CC BY
94
УДК 611.018.83:616-006.48-092.9:615.371
M. A. Rubtsova, M. I. Lukashina, A. A. Vainson, N. N. Kasatkina, L. Yu. Vishnyakova, K. I. Gordania, E. V. Ogorodnikova, A. Yu. Baryshnikov
A NOVEL METHOD FOR OBTAINING OF DENDRITIC TUMOR FUSION CELLS ANTICANCER VACCINES
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
Antitumor vaccination by dendritomas is one of the most likely approaches in the immunotherapy of cancer. The aim of our study was to establish the optimal conditions for dendritic and tumor cells fusion. The denditic cells derived from peripheral blood mononuclear cells of healthy donors and melanoma cells of recently developed mel Kor line were used. It was shown that fusion efficiency does not depend on the stage of maturation of dendritic cells used and that fusion results in terminal maturation of dendritic cells. Irradiation of dendritic and tumor cells does not have influence on fusion efficiency and irradiation of tumor cells seems to be more expedient. Established method was successfully used for fusion of autologous dendritic and tumor cells of cancer patients. Thus, we established a novel method for obtaining of high quantities of dendritic-tumor fusion cells. Further research is needed to evaluate the clinical efficiency of dendritoma-based anticancer vaccines.
Key words: dendritic cells, dendritomas, fusion, antitumor vaccine.
М. А. Рубцова, М. И. Лукашина, А. А. Вайнсон, Н. Н. Касаткина, Л. Ю. Вишнякова, К. И. Жордания, Е. В. Огородникова, А. Ю. Барышников
МЕТОДИКА СОЗДАНИЯ ГИБРИДОМНОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, СЛИТЫХ С ОПУХОЛЕВЫМИ КЛЕТКАМИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Одним из перспективных методов иммунотерапии злокачественных новообразований является использование противоопухолевых вакцин на основе гибридных клеток (дендритом). Целью нашей работы являлся подбор условий слияния дендритных и опухолевых клеток на модельной системе: дендритные клетки, полученные из моноцитов периферической крови здорового донора, слитые с клетками опухолевой линии mel Kor. Было показано, что эффективность слияния не зависит от степени зрелости исходных дендритных клеток и в результате слияния происходит терминальная дифференцировка дендритных клеток. Исследование влияния дозы и момента облучения на выживаемость гибридных клеток показало, что ионизирующая радиация в дозах 50 или 100 Гр не влияет на эффективность слияния дендритных и опухолевых клеток, и оптимально проводить облучение опухолевых клеток до слияния. С использованием подобранных условий было проведено слияние аутологичных дендритных и опухолевых клеток онкологического больного. Таким образом, мы разработали методику получения противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток, слитых с опухолевыми. Требуются дальнейшие исследования для выяснения клинической эффективности полученной вакцины.
Ключевые слова: дендритные клетки, дендритомы, слияние, противоопухолевая вакцина.
ВВЕДЕНИЕ
Сравнительно недавно был открыт новый тип ан-тиген-презентирующих клеток (АПК) - дендритные клетки (ДК) [5]. Детальные характеристики этих клеток показали, что они играют решающую роль в распознавании микробных агентов, аутоантигенов, аллергенов и аллоантигена, процессируют микробный агент или иные антигены и мигрируют в лимфоидную ткань для передачи антигенных пептидов к лимфоци-там[24]. ДК вовлечены в индукцию и поддержание не только адаптивного, но и врожденного иммунного ответа. ДК индуцируют толерантность к своим антигенам, поддерживают нормальный гомеостаз и также ответственны за развитие антиген-специфических В-лимфоцитов и плазматических клеток [21].
У больных хроническими инфекциями, аутоиммунными, аллергическими и онкологическими заболеваниями обнаружено угнетение функций ДК. ДК, полученные из крови онкологических больных, менее дифференцированные и неполноценны за счет продукции опухолевыми клетками факторов (интерлейкина-10, фактора роста эндотелия и др.), угнетающих дифференцировку, созревание и функциональную активность ДК по сравнению с клетками здоровых доноров [21; 23; 27]. Разработанные методы культивирования ДК in vitro позволяют преодолеть их ингибирование факторами опухолевых клеток (ОпК) и получить максимальный рост и активацию ДК [20].
Использование ДК в иммунотерапии рака на сегодняшний день является перспективным направлением. В настоящее время существуют различные подходы к созданию противоопухолевых вакцин на основе ДК: нагруженные пептидами, ДНК/РНК из опухолевых клеток, идиотипическими детерминантами, лизатом ОпК, гибриды ДК и ОпК.
В последнем случае в полученных гибридных клетках сочетаются антиген-презентирующая функция ДК и иммуногенная ОпК: ДК сохраняют способность захватывать, процессировать и презентировать антиген, а опухолевые клетки -предоставлять антиген. Такие вакцины получили название дендритом [31; 35].
