CC BY
14
УДК 615.074
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕКСАМЕТИЛЕНДИАМИД £#С-(ЛТ-МОНОСУКЦИНИЛ-£-СЕРИЛ-Ь-ЛИЗИНА) В ПЛАЗМЕ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЭЖХ/МС
О.Г. Грибакина1*, Лопатина Н.Б.2, Е.В. Блынская1, П.О. Бочков1,
Р.В. Шевченко1, А.А. Литвин1, Г.Б. Колыванов1, В.П. Жердев1 , С.Э. Кондаков3
(1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Заку-сова; 2 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет); 3 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет; *e-mail: pron-ox@yandex.ru).
Разработана методика количественного определения гексаметилендиамида бис-(^-моносукцинил-£-серил-£-лизина) (ГСБ-106) в плазме крови крыс методом ВЭЖХ/МС. Методика линейна в диапазоне 50-1000 нг/мл. Установлено, что степень извлечения ГСБ-106 из плазмы крови 82,15%, нижний предел количественного определения составляла 50 нг/мл.
Ключевые слова: гексаметилендиамид бис-^-моносукцинил-£-серил-£-лизин), плазма крови, высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-спектрометрия, количественное определение.
В последнее десятилетие накопилось много данных, свидетельствующих о важной роли изменения уровня нейротрофинов, особенно ней-ротрофического фактора мозга (brain-derived neurotrophic factor; BDNF), в патогенезе депрессий [1, 2]. В связи с этим представляется перспективной стратегия создания на основе низкомолекулярных миметиков BDNF новых веществ, обладающих антидепрессивной активностью при системном введении, и не имеющих побочных эффектов полноразмерного нейротрофина. Ранее в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» на основе структуры четвертой петли BDNF сконструирован и синтезирован низкомолекулярный миме-тик гексаметилендиамид бис-(Ы-моносукцинил-Ь-серил-Х-лизина) (далее ГСБ-106), антидепрессивная активность которого изучена на белых беспородных мышах и крысах [3].
Один из основных этапов разработки нового лекарственного средства заключается в изучении его экспериментальной и клинической фармакоки-нетики. На этом этапе следует установить, какая часть дозы исследуемого вещества всасывается из места введения и подвергается биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Для количественного определения целевых соединений и продуктов их биотрансформации в биоматрице (плазма, сыворотка крови, го-могенаты тканей, моча и др.) широко используется высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрическим детектиро-
ванием (ВЭЖХ/МС). Метод ВЭЖХ/МС использован в нашем исследовании, цель которого состояла в разработке и валидации методики количественного определения ГСБ-106 в плазме крови крыс для последующего изучения его экспериментальной фармакокинетики.
Материалы и методы
Структурная формула исследуемого вещества ГСБ-106 приведена на рисунке. В работе использовали фармацевтическую субстанцию ГСБ-106, синтезированную в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (серия 130516); ацетони-трил («LiChrosolv», «Merck», ФРГ); воду деиони-зованную («LiChrosolv», «Merck», ФРГ); аммония ацетат («Merck», ФРГ); 85%-ю муравьиную кислоту («Acros Organics», РФ); метанол («LiChrosolv», «Merck», ФРГ); аммиак («ч.д.а.», «Сигма Тек», РФ); дихлорметан («ч.д.а.», «Реахим», РФ).
Исследование выполнено на высокоэффективном жидкостном хроматографе с масс-селективным детектором типа «ионная ловушка», модель «Agilent 1200 Series LC/MSD Ion Trap» («Agilent», США), оборудованном системой автоматического ввода пробы, внешним источником ионов с ионизацией электроспреем при атмосферном давлении и управляемом компьютером с системой обработки данных ChemStation (v. 1.0). Условия проведения хромато-масс-спектрометрического анализа были следующие: предколонка «Zorbax Eclipse
Структура ГСБ-10б
XDB-C8» (2,1x12,5 мм, 5 мкм); «Agilent» (США), колонка «Zorbax Eclipse XDB-C18» (2,1x150 мм; 5 мкм), «Agilent», США), температура колонки 30 °С. Режим элюирования - градиент (0 мин - 95%-й раствор «А», 5%-й раствор «Б»; 4 мин - 40%-й раствор « А», 60%-й раствор « Б »; б мин - 95%-й раствор «А», 5%-й раствор «Б»; 10 мин - 95%-й раствор «А », 5%-й раствор «Б»). Состав подвижной фазы: раствор «А» (50 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 5 мл муравьиной кислоты доводили деионизо-ванной водой до общего объема 1,0 л) и раствор «Б» (50 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 5 мл муравьиной кислоты доводили ацетонитри-лом до общего объема 1,0 л), фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм («Sartorius», Германия). Скорость потока подвижной фазы 0,35 мл/мин; тип ионизации -электроспрей (ESI) в режиме положительной ионизации; тип детектирования - режим множественных молекулярных реакций по дочерним ионам с отношением массы к заряду m/z = 432, m/z = 324 и m/z = 129, полученных изолированием и фрагментацией нативного молекулярного иона с отношением массы к заряду m/z =374, что соответствует дважды протонированному молекулярному иону ГСБ-106; объем вводимой пробы 10 мкл. Время удерживания ГСБ-106 составляло 4,3 мин, а время анализа - 10 мин; давление газа-распылителя (азот) 55 psi; скорость
осушающего газа (азот) 10 л/мин; температура осушающего газа 350 °C.
