CC BY
13
Л. Е. РАХЛИНА
Методика обнаружения патогенных микроорганизмов кишечной группы в источниках водоснабжения
' 9
Из Центрального научно-исследовательского дезинфекционного института
• . А
• Существует много методов по выделению патогенных микроорганизмов (в частности, бактерий тифа и паратифа) из воды естественных водоемов. Однако применяемые до настоящего времени способы не
вполне точны и сложны. ;
^ ' | 0
Поиски патогенных микробов в питьевой воде требуют обследования больших количеств воды, для чего предварительно концентрируют микробов из 3—5 л воды с помощью коагуляции различными химическими веществами, осаждением специфической сывороткой, центрифугированием, фильтрацией через свечи Шамберлена или Беркефельда и т. д.
Основным недостатком таких методов является невозможность полного осаждения всех микробов в обследуемом объеме воды. Для устранения недостатков старых методов нам представлялось перспективным предварительно концентрировать Микрофлору воды на поверхности мембранных фильтров. Эти фильтры нашли в последние годы довольно большое применение для разных бактериологических исследований. Впервые этот способ был введен в санитарно-бактериологиче-скую практику в лаборатории Рублевской насосной станции для учета числа микробов в моекворецкой воде.
Е. Дианова и А. Ворошилова указывают в своей работе преимущество применения мембранных фильтров для концентрирования микрофлоры из воды по сравнению с другими проверенными ими способами (коагуляция, центрифугирование, испарение и выпаривание под уменьшенным давлением).
В нашей работе «К методике бактериологического исследования различных вод с помощью мембранных фильтров», проведенной с мембранными фильтрами на кишечную палочку, а также на патогенных представителей кишечной группы, было отмечено серьезное преимущество нового метода, особенно в том случае, когда мембранные фильтры помещались на агар с бромтимолблау.
При этом удавалось успешно концентрировать на поверхности фильтров всех бактерий, находившихся в испытуемом материале, и обеспечить рост колоний, обладающих у разных видов кишечной группы различной окраской. . ,
Мембранные фильтры легко отмываются фильтрованием» на их поверхности микробов, которые могут быть легко собраны и использованы для дальнейшего исследования. С помощью этого метода удается пропустить через один фильтр от 1 л и больше воды зафиксировать на поверхности фильтра всех микробов, находящихся в данном объеме воды. •
Наши дальнейшие исследования ставили своей/задачей разработку методики обнаружения тифозно-паратифозной палочки в питьевой воде с помощью мембранных фильтров, на которых концентрировались микробы из обследуемой воды, и подбором среды, избирательной для бактерий тифа и паратифа.
Для исследования мы пользовались (Ьильтрами № 3 и 4, изготовляемыми на Рублевской станции. Фильтрация жидкости проводилась в приборах Гольдмана.
Методика исследования. Объектами исследования была водопроводная вода (стерильная и нестерильная), речная и колодезная вода, а также faeces, разведенные в воде. -Все эти жидкости перед опытом искусственно заражались микробами паратифа В или брюшного тифа. Объемы водопроводной воды, фильтровавшейся нами, составляли от 200 до 1 000 см3, а для речной и колодезной — от 10 до 100 см3. По окончании фильтрации мембранные фильтры размещались на поверхности твердых питательных сред (на агаре Эндо и на агаре с бромтимолблау), разлитых по чашкам Петри. Через 18—24 часа пребывания в термостате при температуре 37° проводилась идентификация выросших на фильтрах колоний с последующим учетом их количества. . '
Наши данные показали, что фильтрацией испытуемой воды через мембранные фильтры достигается полное осаждение на их поверхности всей микрофлоры. На среде Эндо и на агаре с бромтимолблау подавления роста кишечной палочки не происходило. Отсюда следовало ожидать заглушение роста патогенных микроорганизмов кишечной группы, если количество Bact. coli в фильтруемом материале достигало значительных цифр. Мы сочли поэтому необходимым включить в опыты и некоторые другие элективные твердые среды, обладающие способностью избирательно подавлять развитие кишечной палочки, не ущемляя жизнедеятельность тифозно-паратифозных микробов. Наиболее подходящей средой в этом отношении является среда Шустовой (твердая среда по Мюллеру).