Первые работы по созданию таких гибридов были выполнены на мышиной модели. Были получены гибридные клетки ДК с карциномными клетками [17], с клетками линии гепатоцеллюлярной карциномы [37], клетками глиомы [11], плазмоцитами [15], клетками линии рака молочной железы [8] и показана индукция полученными дендритомами противоопухолевого ответа. Разными группами исследователей получены гибриды мышиных ДК с клетками, положительными по MUC-1 [8; 9; 15; 16]. Иммунизация дендритомами трансгенных мышей, несущих человеческий MUC-1, индуцирует у них клеточный и гуморальный иммунный ответ, отторжение установившихся метастазов, но не вызывает аутоиммунных реакций к нормальным тканям. Все исследования показали, что слившиеся клетки экспрессируют MHC I и II класса, и опухолевые маркеры стимулируют наивные Т-клетки и ЦТЛ,
а также усиливают секрецию у-интерферона. Более того, они индуцируют у мышей образование CD4+ и CD8+ ЦТЛ, которые защищают животных от переноса опухолевых клеток [8; 9; 11; 15; 17; 37]. У вакцинированных животных медиана выживаемости увеличивается в 2 раза [37]. Другие исследователи использовали для слияния ОпК, трансфецированные различными генами (CD40L, интерлейкин-2 и др.). Это значительно улучшило результаты вакцинотерапии в сравнении с таковыми для дентритом, полученных с использованием нетрансфецированных клеток [28; 33].
Также получены разнообразные данные о гибридах ДК и клеток опухолевых клеточных линий человека различных нозологий: 2 линий гепатоцеллюлар-ной карциномы [34; 10], рака кишечника [36; 31], саркомы Юинга [29], клеток линий К562 и Raji [18] и других. Эффективность слияния у разных исследователей колеблется от 14 до 25 %. Для всех полученных слившихся клеток показаны их бифенотипичность, т.е. функциональная активность ДК и иммуноген-ность ОпК. Более того, продемонстрировано, что полученные дендритомы индуцируют клеточноспецифический цитотоксический иммунный ответ, что приводит к лизису ОпК in vitro [10; 18; 25; 28; 30; 34; 36].
Дендритомы, полученные слиянием ДК и ОпК, стали использовать в некоторых клинических протоколах [4]. Созданы дендритомы ДК с ОпК различных нозологий: почечной карциномы [13; 14], меланомы [23], рака молочной железы [13; 14], колоректального рака [2; 30], множественной миело-мы [1; 3; 15] и др. В ходе проведенных клинических испытаний (I/II фаза) показано, что дендритомы не обладают токсическим эффектом, способствуют стабилизации заболевания у большинства пациентов и в некоторых случаях приводят к регрессии опухоли [26]. In vitro показана способность дентри-том увеличивать пролиферацию Т-лимфоцитов, уровень экспрессии у-интерферона, приводить к образованию специфических ЦТЛ и лизису ими ОпК [19; 32].
Противоопухолевую эффективность дентритом и вакцин на основе ДК, нагруженных лизатом ОпК, сравнивали на мышиной модели рака кишечника [6; 7]. Согласно полученным результатам дендритомы индуцируют более мощный иммунный ответ по сравнению с пульсированными ДК. Таким образом, слияние дендритных и опухолевых клеток является перспективным подходом для создания противоопухолевого иммунитета.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирование опухолевой клеточной линии меланомы mel Kor
Опухолевая клеточная линия (ОпК) меланомы mel Kor была получена в лаборатории экспериментальной диагностики и терапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Клеточная линия имеет монослойный характер роста. ОпК
культивировали в соответствующей полной среде RPMI-1640, содержащей 10мМ HEPES (Sigma, США), 10%-ную телячью эмбриональную сыворотку (ТЭС), 2мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гентамицина (ICN, США), аминокислоты, витамины (ICN, США). Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления клеток с пластика использовали раствор Версена.
Получение незрелых дендритных клеток
ДК культивировали из моноцитов периферической крови (МПК) при 37 °С и 5 % СО2, выделенных из лейкомассы здоровых доноров, полученной в отделении переливания крови с банком костного мозга (ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН), и онкологических больных. МПК выделяли в градиенте плотности фиколл-урографина (р=1,077 г/мл) по стандартной методике. Интерфазные кольца собирали и отмывали трижды в чистой среде RPMI-1640. Жизнеспособность клеток оценивали по стандартной методике по включению трипанового синего. 25-30 млн. МПК ресуспендировали в 10 мл чистой среды RPMI-1640 с гентамицином (40 нг/мл (ICN, США)), наносили на чашки Петри d=100 мм и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С и 5 % СО2. Не адгезировавшиеся клетки удаляли. Залипшие моноциты культивировали в течение 6 сут при 37 °С и 5 % СО2 в 5 мл среды RPMI-1640, содержащей 10мМ HEPES (Sigma, США), 2 % человеческой сыворотки IV (AB) группы, 2 мМ L-глутамин (Sigma, США), 40 нг/мл гентамицина (ICN, США), аминокислоты, витамины (ICN, США) и в-меркаптоэтанол, в присутствии цитокинов 80 нг/мл ГМ-КСФ и 10 нг/мл ИЛ-4.
