOI: https://doi. org/10.1007/s10311-020-01136-0

Wagner J., Wang Z., Ghosal S., Rochman C., Gassel M., Wall S. Novel method for the extraction and identification of microplastics in ocean trawl and fish gut matrices. Anal Methods. 2017; 9: 1479-90. DOI: https://doi.org/10.1039/C6AY02396G

Zhang W., Dong Z., Zhu L., Hou Y., Qiu Y. Direct observation of the release of nanoplastics from commercially recycled plastics with correlative Raman imaging and scanning electron microscopy. ACS Nano. 2020; 14 (7): 7920-6. DOI: https://doi.org/10.1021/acsnano.0c02878 Ter Halle A., Ladirat L., Martignac M., Mingotaud A.F., Boyron O., Perez E. To what extent are microplastics from the open ocean weathered? Environ Pollut. 2017; 227: 167-74. DOI: https://doi.org/10.1016/j. envpol.2017.04.051

Auta H.S., Emenike C.U., Jayanthi B., Fauziah S.H. Growth kinetics and biodeterioration of polypropylene microplastics by Bacillus sp. and Rhodococcus sp. isolated from mangrove sediment. Mar Pollut Bull. 2018; 127: 15-21. DOI: https://doi.org/10.1016/j.marpolbul. 2017.11.036

Hernandez L.M., Xu E.G., Larsson H.C.E., Tahara R., Maisuria V.B., Tufenkji N. Plastic teabags release billions of microparticles and nanoparticles into tea. Environ Sci Technol. 2019; 53 (21): 12300-10. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.est.9b02540

81.

82.

83.

58. Melo-Agustín P., Kozak E.R., de Jesús Perea-Flores M., Mendoza- 76. Pérez J.A. Identification of microplastics and associated contaminants using ultra high resolution microscopic and spectroscopic techniques.

Sci Total Environ. 2022; 828: 154434. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.scitotenv.2022.154434 77.

59. Busse K., Ebner I., Humpf H.U., Ivleva N., Kaeppler A., OBmann B.E., Schymanski D. Comment on «Plastic teabags release billions of micro-particles and nanoparticles into tea». Environ Sci Technol. 2020; 54

(21): 14134-5. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.est.0c03182 78.

60. Watteau F., Dignac M.-F., Bouchard A., Revallier A., Houot S. Microplastic detection in soil amended with municipal solid waste composts as revealed by transmission electronic microscopy and pyrolysis/GC/ MS. Front Sustain Food Syst. 2018; 2: 81. DOI: https://doi.org/10.3389/ fsufs.2018.00081 79.

61. Gigault J., Pedrono B., Maxit B., Ter Halle A. Marine plastic litter: the unanalyzed nano-fraction. Environ Sci Nano. 2016; 3: 346-50. DOI: https://doi.org/10.1039/C6EN00008H

62. Renner G., Schmidt T.C., Schram J. Analytical methodologies for 80. monitoring micro(nano)plastics: which are fit for purpose? Curr Opin Environ Sci Health. 2018; 1: 55-61. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.coesh.2017.11.001

63. Yang D., Shi H., Li L., Li J., Jabeen K., Kolandhasamy P. Microplastic pollution in table salts from China. Environ Sci Technol. 2015; 49 (22): 13 622-7. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.est.5b03163

64. Prata J.C., da Costa J.P., Duarte A.C., Rocha-Santos T. Methods for sampling and detection of microplastics in water and sediment: a critical review. TrAC Trends Anal Chem. 2019; 110: 150-9. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.trac.2018.10.029

65. Elert A.M., Becker R., Duemichen E., Eisentraut P., Falkenhagen J., Sturm H., et al. Comparison of different methods for MP detection: what can we learn from them, and why asking the right question before measurements matters? Environ. Pollut. 2017; 231 (pt 2): 1256-64. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envpol.2017.08.074

66. Cabernard L, Roscher L, Lorenz C, Gerdts G, Primpke S. Comparison of Raman and Fourier transform infrared spectroscopy for the quantification of microplastics in the aquatic environment. Environ Sci Technol. 2018; 52 (22): 13 279-88. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.est. 8b03438