Для ее приготовления требуется добавлять к 100 см3 растопленного *2% архангельского агара, 10 см3 50?/о стерильного гипосульфита и 2 см3 иода в иодистом калии (иода 25 г и иодистого калия 20 г на 100 см3 дестиллированной воды). Образующейся при взаимодействии иода и йодистого калия с гипосульфитом тетратионит- натрия действует • угнетающе на рост Bact. coli. Методика исследования оставалась такой же. Объектом исследования была водопроводная вода, зараженная брюшнотифозной, паратифозной В и кишечной бактериями. Высевы фильтратов производились на средах Эндо, агаре с бромтимолблау » среде Шустовой.
Как видно из приведенной табл. 1, опыты показали, что среда Шустовой обладает избирательной способностью по отношению к патогенным микроорганизмам кишечной группы и одновременно угнетает рост Bact. coli. , , . ]
Из 12 опытов на среде Шустовой наблюдался рост Bact. coli только в 2 случаях, тогда как на среде Эндо и агаре с бромтимолблау это наблюдалось во всех случаях. Развитие колоний бактерий тифа и паратифа В на средах Шустовой и агаре с бромтимолблау было полностью обеспечено, на среде же Эндо отмечалось отсутствие роста з 2 случаях из 12 опытов. Однако средой Шустовой мы не могли пользоваться с должным успехом потому, что на этой среде колонии разных микробов имели одну и ту же окраску и были трудно отличимы друг от друга, что весьма усложняло диагностику. Поэтому в дальнейшие опьцы были введены дополнительно еще 2 среды: среда с конго-рот и висмутовая Вильсон-Блэр (по прописи Минкевича). Среда с кон-горот не имела никакого преимущества перед средой Эндо и агаром с бромтимолблау. На среде Вильсон-Блэр рост Bact. coli подавлялся почти столь же энергично, как на среде Шустовой.
Сравнительная оценка 5 сред—Эндо, агара с бромтимолблау, кон-горот, Шустовой и Вильсон-Блэр — подтвердила избирательное накопление на "средах Шустовой и Вильсон-Блэр (табл. 2) бактерий тифа и
паратифа В и одновременное угнетение кишечной палочки. Хотя на среде Вильсон-Блэр мы получали различную окраску для колоний Bact. paratyphi В и Bact. typhi abd. (черный цвет с серым ореолом во-
Таблица 1. Число колоний, выросших на поверхности фильтров из искусственно зараженной водопроводной воды культурами
кишечной, тифозных и паратифозных бактерий 1
Среда Эндо • Агар с бромтимолблау Среда Шустовой •
• Bact. coll Bact. paratyphi В Bact. typhi abd. Bact. coli Bact. paratyphi B Bact. typhi abd. Bact. coll Bact. paratyphi B Bact. typhi abd.
20 • 1 1 21 1 • 1 0 2 • 1
• 27 1 1 19 2 1 • 2 2 1
16 О ' 1 15 t 2 0 1 2
18 1 2 12 1 - 1 0 - 3 2
17 t 1 • 3 20 3 2 0 2 3
19 0 17- 1 • • 2 0 3 1
29 ' 1 26 1 2 0 . 2 1
35 1 1 36 1 1 2 1 2
44 0 2 47 2 . 1 0 2 \ 1
55 1 0 33 1 2 0 3 4
* m 4 / 0
25 ! • 1 44 3 0 2 1
39 0 • 1 37 1 2 0 3 2
Итого. . 344 12 % 14 327 18 18 4 • 26 21 •
1 Bact. coll..............из расчета 50 микробных клеток
Bact. paratyphi...........„ „ 10 . „ •
Bact. typhi abd............ , 10 . ,
-1
s "1
t> X со
w
О
"О
о
со т
£
г
Таблица 2. Колонии, выросшие на поверхности фильтров из 200—1 ООО смз искусственно зараженной водопроводной воды культурами
кишечной, тифозных и паратифозных бактерий 1
Среда Эндо Агар с бромтим олблау Среда Шустовой Конгорот Среда Вильсон-Блэр .Тетрабром"
Bact. coli Bact. paratyphi В ' Bact. typhi abd. • Bact. coli Bact. paratyphi В Bact. typhi abd. Bact. coli Bact. paratyphi В Bact. typhi abd. • Bact. coll Bact. paratyphi В Bact. typhi abd. Bact. coli Bact. paratyphi В Bact. typhi abd. Bact. coli Bact. paratyphi В Bact. typhi abd.