Окрашивание клеток витальными красителями PKH26 и PKH67
Для индикации количества слившихся клеток использовали витальные красители РКН26 и РКН67 (Sigma) - красный и зеленый каналы флюоресценции на проточном цитофлюориметре соответственно -согласно инструкции производителя с определенными модификациями. ОпК окрашивали PKH26, ДК окрашивали PKH67. Коротко: суспензию клеток инкубировали с 75%-ным раствором красителя 3 мин. Добавляли равный объем ТЭС и инкубировали 1 мин. Затем добавляли равный объем 20 % по ТЭС RPMI-1640 и центрифугировали. Далее отмывали 3 раза в 20 % по ТЭС RPMI-1640 и 1 раз в чистой RPMI-1640. Окрашенные клетки ресуспендировали в нужном объёме чистой RPMI-1640.
Слияние дендритных и опухолевых клеток
ДК и ОпК смешивали в чистой среде RPMI-1640 в конической центрифужной пробирке (15 мл). Клеточную смесь центрифугировали 3 мин при 750 об/мин. Инкубировали 20-30 мин при 37 °С и 5 % СО2. Отбирали всю среду и к осадку клеток медленно добавляли
раствор 50 % полиэтиленгликоля (ПЭГ, m.w. 1450)/ДМСО (Sigma, США). Далее медленно доводили объем до 1 мл, затем до 5 мл чистой RPMI-1640. Смесь центрифугировали 3 мин при 750 об/мин. Отбирали всю среду и к осадку клеток медленно добавляли RPMI-1640, содержащую ТЭС 20%. Далее медленно в течение 1-2 мин добавляли 200 мкл 20% по ТЭС RPMI-1640, затем еще 400 мкл 20% среды. Доводили объем до 5 мл средой RPMI-1640, содержащей телячью эмбриональную сыворотку (ТЭС) 20%. Смесь центрифугировали 3 мин при 750 об/мин. Отбирали всю среду. Осадок ресуспендировали в 20% по ТЭС RPMI-1640 и помещали в 6-луночный планшет. Инкубировали в присутствии ГМ-КСФ при 37 °С и 5 % СО2.
Облучение клеток
Суспензию клеток в 3 мл чистой среды RPMI-1640 облучали во флаконах для бета-счета (длина флакона - 6 см, диаметр - 2,5 см). Доза облучения составляла 50 Гр и 100 Гр.
Реакция прямой поверхностной иммунофлюоресценции
Клетки собирали и дважды отмывали в PBS (двусолевой фосфатно-солевой буфер), pH 7,5. 50 мкл клеточной суспензии вносили в пробирки, добавляли МКА и инкубировали при +4 °С в темноте 30 мин. Клетки дважды отмывали в PBS центрифугированием, затем фиксировали 1%-ным раствором формальдегида в PBS. В ходе работы использовали моноклональные антитела (МКА), конъюгированыые с FITC (флюоресцеинтиоцианатом), к антигенам HLA-ABC (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия), HLA-DR (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия), CD14 (Caltag, USA), CD80 (Caltag, USA), CD83 (Caltag, USA), CD86 (Caltag, USA).
Проточно-цитометрический анализ
Учет результатов реакции иммунофлюоресценции проводили на проточном цитофлюориметре FAC-SCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CellQuest.
Выделение опухолевых клеток онкологических больных с помощью OncoQuit kit
Для выделения фракции ОпК из предварительно осветленной асцитической жидкости больных с диагнозом «рак яичника» использовали OncoQuit kit, предназначенный для выделения опухолевых клеток из периферической крови согласно инструкции производителя. Коротко: 50 млн клеток осадка асцитической жидкости разводили в 35 мл среды холодной RPMI-1640, наслаивали в пробирку OncoQuit kit и центрифугировали при 4 °С, 20 мин, 3000 об/мин. Далее клетки, осевшие на мембране, отмывали дважды в 50 мл PBS с BSA (приготовлен согласно инструкции производителя). Затем ещё раз отмывали в среде
КРМ1-1640. Выделенные таким образом ОпК использовали в экспериментах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Слияние дендритных и опухолевых клеток и анализ полученных результатов
Первый этап работы был посвящен подбору оптимальных условий для слияния дендритных клеток здоровых доноров и опухолевых клеток линии те1Ког. За основу была принята методика получения моноклональных антител (гибридомная технология). Слияние клеток проводили с добавлением 1 мл 50% ПЭГ/ДМСО, клетки отмывали в 25 мл среды (на 1020 млн клеток). В нашей работе общее количество клеток варьировалось от 2 до 10 млн. Для увеличения эффективности слияния исходную методику модифицировали: снижали используемые количества
ПЭГ/ДМСО и сред для отмывки; проводили слияние при комнатной температуре и при 37 °С. Оптимальными были выбраны 200 мкл ПЭГ/ДМСО на 2-5 млн клеток, 5 мл среды для отмывки; температура 37 °С.
