CC BY
37
УДК 543.544+543.42:615.15
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛДОПЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
А. Л. Хохлов1, Ю. А. Джурко2, V. Kubes2, Л. Н. Шитов12, И. И. Яичков1, А. М. Шитова2
1Ярославский государственный медицинский университет, 2Квинта-Аналитика, Ярославль
Разработана экспрессная и чувствительная методика количественного определения метилдопы в плазме крови с применением ВЭЖХ-МС/МС. Динамический диапазон измерения концентраций составил 0,02-3,00 мкг/мл. Данная методика использована для проведения исследования фармакокинетики таблетированной формы метилдопы.
Ключевые слова: метилдопа, ВЭЖХ-МС/МС, плазма, стабилизация, фармакокинетика. DOI 10.19163/1994-9480-2017-3(63)-105-108
A METHOD FOR QUANTIFICATION OF PLASMA CONCENTRATIONS
OF METHYLDOPA
A. L. Khokhlov1, Y. A. Dzhurko?, V. Kubes2, L. N. Shitov12,1.1. Yaichkov1, A. M. Shitova2
1Yaroslavl State Medical University, 2Quinta-Analytica, Yaroslavl
We developed a rapid and sensitive method for quantifying plasma concentrations of methyldopa using HPLC-MS/MS. The range of concentration measurements was 0,02-3,00 цд/ml. The method was applied for pharmacokinetic study of methyldopa tablet formulations.
Key words: methyldopa, HPLC-MS/MS, plasma, stabilization, pharmacokinetics.
Метилдопа (МД - антигипертензивное средство центрального действия. Его активный метаболит, а-ме-тилнорадреналин, является агонистом центральных пресинаптических а2-адренорецепторов. Согласно международным и отечественным рекомендациям данный препарат относится к первой линии лекарственных средств для лечения гипертонии беременных [1, 3].
Существуют методики количественного определения метилдопы в плазме крови с использованием ВЭЖХ с флюориметрическим [2, 3] и масс-спектромет-рическим [1, 4] детектированием, недостатками которых являются длительная пробоподготовка с применением жидкостно-жидкостной экстракции [1, 2, 3] и низкая чувствительность [4]. Также авторами не указан используемый стабилизатор: хорошо известно, что двухатомные фенольные соединения легко окисляются в процессе хранения биологических жидкостей [5].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Разработка новой экспрессной методики количественного определения метилдопы в плазме для
проведения исследования биоэквивалентности, обеспечивающей стабильность определямого вещества при хранении и в ходе выполнения аналитических процедур.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве стандартного образца определяемого вещества была использована метилдопа сесквигидрат (Teva Pharmaceuticals, Израиль), в качестве внутреннего стандарта D,L-Метилдопа-D3 (МД- D3) (TLC Р!^!'^ Chem, Канада) (рис. 1).
Работа выполнена с использованием ВЭЖХ-МС/ МС-системы Shimadzu, оснащенной двумя насосами LC-20AD, автосемплером SIL-20AC с устройством подачей проб Rack Changer II, термостатом колонок СТО-20AC с интегрированным 6-портовым краном FCV-32AH и трехквадрупольным масс-спектрометрическим детектором LCMS-8050.
В качестве раствора стабилизатора применялся водный раствор, содержащий аскорбиновую кислоту в концентрации 50 мг/мл, натрия сульфит - 2 мг/мл,
O
O
HO
HO
А
Б
Рис. 1. Структурные формулы метилдопы (А) и внутреннего стандарта - дейтерированной метилдопы (Б)
Выпуск 3 (63). 2017 = 105
©äSmpfä ©©CöFflM]^
натрия гидрокарбонат - 24 мг/мл. Модельные смеси готовились путем прибавления к 950 мкл бланковой плазмы 50 мкл растворов МД в метаноле. Затем к валида-ционным образцам добавлялся раствор стабилизатора из расчета 0,2 мл раствора стабилизатора на 1 мл плазмы. При этом концентрации аналита в калибровочных образцах составили 0,02; 0,10; 0,25; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50; 3,00 мкг/мл; в образцах КК - 0,02; 0,06; 0,30; 1,20; 2,40; 3,00 мкг/мл.