16 1 1 17 1 • • 1 0 t 1 • — 2 19 2 1 . 0 2 1 0 1 2
17 1 2 14 1 1 2 1 1 15 • 1 1 1 5 1 0 3 2
19 2 1 20 2 0 0 • 2. 1 18 1 1 0 л t** • 0 1. 0 2 1
15 2 / 0 15 1 1 0 3 1 • 19 1 0 2 3 1 • - 0 2 3
10 щ ш 0 • . 2 12 1 3 0 1 2 10 1 1 0 1 2 0 4 2
18 Л т 0 - 2 21 1 1 0 3 1 15 0 2 1 0 1 • 0 1 • 1
13 1 2 16 1 1 Ш 0 2 1 29 2 1 2 2 1 0 3 2
• 11 1 1 10 1 • 2 0 1 2 15 1 • 1 0 3 • 1 0 2 1
22 2 1 19 • 1 2 2 1 1 14 0 1 0 2 3 • 0 1 3
Итого 141 10 • Ж 12 144 10 12 4 15 12 » 154 9 9 6 18 12 0 19 • 17
1 Bact. coli.............. 300 микробных клеток
%
Bact. paratyphi В . . .........10 .
со со
Bact. typhi abd. . . .•...... . . 10
У
круг них) и для В act. coli (голубой), но при большом числе колоний на фильтре трудно было диференцировать их друг от друга. Следует отметить, что при высевах зараженной воды непосредственно на поверхности сред Шустовой и Вильсон-Блэр подавление роста В act. coli и возможность выделения патогенных микробов были выражены лучше, чем при работе на фильтрах.
Для дальнейших исследований мы приготовили модификацию среды Шустовой «тетрабром» по следующей прописи.
К 100 см3 1,5% расплавленного и остуженного до 50° архангельского агара (pH = 7,4—7,5) прибавлялось 0,5 г стерильной лактозы, 10 см3 стерильного 50% гипосульфита, 2 см3 раствора иода в иодистом калии и 0,5 см3 1,5% спиртового раствора бромтимолблау. Среда «тетрабром» обладает определенными преимуществами по сравнению со средами Вильсон-Блэр и Шустовой. При сравнительной оценке сред в отношении угнетения роста Bact. coli мы получили следующие данные: на среде Вильсон-Блэр рост Bact. coli обнаружен в 4 случаях из 18 опытов; на среде Шустовой рост Bact. coli обнаружен в 2 случаях из 18 опытов; на среде «тетрабром» совершенно не обнаружено роста кишечной палочки во всех 18 опытах (табл. 2).
Аналогичные результаты по угнетению кишечной палочки и полному выявлению тифозной палочки на среде «тетрабром» получены в опытах с речной и колодезной водой, зараженной брюшнотифозной палочкой, что иллюстрируется табл. 3 и 4.
Для подтверждения этих выводов был поставлен ряд опытов с водопроводной водой, зараженной разбавленными faeces в разведениях 1 : 1 000, 1 : 10 000 и 1 : 100 000, искусственно зараженных дополнительно бактериями тифа и паратифа В (из расчета 10 и 20 микробных клеток на соответствующий объем).
В результате опытов были получены следующие данные, указанные в табл. 4 и 6. На среде агар с бромтимолблау отмечен рост Bact. coli в 48 случаях из 48 проб (100%), на среде «тетрабром» — в 7 случаях из 48 проб (1—12%).