Для определения оптимального соотношения клеток ОпК и ДК смешивали в различных соотношениях от 1:1 до 1:5 (ОпК:ДК). ДК непосредственно перед процедурой слияния окрашивали витальным красителем РКН67, ОпК - РКН26 и затем клетки сливали. Количество слившихся клеток оценивали непосредственно после слияния и через 2 ч методом проточной цитофлюориметрии по наличию у них двойной флюоресцентной метки. Контролем были ДК и ОпК, смешанные, но не слитые, которые культивировали в тех же соотношениях и условиях (табл. 1).
Количество клеток, несущих двойное окрашивание, в контроле варьировалось от 2 до 15%. В табл. 1 представлены данные анализа количества слившихся клеток в зависимости от соотношения ОпК:ДК. Видно, что при соотношении 1:1 процент гибридных клеток соизмерим с таковым в контроле и составляет 8-12 %. При соотношениях 1:2 и 1:3 до 58 % клеток несут двойное окрашивание, при 1:4 и 1:5 - только 30-40 %. Исходя из полученных результатов, для дальнейших экспериментов были выбраны соотношения ОпК:ДК - 1:2 и 1:3.
На рис. 1 представлены данные FACS-анализа эффективности слияния при соотношении ДК:ОпК, равном 1:3. Видно, что в контроле количество клеток, несущих двойную окраску, составляет 1,7 % (рис. 1, Б), сразу после слияния процент гибридных клеток составил 49,5 % (рис. 1, В), а через 2 часа - 57,9 % (рис. 1, Г).
Для получения слитых клеток, кроме обработки ПЭГ, используют электропорацию и совместную инкубацию ДК и ОпК [12]. Мы провели сравнение перечисленных методик по эффективности слияния: обработка ПЭГ - 12-23 %, электропорация - 10-15 %, совместная инкубация - 5-15 %. Наиболее
эффективным из вышеперечисленных методов является обработка клеток ПЭГ [12]. Мы показали эффективность используемого нами метода слияния на выбранной модельной системе. Таким образом, разработан протокол методики слияния, подобраны оптимальные условия и соотношение клеток. Количество полученных по такой методике гибридных клеток может достигать 60 % (в среднем 32,8±12,1).
Изучение зависимости количества слившихся клеток от степени зрелости исходных ДК и возможности дальнейшей дифференцировки незрелых ДК в результате слияния
Для получения зрелых ДК используют фактор терминальной дифференцировки ТОТ-а, который обладает цитотоксическим эффектом, в связи с чем на стадии дозревания ДК происходит гибель их значительного количества [22]. Следовательно, для большего количественного выхода ДК оптимально использовать незрелые ДК для получения гибридов с ОпК, но только в том случае, если при слиянии происходит их дозревание. Исследовали зависимость количества слившихся клеток от степени зрелости исходных ДК и возможность дальнейшей дифференцировки незрелых ДК в результате слияния.
Незрелые ДК получали согласно описанной выше методике. Для получения зрелых ДК на 6-е сут добавляли факторы терминальной дифференцировки ТОТ-а и PGE-2. Клетки инкубировали еще 1 сут и использовали для слияния по отработанной методике.
Зрелые и незрелые ДК и ОпК непосредственно перед процедурой слияния окрашивали витальными красителями РКН67 и РКН26 соответственно. Окрашенные клетки смешивали в соотношениях 1:2 и 1:3. Определяли количество слившихся непосредственно после слияния и через 2 ч (табл. 2).
Мы показали, что степень зрелости исходных ДК не влияет на количество слившихся клеток, а именно, процент слитых клеток при использовании незрелых ДК составляет от 15 до 50 %, при использовании зрелых клеток - 15-50 %.
Далее мы проводили исследование возможности дальнейшей дифференцировки ДК после слияния. Незрелые ДК сливали с ОпК в соотношении 1:2. ОпК
Таблица 1
Зависимость количества слившихся клеток от соотношения ДК:ОпК
Соотношение ОпК:ДК 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5
Количество слившихся клеток, % 8-12 15-57 20-58 30-40 30-40
БИОТЕРАПИЯ 25
о
ОТ а>с\і X о
з
о
о
1,7% 8 • • . . * * » . * . ' ’ . •V
Ж • л* • • ■і...»,.:-—...>
10
10 10 10 РІ_1-НеідМ
10
о> акчі л &
о о ■
49,5%
г -ІШ ” ї’- ’ р* • / Л * Л*. .«.*•
• * Л • ш т • — 1
• * •••; ' '•
■ і у»«": *■
10^
10'
в
10"
РІ-1-НеіаМ
10"
10
Рис. 1. РЛС8-анализ эффективности слияния при соотношении ДК:ОпК - 1:3:
А - общее распределение;
Б -ДК смешаны с ОпК, количество клеток с двойной меткой составляет 1,7 %;
В - слитые клетки сразу после слияния, количество клеток с двойной меткой составляет 49,5 %;
Г - слитые клетки через 2 ч после слияния, количество клеток с двойной меткой составляет 57,9 %.
