CC BY
0УДК: 616. 211-008. 8. 001. 8 МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
(СООБЩЕНИЕ 2)
Г. П. Захарова, Ю. К. Янов, В. В. Шабалин, Е. В. Тырнова, Л. Л. Клячко METHODOLOGICAL BASIS OF MORPHOLOGIC RESEARCH OF BIOLOGICS FLUID OF UPPER AIR PASSAGES MUCOSAES SOLID PHASE
(MESSAGE SECOND)
G. P. Zakаhrova, U. K. Yanov, V. V. Shabalin, E. V. Tirnova, L. L. Klichco
СПб НИИ уха, горла, носа и речи Росмедтехнологий (Директор - Засл. врач РФ, проф. Ю. К. Янов)
Рост числа хронических воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей обосновывает необходимость разработки новых технологий изучения их патогенеза, прогнозирования, ранней диагностики и лечения. Изменение состава биологических жидкостей слизистой оболочки верхних дыхательных путей играет значительную роль в патогенезе их заболеваний. Одним из наиболее перспективных направлений исследования в медицине является «изучение морфологии биологических жидкостей человека». Это фундаментальное направление представляет принципиально новый подход к исследованию заболеваний, их диагностике и лечению.
Ключевые слова: биологическая жидкость, верхние дыхательные пути, морфология биологической жидкости, клиновидная дегидратация, системная самоорганизация, структуризация, структура, твердая фаза.
Библиография: 7 источников.
The high incidence rate of chronic inflammatory upper air passages diseases asks for developing the of new pathogenesis, forecasting, early detection and treatment research technologies. Biologics fluids compositional disorder of upper air passages mucosaes plays a prominent part in the pathogenesis of this diseases. One of the most prospective development lines in medicine is «biologics fluid morphology». This fundamental line is a principally new approach in diseases research, detection and treatment.
Key words: biologics fluid, upper air passages, biologics fluid morphology, sphenoidal dehydration, system self-organization, structuring, structure, solid phase.
Bibliography: 7 souwes.
Секрет, тканевая внутриклеточная и внеклеточная биологические жидкости слизистой оболочки дыхательных путей имеют большое значение в функционировании органов дыхания и сохранении гомеостаза внутренней среды организма. Для исследования этих биологических жидкостей требуется наличие их адекватного количественного и качественного состава. Однако получение секрета дыхательных путей и тканевой биологической жидкости стандартизованным методом представляет достаточно сложную практически задачу и требует разработки и применения специальных методов.
В настоящее время существует несколько способов получения носового секрета. К ним можно отнести следующие:
- получение носового секрета с помощью аспирации;
- получение носового секрета с помощью смывов;
- стимуляция выделения секрета с помощью целлюлозной губки, вставленной в преддверие носа, с последующей ее аспирацией или различными раздражающими веществами (перец, лук, чеснок и др.). Недостатком аспирации является невозможность получить секрет при его небольшом количестве. Разведение носового секрета затрудняет проведение исследований и делает их менее достоверными. Стимуляции выделения носового секрета различными раздражителями делает исследование нефизиологичным.
До настоящего времени при исследовании носового секрета производилось определение качественного и количественного содержания в нем различных органических и неорганических компонентов, а также его свойств с помощью биохимических, иммунологических, физических методов исследования. Кроме того, большое диагностическое и прогностическое значение в клинической практике придается цитологическому исследованию состава носового секрета [1, 6]. Однако цитологическая характеристика носового секрета не позволяет проанализировать его неклеточную составляющую. Общим недостатком существующих в настоящее время методов исследования носового секрета является фрагментарность получаемой информации. Определение качественного и количественного состава отдельных параметров носового секрета не дает представления об его состоянии в целом. Для исследования химического состава разных по структурно-функциональному назначению тканей организма человека, включая биологические жидкости, необходимым условием служит их предварительная гомогенизация. Однако в известных методах гомогенизации тканей [7, 4] гомогенат разводится различными жидкостными средами. Эта необходимость вызвана тем, что в результате гомогенизации, как правило, получается достаточно густая масса, исследование которой затруднительно. В то же время разведение изменяет динамику течения физико-химических процессов происходящих в исследуемой ткани in vivo. В некоторых методах гомогенизации кроме разведения применяется кипячение полученной биологической жидкости [7], а в модификации Смирновой Л. Г., 1951 [4] используется препарат гиалуроновой кислоты для определения инвазивных свойств микробов. Эти процедуры делают невозможным исследование структуризации биологической жидкости вследствие нарушения динамики течения естественных физико-химических процессов и денатурации белков.