При пробоподготовке аликвоту плазмы 100 мкл подвергали депротеинизации 400 мкл раствора МД^3 0,125 мкг/мл в метаноле, полученную смесь встряхивали на вортексе в течение 30 с при частоте 2400 мин-1, подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 3500 об./мин и температуре +4 оС. Затем надосадочную жидкость вводили в хроматог-рафическую систему.
Для хроматографического разделения компонентов биологической пробы использовались две хроматографические колонки Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl (50 x 3,0 мм, 5 мкм) и Phenomenex Synergi Fusion - RP 80Ä (150 x 3,0 мм, 4 мкм). Элю-ирование проводили в изократическом режиме с применением подвижной фазы (ПФ) на основе метанола, воды и водного раствора формиата аммония в концентрации 80 ммоль/л. Масс-спектромет-рической детектирование проводилось с применением электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов по следующим MRM-переходам: для МД - 211,95 ^ 138,90 m/z; для МД^3 - 214,95 ^ 169,00 m/z.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование стабильности метилдопы в плазме крови. Предварительная оценка стабильности метилдопы в плазме крови проводилась на модельных смесях с концентрацией 3 мкг/мл без добавления и с добавлением раствора стабилизатора при комнатной температуре и при замораживании до температуры -20 оС (рис. 2, табл. 1). В качестве антикоагулянта был использован К3ЭДТА.
). ,.- 5 , 10 - 15 __20 2J J0
Комн.темп, без стао. —^ТСомн. темй. со стао;
-А— Темп, не выше -20°С без стяб. —Темп, не выпте -20°С со стаб.
Рис. 2. Стабильность метилдопы в плазме крови при комнатной температуре и при замораживании до температуры не выше -20 оС
Таблица 1
Предварительная оценка стабильности метилдопы в плазме крови при комнатной температуре и при замораживании
Комнатная температура
концентрация, % от исходного уровня
Время, ч без добавления с добавлением
стабилизатора стабилизатора
0 100,0 100,0
2,5 77,6 97,1
6 55,1 95,2
12 29,9 93,8
Температура не выше -20 оС
0 100,0 100,0
16 84,0 99,7
24 80,0 100,2
36 77,3 101,9
Таким образом, без стабилизатора метилдопа разлагается: при комнатной температуре за 2,5 часа окисляется 20,4 % от исходного количества лекарственного вещества, а при температуре - 20 оС за 24 часа -22,7 %, что не укладывается в критерии приемлемости (концентрация должна быть в диапазоне 85-115 % от исходной). Добавление раствора аскорбиновой кислоты с натрия сульфитом и гидрокарбонатом к плазме значительно замедлило процесс деградации.
Валидация методики. Валидация разработанной методики была проведена в соответствии с требованиями руководства EMEA [6], Решения Совета Евразийской экономической комиссии № 85 «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза» [7]. Все испытания выполнены с добавлением стабилизатора. Полученные результаты валидационных тестов представлены в таблице 2.