Таблица 3. Рост колоний на поверхности фильтров из 10—100 см3 колодезной воды, зараженной культурой
тифозной палочки
(10 микробных клеток)
Среда агар с бромтимолблау • Среда .тетрабром" » • — •
Bact. coli Bact. typhi abd. Bact. coli • Bact. typhi abd.
4-W- 3 3 2
-Ь 1 . 1 • 8 3'
+++ 0 3 7
+++ 0 3 7
+++ 0 5 2
++ 1 2
+ 1 5 2
+ 9 1 3 3
+++ 0 2 1
+++ 1 3 2
+++ • 0 5 4
++ + 0 • 12 1
#
Таблица 4. Рост колоний на поверхности фильтров из-10—100 см8 речной воды, зараженной тифозной палочкой
_(10 микробных клеток)
Среда агар с бромти-молблау
Bact. coli I Bact. typhi abd
Среда ,тетрабром
Таблица 5. Рост колоний на поверхности фильтров из воды, зараженной faeces (в разведении 1:1000, 1:10 000
и 1:100 000) и культурой Bact. paratyphi В
(10 микробных клеток)
Среда агар с бромти-молблау
Bact. coli Bact. parat. В
Среда »тетрабром
\
W 9
Следовательно, модифицированная среда «TejpaöpoM» дала сильное угнетение роста Ba-ct. coli даже на материале, богатом кишечной палочкой.
Таблица 6. Рост колоний на поверхности фильтров из воды, зараженной faeces и культурой Bact. i typhi abd.
(10 микробных клеток)
Среда агар с бромтимолблау
Bact. coll
Bact. typhi abd.
Среда .тетрабром"
Bact. coli
Bact. typhi abd.
25 - 26
15
++
42 +++
10 20 60
0 2 3 3 1 1 0 1 2 2
0 0 1 0 О 2 10 0 0 0
1 1
5 2 2
3
4 1 3 1
Наша среда позволяет отличать колонии различных представителей кишечной группы по морфологическим признакам и легко выделяет каждую колонию в отдельности. Кроме того, эта среда дает четкую диференцированную окраску для отдельных колоний микробов кишечной группы: колонии Bact. coli имеют желтую окраску, сама среда вокруг фильтров из светлозеленого переходит в желтый цвет; колонии Bact. paratyphi В имеют зеленый центр с серым ободком по периферии; через 2—3 дня колонии приобретают валики серого цвета, характерные для паратифозной палочки; колонии Bact. typhi abd. зелено-
вато-желтого, а иногда коричневого цвета в центре и также с серым ободком по периферии. Сама среда вокруг фильтров, • зараженных Bact. paratyphi В или Bact. typhi abd., приобретает зеленовато-синеватую окраску. Отмечено, что через 3—4 дня вокруг колоний Bact. paratyphi В и Bact. typhi abd. образуется постепенно расширяющаяся просветленная зона.
Различная окраска колоний помогает отличать друг от друга колонии бактерий кишечной группы, чем и ускоряется идентификация и количественный учет интересующих нас микробов.
Сравнительная оценка всех испытанных нами сред — Эндо, агар с бромтимолблау, агар с конгорот, Шустовой, Вильсон-Блэр и «тетрабром»— в экспериментальной работе по обнаружению бактерий тифа и паратифа в воде позволяет нам поставить среду «тетрабром» выше других, проверенных нами.
Преимущества этой среды состоят в следующем: она 1) обладает хорошо выраженным угнетением робга колонии Bact. coli; 2) является избирательной средой для патогенных микробов паратифа В и брюшного тифа; 3) позволяет по морфологическим признакам колоний ди-ференцировать различных представителей кишечной группы; 4) не более бактерицидна для патогенной группы, чем среда Эндо или агар с бромтимолблау; 5) проста для изготовлений.
Выводы
1. Для выделения бактерий тифа и паратифа из искусственно зараженной питьевой воды был использован метод обогащения с помощью мембранных фильтров (приготовленных на Рублевской станции).