В связи с непосредственным участием в патогенезе воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей биологических жидкостей, морфологическое исследование секрета и тканевых биологических жидкостей слизистой оболочки представляет особенный интерес. Однако публикациии результатов их морфологического исследования, как в норме, так и при хронических воспалительных заболеваниях до настоящего времени в доступной литературе отсутствуют.
Способы получения биологических жидкостей слизистой оболочки верхних дыхательных путей внеклеточной (носовой секрет) и внутриклеточной (гомогенаты тканей) для морфологического исследования
Для морфологического изучения структур твердой фазы биологических жидкостей слизистой оболочки верхних дыхательных путей нами были разработаны новые способы их получения: внеклеточной - секрета [2] и внутриклеточной - надосадочной жидкости гомогената [3]. Полученные биологические жидкости переводили в твердую фазу посредством их структуризации (системной самоорганизации) методом клиновидной дегидратации [6], после чего проводили морфологическое исследование структур их твердой фазы под световым микроскопом.
Способ получения носового секрета для последующего его морфологического исследования [2] заключается в следующем. Получение материала (носового секрета) для морфологического исследования производится с помощью щеточки, используемой нами также для получения реснитчатого эпителия со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Секрет собирается в месте его наибольшего скопления в области дна полости носа с помощью «вытирающих» движений. Сразу после этого щеточку опускают в пробирку с 0,5 мл физиологического раствора NaCl и, с помощью размешивающих движений материал переносится в жидкость. С целью получения достаточного для исследования количества материала носового секрета сбор и перенос его в пробирку проводится трижды. Затем пробирка с материалом для исследования центрифугируется в течение 15 минут со скоростью 900g. Надосадочная жидкость набирается в лабораторную пипетку и в виде капли необходимого объема (2,5 мкл) наносится на предметное стекло для последующего приготовления препарата и исследования методом клиновидной дегидратации.
Способ получения надосадочной жидкости гомогената слизистой оболочки верхних дыхательных путей для морфологического исследования [3] заключается в следующем.
Получение материала для исследования проводится прямо в операционной. Кусочек удаленной слизистой оболочки нижней носовой раковины или полипной ткани взвешивается, измельчается и гомогенизируется. Затем он помещается в пробирку и смешивается с физиологическим раствором №С1 в пропорции 1: 1. При гомогенизации полипной ткани разведение не производится, так как в гомогенате полипной ткани жидкости достаточно для проведения дальнейших исследований. Пробирка центрифугируется со скоростью 900g в течение 15 минут. После центрифугирования надосадочная жидкость насасывается в лабораторную пипетку и наносится на предметное стекло в виде капли размером 2,5 мкл для исследования методами клиновидной или краевой дегидратации после высушивания.
Метод перевода БЖ в твердую фазу - клиновидная дегидратация
Наблюдать системную структуру биожидкостей в жидком состоянии можно с помощью видеонаблюдения за процессом самоорганизации. Однако эта методика представляет достаточную сложность для практического применения. Для того чтобы данная структура была доступна для морфологического исследования, биожидкость необходимо перевести в твердую фазу. В. Н. Шабалиным, С. Н. Шатохиной (1986, 2001) был разработан специальный метод, названный методом клиновидной дегидратации, так как клиновидная форма высыхающей биожидкости является важнейшим моментом системной самоорганизации растворов. Авторами изучались структуры твердой фазы биологических жидкостей человека с целью получения диагностической информации о состоянии организма [6].