67. Primpke S., Wirth M., Lorenz C., Gerdts G. Reference database design for the automated analysis of microplastic samples based on Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (21): 5131-41. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-018-1156-x

68. Simon M., van Alst N., Vollertsen J. Quantification of microplastic mass and removal rates at wastewater treatment plants applying Focal Plane Array (FPA)-based Fourier Transform Infrared (FT-IR) imaging. Water Res. 2018; 142: 1-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j. watres.2018.05.019

69. Kedzierski M., Falcou-Préfol M., Kerros M.E., Henry M., Pedrot-ti M.L., Bruzaud S. A machine learning algorithm for high throughput identification of FTIR spectra: application on microplastics collected in the Mediterranean Sea. Chemosphere. 2019; 234: 242-51. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.chemosphere.2019.05.113 88.

70. Primpke S., Cross R.K., Mintenig S.M., Simon M., Vianello A., Gerdts G., et al. Toward the systematic identification of microplastics in the environment: evaluation of a new independ-ent software tool (SIMPLE) for spectroscopic analysis. Appl Spectrosc. 2020; 74 (9): 89. 1127-38. DOI: https://doi.org/10.1177/0003702820917760

71. da Silva V.H., Murphy F., Amigo J.M., Stedmon C., Strand J. Classification and quantification of microplastics (< 100 ^m) using a focal plane array-Fourier transform infrared imaging system and machine learning. 90. Anal Chem. 2020; 92 (20): 13 724-33. DOI: https://doi.org/10.1021/acs. analchem.0c01324

72. Wander L., Vianello A., Vollertsen J., Westad F., Braun U., Paul A. 91. Exploratory analysis of hyperspectral FTIR data obtained from environmental microplastics samples. Anal Methods. 2020; 12: 781-91. DOI: https://doi.org/10.1039/C9AY02483B 92.

73. Fischer D., Kaeppler A., Eichhorn K.J. Identification of microplastics in the marine environment by Raman microspectroscopy and imaging. Am Lab. 2015; 47 (3): 32-34. URL: https://www.americanlabora-tory.com/914-Application-Notes/173574-Identifi-cation-of-Microp-lastics-in-the-Marine-Environment-by-Raman-Microspectroscopy- 93. and-Imaging/ (date of access June 07, 2023).

74. Sullivan G.L., Gallardo J.D., Jones E.W., Hollliman P.J., Watson T.M., Sarp S. Detection of trace sub-micron (nano) plastics in water samples using pyrolysis-gas chromatography time of flight mass spectrometry (PY-GCToF). Chemosphere. 2020; 249: 126179. DOI: https://doi. 94. org/10.1016/j.chemosphere.2020.126179

75. Li D., Shi Y., Yang L., Xiao L., Kehoe D.K., Gun'ko Y.K., et al. Microplastic release from the degradation of polypropylene feeding bottles during infant formula preparation. Nat Food. 2020; 1 (11): 746-54. DOI: https://doi.org/10.1038/s43016-020-00171-y

85.

86.

87.

Sgier L., Freimann R., Zupanic A., Kroll A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 2016; 7: 11587. DOI: https://doi. org/10.1038/ncomms11587

Ter Halle A., Jeanneau L., Martignac M., Jarde E., Pedrono B., Brach L., et al. Nanoplastic in the North Atlantic subtropical gyre. Environ Sci Technol. 2017; 51: 13 689-97. DOI: https://doi.org/10.1021/acs. est.7b03667

Reichel J., Graßmann J., Letzel T., Drewes J.E. Systematic development of a simultaneous determination of plastic particle identity and adsorbed organic compounds by thermodesorption-pyrolysis GC/ MS. Molecules. 2020; 25 (21): 4985. DOI: https://doi.org/10.3390/ molecules25214985