Таблица 2
Количество слившихся клеток в зависимости от степени зрелости исходных дендритных клеток
Степень зрелости исходных ДК Незрелые Зрелые
Соотношение ОпК:ДК 1:2 1:3 1:2 1:3
Количество слившихся клеток, % 15-50 20-50 17-48 15-50
перед слиянием окрашивали витальным красителем РКН26. Степень дифференцировки ДК тестировали через 2; 24 и 48 ч после слияния, для чего полученную суспензию клетки окрашивали антителами к следующим маркерам: CD14, НЬЛ-ЛВС, НЬЛ^Я, CD80, CD83, CD86 (табл. 3 и 4). Для контроля использовали: незрелые ДК; ОпК; незрелые ДК смешанные с ОпК в соотношении 2:1 (смесь), которые после сме-
шивания обрабатывали цитокинами терминальной дифференцировки; незрелые ДК, слитые с ОпК, которые после слияния обрабатывали цитокинами терминальной дифференцировки.
Уже через 2 ч после слияния на гибридных клетках по сравнению с незрелыми ДК увеличивается уровень экспрессии маркеров зрелых ДК: CD80 с 14,6 до 25 %, CD83 с 0,5 до 12,6 %, CD86 с 65,6 до 85,1 %
Таблица 3
Уровень экспрессии поверхностных маркеров ДК на слитых клетках через 2 и 24 ч в зависимости от степени зрелости ДК, %
Маркер ОпК Н/зр ДК Через 2 ч после слияния Через 24 ч после слияния
Смесь С цитокинами Без цитоки-нов
CD14 3,2±0,8 55,0±3,8 7,2±1,3 5,2±1,4 5,7±2,3 5,4±1,2
НЬЛ-ЛВС 0,4±0,05 95,5±8,5 94,5±7,6 93,5±5,3 95,0±8,9 94,0±4,9
НЬЛ^Я 0,7±0,2 61,0±6,2 74,3±6,4 61,6±3,7 79,5±3,8 81,0±3,5
CD80 3,0±1,1 14,6±2,9 25,5±2,6 19,0±2,6 29,2±3,6 30,0±4,7
CD83 0,2±0,01 0,5±0,02 7,9±1,3 12,6±1,8 22,0±2,6 24,5±6,4
CD86 7,5±1,3 65,6±2,8 85,1±4,7 82,1±5,1 90,6±5,7 92,3±6,7
Таблица 4
Уровень экспрессии поверхностных маркеров ДК на слитых клетках через 48 ч в зависимости от степени зрелости ДК, %
Маркер Н/зр ДК Через 48 ч после слияния
Смесь С цитокинами Без цитокинов
CD14 55,0±3,8 5,8±1,5 5,3±1,1 6,2±1,4
НЬЛ-ЛВС 95,5±8,5 90,5±6,8 1 92,0±4,6 90,1±4,0
HLЛ-DR 61,0±6,2 36,0±5,6 41,0±6,2 42,0±5,8
CD80 14,6±2,9 16,5±2,8 21,0±3,4 25,6±3,7
CD83 0,5±0,02 19,0±4,9 19,8±4,7 19,0±5,1
CD86 65,6±2,8 73,0±5,1 52,0±5,9 65,7±6,3
и значительно снижается уровень экспрессии маркера незрелых ДК CD14 от 55 до 7,2 %. Через 24 ч после слияния уровень экспрессии маркеров CD80, CD83, CD86 на гибридах незрелых ДК с ОпК увеличивается до значений 30; 24,5; 92,3 % соответственно и соизмерим с таковым у слитых ДК, обработанных цитокина-ми терминальной дифференцировки (данные по тем же маркерам - 29,2; 22; 90,6 % соответственно). Через 48 ч после слияния уровень экспрессии маркеров зрелых ДК снижается до значений CD80 - 25,6 %, CD83
- 19 %, CD86 - 65,7 %, что, вероятно, связано с гибелью зрелых ДК в результате апоптоза. Следовательно, оптимальное время для инкубации слитых клеток составляет 24 ч, т.к. за это время происходит дифферен-цировка незрелых ДК.
Согласно литературным данным ДК дозревают в результате захвата антигена. Показано, что слияние ДК с ОпК множественной миеломы приводит к созреванию ДК [3], презентации ими антигена [3] и затем к апоптозу [21].