Метод клиновидной дегидратации заключается в следующем. Капля - это естественная объемная структурная единица любой жидкости. Во взвешенном состоянии жидкость структурируется в форме капли. Данная структура является, главным образом, результатом адекватности веса капли силе её поверхностного натяжения. При нанесении капли на плоскую не-смачиваемую поверхность, она принимает форму, близкую к полусфере, образуя клин, широкая часть которого находится в центре, а узкая - на периферии (рис.)
Рис. Схематическое изображение капли биологической жидкости на плоскости (сагиттальный и фронтальный разрез).
На обезжиренное предметное стекло, расположенное строго горизонтально лабораторной пипеткой последовательно наносили капли биологической жидкости в объеме 10, 5, 2,5 мкл. При этом диаметр капли составлял соответственно около 5, 2,5, 1,25 мм. Для обработки стекол использовали 0,01% раствор полилизина (разбавление дистиллированной водой 1: 10). Капля высушивалась в стандартных условиях при температуре 200 - 250С и относительной влажности 65-70%, при минимальной подвижности окружающего воздуха. В процессе высыхания для капли и предметного стекла обеспечивалось неподвижное состояние. Продолжительность периода высыхания (до момента анализа структуры) составляла 18-24 часа. По истечении указанного времени препараты рассматривались под микроскопом. Исследование структурообразующих элементов дегидратированной капли нами проводилось с помощью лабораторного микроскопа БИМАМ Р-13.
С помощью метода телевизионной микроскопии нами получены серии изображений текстур биологических жидкостей. Запись изображений производилась на жесткий диск компьютера. Использование метода обработки и анализа компьютерных изображений позволило создать четкую картину элементов структуры изучаемой биологической жидкости по каждой серии изображений. Проводилась качественная оценка структур твердой фазы исследуемых биологических жидкостей. Итоговое увеличение составило от 4,5х до 33х. Запись структур твердой фазы исследуемых биологических жидкостей, выполненная на компьютере, представляла собой последовательность цифровых изображений (кадров).
Согласно сформулированным В. Н. Шабалиным, С. Н. Шатохиной, (2001), теоретическим представлениям при клиновидной дегидратации биожидкости работают особые механизмы, которые обеспечивают построение системной и подсистемных твердофазных структур [6]. Наглядное представление о действии этих механизмов представлено на рисунке. На нём показана капля биологической жидкости (расположенная на горизонтальной плоскости) во фронтальном разрезе по диаметру. Данная схема демонстрирует, что испарение жидкости происходит равномерно по всей открытой поверхности капли. В силу того, что полусфера имеет разную толщину слоя в центре и на периферии (клин), в исследуемой капле при испарении воды происходит неравномерное изменение концентрации растворенных веществ. А именно - концентрация в тонких (периферических) отделах возрастает более быстрыми темпами по сравнению с центральной (толстой) частью капли. В таких условиях начинают проявлять себя осмотические и онкотические силы. В связи с тем, что мощность осмотических сил на два порядка выше онкотических, соли начинают более быстро перемещаться к центру капли, в сторону зоны меньшей концентрации растворенных веществ. При этом они отбирают воду у белков и других растворенных веществ с высоким молекулярным весом. По мере испарения воды раствор становится насыщенным и соли начинают «выдавливать» органические вещества из воды, переводя их в твердую фазу. Однако, ввиду чрезвычайно сложного компонентного состава биожидкостей этот процесс происходит постадийно с образованием концентрационных волн (зон) твердой фазы, которые формируются за счет соответствующих компонентов биожидкости с одинаковыми физико-химическими параметрами.
Данная методика зарекомендовала себя информативной, экономичной, простой по технике постановки и анализу результатов. Метод клиновидной дегидратации представляет в настоящее время основной способ исследования самоорганизации биологических жидкостей при различных заболеваниях. Он обеспечивает в биологических жидкостях системное распределение идентичных по структурно-функциональным характеристикам элементов в зонах градиентной концентрации, их фиксацию и анализ особенностей структуры. Дополнительное использование соответствующих методов дает возможность исследовать химический состав концентрационных зон в норме и при патологических состояниях. Фундаментальный принцип данного метода состоит в том, что он позволяет решить проблему преобразования молекулярных процессов биожидкости в диапазон видимых структурных зон в форме устойчивых твердофазных образований. При этом, что особенно важно - метод клиновидной дегидратации основан на анализе системного морфогенеза биологической жидкости. Исследование локальных структур - отдельных кристаллических образований, требует применения самостоя-
Российская оториноларингология №6 (43) 2009
тельной методики с принципиально отличными от клиновидной дегидратации условиями кристаллизации биологической жидкости.