Majewsky M., Bitter H., Eiche E., Horn H. Determination of microplastic polyethylene (PE) and polypropylene (PP) in environmental samples using thermal analysis (TGA-DSC). Sci Total Environ. 2016; 568: 507-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2016.06.017 Yu J., Wang P., Ni F., Cizdziel J., Wu D., Zhao Q., et al. Characterization of microplastics in environment by thermal gravimetric analysis coupled with Fourier transform infrared spectroscopy. Mar Pollut Bull. 2019; 145: 153-60. DOI: https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2019.05.037 Duemichen E., Eisentraut P., Celina M., Braun U. Automated thermal extraction-desorption gas chromatography mass spectrometry: a multifunctional tool for comprehensive characterization of polymers and their degradation products. J Chromatogr. A. 2019; 1592: 133-42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.01.033 Silva A.B., Bastos A.S., Justino C.I.L., da Costa J.P., Duarte A.C., Rocha-Santos T.A.P. Microplastics in the environment. Anal Chim Acta. 2018; 1017: 1-19. DOI: https://doi.org/10.1016/j.aca.2018.02.043 Dümichen E., Barthel A.K., Braun U., Bannick C.G., Brand K., Jekel M., et al. Analysis of polyethylene microplastics in environmental samples, using a thermal decomposition method. Water Res. 2015; 85: 451-7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.watres.2015.09.002 Braun U., Altmann K., Herper D., Knefel M., Bednarz M., Ban-nick C.G. Smart filters for the analysis of microplastic in beverages filled in plastic bottles. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2021; 38 (4): 691-700. DOI: https://doi.org/10.1080/1944 0049.2021.1889042

Bolea-Fernandez E., Rua-Ibarz A., Velimirovic M., Tirez K., Van-haecke F. Detection of microplastics using inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) operated in single-event mode. J Anal At Spectrom. 2020; 35 (3): 455-60. DOI: https://doi.org/10.1039/ C9JA00379G

Kaile N., Lindivat M., Elio J., Thuestad G., Crowley Q.G., Hoell I.A. Preliminary results from detection of microplastics in liquid samples using flow cytometry. Front Mar Sci. 2020; 7: 856-67. DOI: https://doi. org/10.3389/fmars.2020.552688

Sorasan C., Edo C., Gonzalez-Pleiter M., Fernändez-Pinas F., Lega-nes F., Rodriguez A., et al. Generation of nanoplastics during the photoageing of low-density polyethylene. Environ Pollut 2021; 289: 117919. DOI: https://doi.org/10. 1016/j.envpol.2021.117919 Li C., Gao Y., He S., Chi H., Li Z., Zhou X., et al. Quantification of nanoplastic uptake in cucumber plants by pyrolysis gas chromatog-raphy/mass spectrometry. Environ Sci Technol Lett. 2021; 8: 633-8. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.estlett.1c00369 Ku T.H., Zhang T., Luo H., Yen T.M., Chen P., Han Y., et al Nucleic acid aptamers: an emerging tool for biotechnology and biomedical sensing. Sensors. 2015; 15: 16 281-313. DOI: https://doi.org/10.3390/ s150716281

Cai S., Yan J., Xiong H., Liu Y., Peng D., Liu Z. Investigations on the

interface of nucleic acid aptamers and binding targets. Analyst. 2018;

143: 5317-38. DOI: https://doi.org/10.1039/c8an01467a

Huang Z., Qiu L., Zhang T., Tan W. Integrating DNA nanotechnology

with aptamers for biological and biomedical applications. Matter. 2021;

4: 461-89. DOI: https://doi.org/10.1016/j.matt.2020.11.002

Zhang F., Wang Z., Vij ver M.G., Peij nenburg W.J.G.M. Theoretical

investigation on the interactions of microplastics with a SARS-CoV-2

RNA fragment and their potential impacts on viral transport and

exposure. Sci Total Environ. 2022; 842: 156812. DOI: https://doi.

org/10.1016/j.scitotenv.2022.156812

Brander S.M., Renick V.C., Foley M.M., Steele C., Woo M., Lusher A., et al. Sampling and quality assurance and quality control: a guide for scientists investigating the occurrence of microplastics across matrices. Appl Spectrosc. 2020; 74 (9): 1099-125. DOI: https://doi. org/10.1177/0003702820945713

Schymanski D., Oßmann B.E., Benismail N., Boukerma K., Dall-mann G., von der Esch E., et al. Analysis of microplastics in drinking water and other clean water samples with micro-Raman and micro-infrared spectroscopy: minimum requirements and best practice guidelines. Anal. Bioanal. Chem. 2021; 413: 5969-94. DOI: https://doi. org/10.1007/s00216-021-03498-y