В настоящей методике матрицей для приготовления калибровочных стандартов служила плазма крови крыс, полученных из питомника «Манихи-но» (Московская обл.). Образцы крови получали методом декапитации интактных животных. Плазму крови получали центрифугированием образцов цельной крови при 3500 об/мин в течение 10 мин. Образцы плазмы крови крыс хранили при -50 °C. Для подготовки образцов к анализу использовали метод преципитации белков крови с последующим отделением органической фазы от водной. Плазму крови крыс объемом 100 мкл вносили в пластиковую пробирку типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, добавляли 100 мкл водно-метанольного раствора (соотношение компонентов по объему 1:1), встряхивали на вортексе 30 с. К полученному раствору прибавляли 300 мкл ацетонитрила для преципитации белков плазмы крови, встряхивали на вортексе в течение 30 с. Полученные образцы центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость отделяли, после чего к ней добавляли 800 мкл ди-хлорметана для отделения водного слоя, встряхивали на вортексе 30 с и центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 5 мин. Далее для анализа отбирали 50 мкл верхнего водного слоя. Матричный раствор ГСБ-106 (100 мкг/мл) готовили растворением в воде деионизованной точ-
ной навески (0,0100 г) ГСБ-106 в мерной колбе вместимостью 100 мл.
Калибровочные стандарты для валидации приготовлены путем последовательного разбавления исходного/матричного раствора водой деионизо-ванной. Валидацию методики проводили в соответствии с руководством [4].
Результаты и их обсуждение
Калибровочную кривую строили с помощью семи калибровочных стандартов, охватывающих ожидаемый диапазон концентраций ГСБ-106 в плазме крови крыс (50-1000 нг/мл). Самый низкий стандарт на калибровочной кривой соединения ГСБ-106, равный 50 нг/мл, принят в качестве предела количественного определения. Зависимость величины хроматографического пика от концентрации ГСБ-106 калибровочных стандартов в области измерения методики оказалась линейной в рассматриваемом диапазоне концентраций.
Правильность и воспроизводимость внутри одного аналитического цикла оценивали по результатам параллельных анализов образцов контроля качества с концентрацией ГСБ-106, равной 50, 250 и 1000 нг/мл. Каждый образец контроля качества определяли в шести повторностях. Расчет концентрации контрольных образцов проводили по калибровочной кривой, полученной в составе того же аналитического цикла.
Степень извлечения соединения ГСБ-106 из плазмы крови крыс определяли путем сравнения площадей хроматографических пиков образцов контроля, которые принимали за 100%, с площадями пиков тех же проб, прошедших процедуру пробоподготовки. Измерения каждого уровня концентрации стандартов (низкий - 50 нг/мл, средний - 250 нг/мл и высокий - 1000 нг/мл) проводили в трех повторностях. Установлено, что степень извлечения соединения ГСБ-106 из плазмы крови составила 82,15%.