Исследование фармакокинетики метилдопы в форме таблеток, покрытых оболочкой. Разработанная методика прошла апробацию при исследовании фар-макокинетики таблеток, покрытых оболочкой в дозировке 250 мг (препарат «Допегит» производства ОАО «Фармацевтический завод ЭГИС», Венгрия, серия D358N1014), которое было проведено на 12 здоровых добровольцах. Отбор образцов крови осуществлялся до приема препарата и через 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 1 ч 15 мин, 1 ч 30 мин, 1 ч 45 мин, 2 ч, 2 ч 15 мин, 2 ч 30 мин, 3 ч, 4 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 18 ч, 24 ч. Затем образцы крови, не позднее 15 мин после отбора, центрифугировали при температуре +4 оС в течение 5 мин при 3000 об./мин. После этого к полученной плазме добавлялся раствор стабилизатора из расчета 0,2 мл раствора стабилизатора на 1 мл плазмы. Полученные образцы хранились при температуре не выше -20 оС до проведения анализа. Расчет значений основных фармакокинетических параметров осуществлялся с помощью программ Microsoft Excel 2007, StatSoft STATISTICA v. 12 и пакета R, модуль Bear (Lee, Hsin-ya and Lee, Yung-jin, bear: Data Analysis Tool for Average Bioequivalence and Bioavailability) (рис. 4, табл. 3).
Таблица 2
Валидационные характеристики разработанной методики
Валидационный параметр Результаты
Селективность Анализ 6 образцов бланковой плазмы крови (полученной из разных источников) и плазмы, содержащей определяемые вещества, показал, что интерференция в области времен удерживания МД не превышала 20 % от уровня НПКО, а в области времен удерживания МД- Э3 не превышала 5 % от их концентрации (рис. 3)
Нижний предел количественного определения (НПКО) 0,02 мкг/мл (точность 104,20 % от теоретической, прецизионность (С^) -1,59 %)
Линейность Диапазон концентраций: 0,02-3,00 мкг/мл. Коэффициент корреляции 8-точечной калибровочной кривой (г): 0,99772 до 0,99926
Прецизионность и точность Точность: от 94,72 % до 107,42 %; от 0,69 % до 3,97 %
Степень извлечения 63,49 %
Отсутствия влияния разведения (двукратное разведение образцов с концентрацией аналита 4800 нг/мл) 100,21 % (при п = 6), ^ = 1,78 %.
Эффект влияния матрицы NMF** находился в диапазоне от 1,010 до 1,018; С^ от 0,40 до 1,27 %
Стабильность Краткосрочная (24 ч) 95,50 % от номинальной концентрации
Долгосрочная (29 дней) 90,74 % от номинальной концентрации
При замораживании/размораживании 104,43 % от номинальной концентрации
*Коэффициент вариации; **нормализованный фактор матрицы.
МД - т£ - 211,95 ^ 138,90
МД-D3 - m/z - 214,95 ^ 169,00 А Б
Рис. 3. Хроматограммы бланковой плазмы (А) и калибровочного образца МД в концентрации 0,02 мкг/мл (НПКО) (Б)
Таким образом, уровень максимальной концент- (0,02 мкг/мл) ниже, чем 5 % от Стах, и чувствительно-рации метилдопы в плазме крови составил 1,375 мкг/ сти методики достаточно для изучения биоэквивалент-мл (табл. 3), следовательно, выбранное значение НПКО ности ее таблетированных форм [6, 7]. Соотношение
Выпуск 3 (63). 2017
107 ^^^^
Рис. 4. Усредненный фармакокинетический профиль концентрации метилдопы в плазме крови добровольцев после однократного приема таблеток «Допегит» в дозировке 250 мг
Таблица 3
Значения фармакокинетических параметров метилдопы
Cmax, мкг/мл Tmax, ч AUC0-t, мкг • ч/мл AUC0-„, мкг • ч/мл AUC0-t/ AUC0-„, % Cmx/AUCw, ч"1 Kel, ч-1 Т1/2, ч MRT, ч
Ср. знач. ± SD 1,375 ± 0,491 2,75 ± 0,805 6,854 ± 2,262 7,008 ± 2,288 97,65 ± 1,05 0,202 ± 0,033 0,18 ± 0,095 4,848 ± 2,186 5,046 ± 0,583
Min 0,594 1,500 2,901 2,980 95,46 0,163 0,087 2,070 3,890
Max 2,275 4,000 9,490 9,775 99,26 0,268 0,335 8,010 5,730
CV, % 35,69 29,27 33,00 32,64 1,07 16,10 52,55 45,09 11,55
Примечание. Cmax - максимальная концентрация МД в крови; Tmax - время наступления максимальной концентрации препарата; Cmax/AUC - относительная скорость всасывания;Т1/2 - период полувыведения; AUC0-t - площадь под фармакокинетической кривой «концентрация - время» от нулевого значения времени до последнего отбора крови; AUC0^ - площадь под фармакокинетической кривой от элиминации; MRT - среднее время удержания в крови.