Таким образом, было установлено, что степень зрелости исходных ДК не оказывает влияния на количество слитых клеток; после слияния незрелых ДК и ОпК происходит дифференцировка ДК; оптимальное время для инкубации слитых клеток составляет 24 ч.
Облучение клеток
Одним из обязательных условий противоопухолевой иммунизации является ограничение пролиферативных способностей опухолевых клеток для предотвращения формирования новых очагов опухолевого роста при сохранении их метаболических функций. Для этих целей наиболее часто используется метод ио-нозирующего облучения. В случае опухолевой клетки результатом воздействия ионизирующего облучения является феномен постоянной остановки клеточного цикла, при котором клетки сохраняют жизнеспособность, но прекращают пролиферацию. Причиной данного феномена является инактивация в опухолевых клетках белков, участвующих в реализации про-
Таблица 5
Количество слитых клеток (в %), экспрессирующих поверхностные маркеры дендритных клеток при облучении 50Гр
Маркер Контроль 1 Контроль 2 Контроль 3 Опыт 1 Опыт 2
HLA-ABC 5,5±0,5 7,8±0,7 7,9±0,6 57,3±6,3 24,8±3,8
HLA-DR 5,8±1,1 4,7±0,9 8,1 ±2,7 54,9±5,9 12,4±4,1
CD86 4,6±0,4 7,0±0,7 6,7±1,6 66,5±6,5 28,9±7,2
CD14 4,2±0,7 6,5±0,8 5,4±1,2 5,7±1,3 3,7±1,1
граммированной клеточной гибели, при одновременном сохранении системы остановки клеточного цикла.
Исследовали зависимость количества слившихся клеток и функциональной активности ДК от дозы и момента облучения по экспрессии поверхностных маркеров ДК. Опухолевые клетки (ОпК) непосредственно перед процедурой слияния окрашивали витальными красителями РКН26. Облучение проводили в дозах 50 и 100 Гр. Сравнивали гибридные клетки, в которых облучены только ОпК, и клетки, облученные сразу после слияния. Сливали в соотношении ОпК:ДК 1:2. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37 °С и 5 % СО2 в соответствующей среде, затем докрашивали антителами к маркерам ДК (МНС I и II классов, CD14, CD86) (табл. 5).
Количество клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры ДК в контролях, составило: НЬА^Я -от 5,5 до 7,9 %, НЬА-АВС - от 4,7 до 8,1 %, CD86 - от 4,6 до 7 %, CD14 - от 4,2 до 6,5 %. В опыте 1 значения увеличились до 57,3 %, 54,9 %, 66,5 % для маркеров НЬА^Я, НЬА-АВС и CD86 соответственно и 5,7 % CD14. Облучение уже слитых клеток (опыт 2) приво-
дит к снижению уровня экспрессии ими вышеуказанных антигенов до 24,8 %, 12,4 %, 28,9 % и 3,7 % соответственно. Аналогичные результаты были получены при облучении в дозе 100 Гр. Следовательно, в дальнейших экспериментах подвергаться облучению будут только ОпК перед слиянием.
Слияние аутологичных дендритных и опухолевых клеток и анализ полученных результатов
На следующем этапе работы были определены условия слияния аутологичных ДК и ОпК. ОпК выделяли из асцитической жидкости больных с диагнозом рак яичника центрифугированием. В осадке определяли как ОпК, так и иммунокомпетентные клетки, поэтому необходимо было их разделить. Для выделения фракции ОпК использовали набор OncoQuick kit. ОпК и ДК сливали в соотношении 1:2 соответственно. Перед слиянием ОпК окрашивали витальным красителем PKH26. Облучение проводили в дозе 100 Гр. Затем, после слияния и инкубации 24 ч, клеточную массу докрашивали HLA-DR (табл. 6, рис. 2). В табл. 6
Таблица 6
Количество слившихся аутологичных опухолевых и дендритных клеток
Маркер Контроль 1 Контроль 2 Контроль 3 Контроль 4 Опыт 1 Опыт 2
HLA-DR 8,3±2,4 3,1±1,7 10,9±3,5 11,3±4,1 21,6±1,2 20,6±3,5
§,
. *•* • /* - . • J*. ' ". V : • > •.?■•./ * .. • •. шдші і ~ ■ ' - '-^ай 21,6% vJ. f J * * BPte-*4:.-. KxSPa-ij •*
. / 'ът ■ * >, * *** у * • •«. • * : II II 11Н1| III *, С
10
10
FL3-H
10“
10
А Б
Рис. 2. Определение количества слившихся аутологичных опухолевых и дендритных клеток:
А - ОпК облучены, смешаны с ДК, инкубированы 24 ч при +4 °С;
Б - ОпК облучены, слиты с ДК, инкубированы 24 ч при 37 °С.
представлены данные количества слившихся аутологичных опухолевых и дендритных клеток по сравнению с контролями.