Неоспоримым достоинством метода морфологического исследования системной самоорганизации биологических жидкостей (клиновидной дегидратации) является его простота и доступность для выполнения. Однако интерпретация значения структур твердой фазы биологических жидкостей представляет существенные трудности. Они обусловлены недостаточной изученностью и отсутствием единого представления о биофизических и биохимических механизмах процесса самоорганизации биологических жидкостей; недостаточностью сведений о химическом составе элементов структур твердой фазы и малочисленностью характеристик морфотипов разных биологических жидкостей человека в норме и при патологии. С уверенностью можно сказать, что морфологическое исследование биологических жидкостей человека представляет принципиально новое направление исследований в медицине и в том числе оториноларингологии. И то, что сейчас опубликовано и наработано по этому направлению - это начало большого пути развития этого направления. В руки клиницистов и исследователей дана новая теоретически обоснованная методология, имеющая глубокие исторически сложившиеся научные корни и открывающая перспективы принципиально нового подхода к исследованию, диагностике и лечению заболеваний. Для дальнейшего развития этого направления и его полноценного использования в различных специальностях необходимо получение и исследование как можно большего материала биологических жидкостей в норме и при различных заболеваниях. Это позволит создать базу данных для описания и характеристики морфотипов различных биологических жидкостей организма человека, как в норме, так и при патологии, а также обнаружить структурные маркеры различных патологических процессов, определить и разработать основные параметры, критерии и алгоритм диагностики патологического процесса. Кроме того, важным представляется изучение химического состава структур твердой фазы биологических жидкостей, что требует привлечения соответствующих аналитических методов. Несомненно, что набор базы данных исследований структур твердой фазы биологических жидкостей в норме и при конкретной патологии позволит приступить к разработке математического алгоритма диагностики этого патологического процесса и его автоматизации.
(Продолжение следует, начало см. «Рос. оторинолар». 2009. - №°5. - С. - 45-54)
ЛИТЕРАТУРА
1. Колядицкая Е. А., 1947 Колядицкая Е. А. Цитологические особенности носового секрета при гриппе и сезонных катарах дыхательных путей// Журн. Микробиол. - 1947. - №6. - С. 40-45.
2. Российская Федерация, МПК8 G01N 33/487, А61М 1/00 Способ получения носового секрета для морфологического исследования. Г. П. Захарова (RU), В. В. Шабалин (RU), Ю. К. Янов (RU), Е. В. Тырнова (RU), Л. Л. Клячко (RU), О. Н. Шабалина (RU). Патент РФ на изобретение №2287161, приоритет 30.03.2005, опубл. 10.11.2006.
3. Российская Федерация, МПК, Способ получения биологической жидкости для морфологического исследования. Г. П. Захарова (RU), В. В. Шабалин (RU), Ю. К. Янов (RU), Е. В. Тырнова (RU), Л. Л. Клячко (RU), О. Н. Шабалина (RU). Патент РФ на изобретение №2293324, приоритет 30.03.2005, опубл. 10.02.2007. Бюл. №4.
4. Смирнова Л. Г. Препарат гиалуроновой кислоты для определения инвазивных свойств микробов / Л. Г. Смирнова / Микробиол. - 1951. - №10. - С. 52-56.
5. Уразбаева А. Т. Носовые отпечатки и их роль в диагностике заболеваний носа и его придаточных полостей. Вопросы клинической оториноларингологии. Под. ред. И. И. Потапова. - М., 1955. - С. 40-57.
6. Шабалин В. Н., Шатохина С. Н. Морфология биологических жидкостей человека. - М.: Хризистом. - 2001. - 304 с.
7. Mc Clean D., Rogers H., Williams B. W. Early diagnosis of wound infection. Lancet,1943,1,355-361.