Для оценки стабильности соединения ГСБ-106 в плазме крови использовали те же контрольные образцы, которые хранили при комнатной температуре и дневном свете после пробопод-готовки в течение 8 ч. Далее проводили анализ образцов вместе со свежеприготовленными образцами в составе одного аналитического цикла. Рассчитанные значения концентрации ГСБ-106 после хранения при комнатной температуре сравнивали со средними значениями концентрации препарата в свежеприготовленных контрольных образцах. Полученные значения должны удовлетворять критерию приемлемости - модуль разницы не должен превышать 15% (таблица). Из данных, приведенных в таблице, следует, что концентрация ГСБ-106 после хранения при комнатной температуре в течение 8 ч удовлетворяет критерию приемле-
Стабильность ГСБ-106 после пробоподготовки и хранения при комнатной температуре в течение 8 ч
Показатель Концентрация стандарта, нг/мл
50 250 1000 50 250 1000
образцы после пробоподготовки свежеприготовленные образцы
Концентрация ГСБ-106, нг/мл 43,33 247,32 981,12 44,34 271,71 978,8
47,82 235,67 1022,47 56,76 276,36 990,4
48,19 239,64 983,42 52,08 261,28 1022,1
42,07 224,00 964,37 48,64 263,32 963,2
49,76 278,92 1014,66 43,09 270,96 1011,7
44,36 233,67 972,34 42,96 257,91 978,6
X 45,92 243,20 989,73 47,98 266,93 990,80
3,08 19,09 23,46 5,60 7,13 22,23
СУ% 6,71 7,85 2,37 11,67 2,67 2,24
Разница, % 4,12 9,49 0,11 - - -
мости, т.е. разница между результатами анализа до и после хранения не превышает 15%.
На основании совокупности полученных результатов можно констатировать, что проведена валидация аналитической методики количественного определения соединения ГСБ-106 в плазме крови крыс методом ВЭЖХ/МС. Нижний предел
количественного определения методики составил 50 нг/мл. Правильность и воспроизводимость результатов анализа с учетом критериев приемлемости соблюдались во всем интервале исследуемых концентраций (50-1000 нг/мл). После пробоподго-товки при комнатной температуре пробы проявили стабильность на протяжении 8 ч.
Работа была поддержана Министерством образования и науки (Госконтракт №14.N08.12.0086).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yu H., Chen Z.Y. // Acta Pharmacol. Sinica. 2011. Vol. 32. P 3-11.
2. Середенин С.Б., Воронина Т.А, Гудашева Т.А., и т.д. // АСа Naturae, 2013. Т. 5 № 3 (18). С. 40-44.
3. Середенин С.Б., Гудашева Т.А. Дипептидные миметики
нейротрофинов NGF и BDNF: Пат. РФ № 2410392, 16.02.2009.
4. Validierung analytischer Verfahren der fictiven Firma "Muster" fur die Arzneimittel-Herstellung (der Bundesverband der Arzneimittel-Hersteller (BAH)). 2004. 132 s.
Поступила в редакцию 10.10.2018 Получена после доработки 12.11.2018 Принята к публикации 15.01.2019
QUANTIFICATION OF HEXAMETHYLENEDIAMIDE BTS-CN-MONOSUCCINYL-Z-SERYL-Z-LYSINE (GSB-106) IN THE BLOOD PLASMA BY HPLC-MS
O.G. Grybakina1*, N.B. Lopatina2, E.V. Blynskaya1, P.O. Bochkov1,
R. V. Shevchenko1, A.A. Litvin1, G.B. Kolyvanov1, V.P. Zherdev1, S.E. Kondakov3
(1 Zakusov Institute of Pharmacology; 2 First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University); 3LomonosovMoscow State University, Faculty of Chemistry;*e-mail: fron-ox@yandex.ru)
The technique of quantitative determination of a new compound, possessing antidepressive activity, GSB-106 in the rat blood plasma was developed and validated. Analysis was performed by HPLC-MS. The method was linear in the range of 50-1000 ng/ml. Recovery of GML-1 was 82,15%. The low limit of quantification was determined as 50 ng/ml.
Key words: GSB-106, blood plasma, HPLC-MS, quantification.
Сведения об авторах: Грибакина Оксана Геннадьевна - науч. сотр. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», канд. биол. наук (рron-ox@yandex.ru); Лопатина Наталья Борисовна - доцент кафедры организации и экономики фармации ФГАОУ ВО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), канд. фарм. наук; Блынская Евгения Викторовна - зав. лабораторией готовых лекарственных форм ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», канд. фарм. наук (eaureus@mail.ru); Бочков Павел Олегович - ст. науч. сотр. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», канд. биол. наук (bok-ov@yandex.ru); Шевченко Роман Владимирович - науч. сотр. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», канд. мед. наук (sauberr@gmail.com); Литвин Александр Алексеевич - вед. науч. сотр. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», докт. биол. наук (litbio-pharm@yandex.ru); Колыванов Геннадий Борисович - вед. науч. сотр. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», докт. биол. наук (7822535@mail.ru); Жердев Владимир Павлович - заведующий лабораторией фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», докт. мед. наук (zherdevpharm@mail.ru); Кондаков Сергей Эмильевич - вед. науч. сотр. кафедры химической кинетики химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. фарм. наук (kse@excite.chem.msu.ru).