АиС0_ - площадь под фармакокинетической кривой от нулевого значения времени до бесконечности; К| - константа
AUC0_t /AUC0_a равнялось 97,65 %, что указывает на достаточную длительность наблюдения. Полученные значения ФК параметров практически совпадают с данными K. Rona, et al. [2], однако в 1,5 раза выше чем значения ФК параметров, рассчитанные в исследовании H. Valizadeh, et al. [3] за исключением периода полувыведения - он в 2,5 раза короче. Это может быть связано с тем, что после отбора образцов крови к плазме не был добавлен стабилизатор, и МД подверглась частичной деградации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Выбранные условия пробоподготовки, хрома-тографического разделения и масс-спектрометрического детектирования позволяют быстро и точно определять концентрацию метилдопы в плазме крови в диапазоне 0,02-3,00 мкг/мл
2. Использованный раствор стабилизатора-антиок-сиданта, содержащий аскорбинововую кислоту в концентрации 50 мг/мл, натрия сульфит - 2 мг/мл и натрия гидрокарбонат - 24 мг/мл, позволяет обеспечить сохранность МД в плазме в течение 29 дней.
3. Методика успешно применена для изучения фармакокинетики таблетированной формы МД и показала свою пригодность для изучения биоэквивалентности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Oliveira C.H., Barrientos-Astigarraga R.E., Sucupira M., et al. // Journal of Chromatography B. - 2002. -Vol. 768 (2). - P. 341-348.
2. Rоna K., Ary K., Renczes G., et al. // European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. - 2001. - Vol. 26 (1-2). -Р 25-30.
3. Valizadeh H., Nemati M., Hallaj-Nezhadi S., et al. // Arzneimittelforschung. - 2010. - Vol. 60 (10). - P. 607-611.
4. Vlase L., Mihu D, Popa D.-S., et al. // Studia Universitatis Babes-Bolyai, Chemia. - 2013. - Vol. 58 (1). - P. 31-41.
5. Dell D. // Chromatographia Supplement. - 2004. - Vol. 59. -Р. 139-148.
6. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft) / European Medicines Agency, 2010.
7. Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза / Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 85, 2016.
REFERENCES
1. Oliveira C.H., Barrientos-Astigarraga R.E., Sucupira M., et al. Journal of Chromatography B. 2002. Vol. 768 (2). P. 341-348.
2. Rona K., Ary K., Renczes G., et al.. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 2001. Vol. 26 (1-2). R. 25-30.
3. Valizadeh H., Nemati M., Hallaj-Nezhadi S., et al.. Arzneimittelforschung. 2010. Vol. 60 (10). P. 607-611.
4. Vlase L., Mihu D., Popa D.-S., et al.. Studia Universitatis Babes-Bolyai, Chemia. 2013. Vol. 58 (1). P. 31-41.
5. Dell D.. Chromatographia Supplement. 2004. Vol. 59. R. 139-148.
6. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft) / European Medi-cines Agency, 2010.
7. Ob utverzhdenii Pravil provedenija issledovanij biojekvivalentnosti lekarstvennyh preparatov v ramkah Evrazijskogo jekonomicheskogo sojuza / Reshenie Soveta Evrazijskoj jekonomicheskoj komissii ot 3 nojabrja 2016 g. no85, 2016.
Контактная информация
Яичков Илья Игоревич - аспирант кафедры фармацевтической и токсикологической химии, Ярославский государственный медицинский университет, e-mail: [email protected]