Количество клеток с двойной меткой в контролях варьирует от 3,1 до 11,3 %, при слиянии составляет в среднем 20,8 %.
На рис. 2, А представлены данные FACS-анализа количества клеток с двойной меткой в контроле 2 -3,1 %, на рис. 2, Б - при слиянии и составляет 21,6 %.
Дендритомы, полученные слиянием аутологичных ДК и ОпК, используют в некоторых клинических про-то колах [4]. Созданы гибриды аутологичных ДК с ОпК почечной карциномы [13; 14]. Показано, что процент слитых клеток варьирует от 15 до 28 % [4; 14]. Нами показано, что количество слившихся аутологичных клеток составляет 20 %, что коррелирует с литературными данными.
ВЫВОДЫ
На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:
• оптимальное соотношение клеток для слияния при подобранных условиях составляет 1:2 и 1:3 соответственно ОпК:ДК;
• степень зрелости исходных ДК не оказывает влияния на количество слитых клеток;
• после слияния незрелых ДК и ОпК происходит полная дифференцировка ДК;
• оптимальное время для инкубации слитых клеток составляет 24 ч;
• облучению оптимально подвергать только ОпК;
• количество слившихся аутологичных клеток составляет 20 %, что коррелирует с литературными данными.
Работа была поддержана грантом правительства Москвы по программе «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний».
ЛИТЕРАТУРА
1. Anderson K. C. Tumour cell/dendritic cell fusions as a vaccination strategy for multiple myeloma // British Journal of Haematology. - 2004. -Vol. 125. - P. 34
2. Avigan D. Dendritic Cell-Tumor Fusion Vaccines for Renal Cell Carcinoma // Clinical Cancer Research. - 2004. - Vol. 10 - P. 6347.
3. Avigan D. Fusion of dendritic cells with multiple myeloma cells results in maturation and enhanced antigen presentation // British Journal of Haematology. - 2005 -Vol. 129, No 5 - P. 687-700.
4. Avigan D., Rosenblatt J. and D. Kufe. Dendritic cell fusion vaccines for cancer immunotherapy // Expert Opinion on Biological Therapy. - 2005. - Vol. 5, No 5. -P. 703-15.
5. Banchereau J., Briere F., Caux C. et al. Immunobiology of dendritic cells // Ann. Rev. Immunol. -2000. - Vol. 18. - P. 767-811.
6. Chen J-J., John Y. K., Zhang M. and C-M. Chen. Superior efficacy of dendritic cell-tumor fusion vaccine compared with tumor lysate-pulsed dendritic cell vaccine in colon cancer // Immunology Letters. - 2005 - Vol. 15. - P. 154-9.
7. Farzaneh F., Galea-Lauri J., Wells J. W. et al. Strategies for antigen choise and priming of dendritic cells influence the polarizatin and efficacy of antitumor T-cells responces in dendritic cell-based cancer vaccination // Cancer Immunol Immunother. - 2004. - 53. - P. 963-77.
8. Gong J. Prevention of Spontaneous Breast Carcinoma by Prophylactic Vaccination with Dendritic/Tumor Fusion Cells // The Journal of Immunology. - 2003. - 170
- P. 1980-6.
9. Gong J. The Kinetics of In Vivo Priming of CD4 and CD8 T Cells by Dendritic/Tumor Fusion Cells in MUC1-Transgenic Mice // The Journal of Immunology. -2002. - 168. - P. 2111-7.
10. Guan X., Peng J. R. and Leng X. S. Establishment of dendritomas by fusion of human dendritic cells with human hepatocellular carcinoma cell line HLE cells // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. - 2005. - 27. - P. 465-7.
11. Kjaergaard J., Wang L. X., Kuriyama H., Shu S., G. E. Plautz. Active immunotherapy for advanced intracranial murine tumors by using dendritic cell-tumor cell fusion vaccines // J Neurosurg. - 2005. - 103(1). - P.156-64.
12. Krause S. W. Characterization of cells prepared by dendritic cell-tumor cell fusion // Cancer Immunity. -2002. - Vol. 2. - P. 15.
13. Kufe D. Activation of antitumor cytotoxic T lymphocytes by fusions of human dendritic cells and breast carcinoma cells // Proc Natl Acad Sci U S A. -2000. - 97(6). - P. 2715-8.
14. Kufe D. Fusion Cell Vaccination of Patients with Metastatic Breast and Renal Cancer Induces Immunological and Clinical Responses // Clinical Cancer Research. -
2004. - Vol. 10. - P. 4699-708.
15. Kufe D. Immunization against murine multiple myeloma with fusions of dendritic and plasmacytoma cells is potentiated by interleukin 12 // Blood. - 2002. -Vol 99, № 7. - P. 2512.