2. Для культивирования микроорганизмов, выделившихся на поверхности мембранных фильтров после испытания ряда элективных сред, избрана модифицированная среда «тетрабром».
3. Преимуществом этой среды является не только хорошо выраженное угнетающее действие на рост Bact. coli, но и возможность легко диференцировать по окраске колоний представителей патогенных микробов кишечной группы, хорошо развивающихся на среде
«тетрабром». - #
4. Благоприятные результаты выделения тифозно-паратифозных микробов в искусственно зараженной питьевой воде дают основание испытать этот метод для поисков тех же микробов в воде естественных водоемов.
5. Этот метод может быть рекомендован как рациональный способ обнаружения тифозно-паратифозных бактерий в больших количествах водопроводной воды.
6. Этот метод имеет важное значение при санитарно-эпидемиологи-ческой оценке воды там, где она признана годной по титру Bact. coli.
ЛИТЕРАТУРА
1. Р а х л и н а Л. Е., Микробиология и эпидемиология, № 5,1940.—2. Сочилова А.» Журнал микробиологии, т. II, в. 3, 1933.—3. Разумов А. С., Журнал микробиологии, т. I, и. 1, 1932. — А. Холодный, Zbl. f. 'Bakteriol., Ed. 77, 1929.— 5. Иерусалимский, Журнал микробиологии, т. I, 1932. — 6. Кузнецов С. Я. и К о р-зинкин Г. С., Zbl. f. Bakteriol., Bd. 83, 1931. — 7. Королев С. А., Вологодский мол.-хоз. ин-т, бюлл. № "<6-77.-8. Дианова Е. и Ворошилова А., Журнал микробиологии, т. 1, в. 3, 1933.— 9. Askeshow, Journ. of Bacteriol., v. 25, 1933.— 10. Тетерик, Гигиена и санитария, № 9, 1939. — 11. Schmidt Е. W., Zbl. f. Bakteriol., Bd. 58,1923.-12. Wilson а. В 1 a i г, Journ. of Hygiene,26,1927.-13. Они же, Journ. of Hygiene, v. 33, No. 4, 1938. — 14. МинкевичИ. E. и Попов H.A., Журнал микробиологии и эпидемиологии, № 7—8, 1932. — 15. Кирикова О. П., Гигиена и санитария, № 9, 1939.
Л. Н. ШУСТОВА
_ • %
Современное состояние вопроса
о заменителях агара в бактериологической
практике
Из Центральной санитарно-гигиенической лаборатории Мосгорздрава
Поиски заменителей агара начались уже давно, с 90-х годов прошлого столетия. Первоначально имелось в виду найти индиферентную основу для синтетических сред при изучении усвоения микроорганизмами того или иного вещества. В таком разрезе и была разработана методика приготовления силикатных сред (Кюне, Виноградскин, Бейерник и в последнее время Валь, Бэтчлер и Вильсон).
Со времени империалистической войны возникла необходимость освободиться от импортного для Европы и дорогого агара и найти ему дешевую и доступную замену для общебактериологических работ. В качестве заменителя агара был испробован ряд веществ как растительного происхождения, так и химических продуктов.
Так как агар представляет собой продукт, состоящий из высокомолекулярных углеводов, получаемый из водорослей (Euchemma, Geli-dium, Gigantina — тихоокеанских, Phylophora , rubens — черноморских, Aufelgia plicata — беломорских), то, естественно, прежде всего были испытаны другие вещества того же порядка, а именно: препараты из различных бурых водорослей (ламинарии, фукус пузырчатый), из зеленых водорослей (спирогира), исландский мох, алтейный корень, трагант (из мотыльковых растений), целлофан. Однако все указанные попытки не оправдали ожиданий (Циммерман, Вольфейль, Клауберг и др.). Некоторый успех был достигнут с пектиновыми веществами из яблок и других плодов. Они дают хороший гель, но только при кислой реакции (Шнайдер, Шнайдер и Бок). На них хорошо удается выращивание плесени (Функ).