16. Kufe D. Reversal of tolerance to human MUC1 antigen in MUC1 transgenic mice immunized with fusion dendritic and carcinoma cells // PNAS. - 1998. - Vol. 95. - P. 6279.
17. Kufe D., Gong J., Chen D., Kashiwaba M. Induction of antitumour activity by immunization with fusion of dendritic and carcinoma cells // Nat Med. - 1997. - Vol.
3, № 5. - P. 558.
18. Li Y. The effect of tumor-dendritic cell fusion vaccines on the cytotoxicity of CIK/NK cells from cord blood // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. - 2005. - Vol. 26.
- P. 269-72.
19. Li J., Holmes L. M., Franek K. J. et al. Purified hybrid cells from dendritic cell and tumor cell fusions are superior activators of antitumor immunity // Cancer Immunol Immunother. - 2001. - Vol. 50. - P. 456-62.
20. Malaya Bhattacharya-Chatterjee. Anti-idiotype vaccine against cancer // Immonology Letters. - 2000. -Vol. 74. - P. 51.
21. Mellmam L. andSteinmann R. M. Dendritic cells: Specialized and regulated antigen processing machines // Cell. - 2001. - Vol. 106. - P. 255-8.
22. Merluzzi V. J., Last-Barney K., Homon C. A., Faanes R. B. Synergistic and overlapping activities of tumor necrosis factor-alpha and IL-1 // The Journal of Immunology. - 1988. - Vol. 141. - P. 527-30.
23. Mitchell M. S. Perspective on allogeneic melanoma lysates in active specific immunotherapy // Semin. Oncol. - 1998. - Vol. 25. - P. 623.
24. Mocellin S. Priming anticancer active specific immunotherapy with dendritic cells. // Curr Opin Investig Drugs. - 2005. - Vol. 6. - P. 576-81.
25. Pedersen A. E., Thorn M., Gad M. et al. Phenotypic and functional characterization of clinical grade dendritic cells generated from patients with advanced breast cancer for therapeutic vaccination // Scand. J. Immunol. - 2005. - Vol. 61. - P. 47-56.
26. Schmidt-Wolf I. G. H. Allogenic dendritic cells fused with tumor cells: preclinical result and outcome of clinical phase I/II trial in patients with metastatic renal cell carcinoma // Human Gene Therapy. - 2003. - Vol.
14. - P. 483.
27. Steinman R. M., Banchereau J. Dendritic cells and control of immunity // Nature. - 1998. - Vol. 392. - P. 121.
28. Suzuki T., Fukuhara T., Tanaka M. et al. Vaccination of dendritic cells loaded with interleukin-12-secreting cancer cells augments in vivo antitumor immunity: characteristics of syngeneic and allogeneic antigen-presenting cell cancer hybrid cells // Clin Cancer Res. -2005. - Vol. 11. - P. 58.
29. Tang S., Guo W., Guo Y. et al. In vitro antitumor immune response induced by fusion of dendritic cells and Ewing's sarcoma cells // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. -2005. - Vol. 43. - P. 803-6.
30. Toda G. Induction of antigen-specific CD4- and CD8-mediated T-Cell responses by fusin of autologous dendritic cells and metastatic colorectal cancer cells // Int. J. Cancer. - 2005. - Vol. 117. - P. 587.
31. Wang S., Xu F., Ye Y-J. In vitro antitumor immune response induced by fusion of dendritic cells and colon cancer cells // World J Gastroenterol. - 2004. -Vol. 10(8). - P. 1162-6.
32. Wei Y., Holmes L. M., Li J. et al. A Rapid, Novel Strategy to Induce Tumor Cell-Specific Cytotoxic T Lymphocyte Responses Using Instant Dendritomas // J Immunother. - 2001. - Vol. 24(2). - P. 122-9.
33. Xia D., Chan T. and Xiang J. Dendritic cell/myeloma hybrid vaccine. // Methods Mol Med. -
2005. - Vol. 113. - P. 225-3.
34. Xie Y., Chan R. C., Xie H., Zhao G. P. Dendri-tomas formed by fusion of mature dendritic cells with allogenic human hepatocellular carcinoma cells activate autologous cytotoxic T lymphocytes // Immunol Lett. -2002. - Vol. 83(2). - P. 101-9.
35. Xu F., Wang S. and Ye Y. J. Dendritomas plays an important role in the activation of anti-tumor immune responses // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. - 2004. - Vol. 84(9). - P. 725-9.
36. Xu F, Ye Y. J., Cui Z. R., Wang S. Allogeneic dendritomas induce anti-tumour immunity against metastatic colon cancer // Scand J Immunol. - 2005. - Vol. 61(4). - P. 364-9.
37. Zhang H., Zheng S. S., Jiang G. P., Zhou L., Xie H. Y. Antitumor effect of immunizations with fusions of dendritic and hepatocellular carcinoma cells in mice // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. - 2004. - Vol. 12(11).
- P. 648-51.
Поступила 01.12.2006.
