CC BY
58ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
К.О.Миронов, А.Е.Платонов, О.П.Дрибноходова, В.И.Кусева, Г.А.Шипулин
МЕТОДИКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОГРУПП А, B, С И W NEISSERIA MENINGITIDIS МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
Центральный НИИ эпидемиологии, Москва
Цель. Разработка и испытание методики ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК Neisseria meningitidis серогрупп А, B, C и W. Материалы и методы. В исследовании были использованы референсные штаммы и 187 образцов спинномозговой жидкости (СМЖ) от больных менингококковым менингитом. Мультиплексная ПЦР проводилась на приборе с пятью каналами флуоресцентной детекции. Результаты. Проведен анализ специфических серогрупповых локусов генома и дизайн олигонуклеотидов для детекции ДНК всех капсульных менингококков и 4 серогрупп по отдельности. Оптимизированы условия ПЦР; на референсных штаммах показана специфичность и оценена аналитическая чувствительность методики. При исследовании клинических образцов СМЖ обнаружена ДНК следующих серогрупп: А — в 103 образцах (55%), В — в 45 (24%), С — в 30 (16%), W — в 5 (3%). В 4 образцах найдена только ДНК менингококково-го капсульного гена ctrA; предположительно они содержали ДНК других серогрупп. Проведено мультилокусное секвенирование-типирование и выявление антигенных детерминант генов PorA и FetA для 27 образцов ДНК менингококков группы А, а также для ДНК 5 менингококков группы W и 4 негруппируемых. Заключение. Предлагаемая методика позволит проводить серогруппирование не менее 95% штаммов или образцов ДНК, выделенных из СМЖ больных менингококковой инфекцией. В сочетании с другими рекомендованными некультуральными методами генотипирования она должна быть полезной для комплексной характеристики патогенных менингококков.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 35—42
Ключевые слова: Neisseria meningitidis, генерализованная форма менингококковой инфекции, геносерогруппирование, мультилокусное секвенирование-типирование
K.O.Mironov, A.E.Platonov, O.P.Dribnokhodova, V.I.Kuseva, G.A.Shipulin
A METHOD FOR DETERMINATION OF NEISSERIA MENINGITIDIS SEROGROUP A, B, C AND W BY REAL-TIME PCR
Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russia
Aim. Development and testing of a real-time PCR method for detection of Neisseria meningitidis serogroup A, B, C and W DNA. Materials and methods. Reference strains and 187 samples of cerebrospinal fluid (CSF) from meningococci meningitis patients were used in the study Multiplex PCR was carried out in an instrument with 5 channels of fluorescent detection. Results. Analysis of specific serogroup loci of the genome and design of oligonucleotides for the detection of DNA of all the capsule meningococci and 4 serogroups in particular was carried out. PCR conditions were optimized; specificity was shown and analytical sensitivity was evaluated using reference strains. DNA of the following serogroups was detected during study of clinical CSF samples: A — in 103 samples (55%), B — in 45 (24%), C — in 30 (16%), W — in 5 (3%). Only DNA of meningococci capsule gene ctrA was found in 4 samples; presumably, they contained DNA of other serogroups. Multilocus sequence-typing and detection of antigenic determinants of PorA and FetA genes for 27 DNA samples of group A menincococci as well as DNA of 5 group W meningococci and 4 ungroupable was carried out. Conclusion. The method proposed allows to
carry out serogrouping of no less than 95% of strains or DNA samples isolated from CSF of meningococci infection patients. Combined with other recommended non-cultural methods of genotyping, it may be useful for complex characteristics of pathogenic meningococci.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 35-42
Key words: Neisseria meningitidis, meningococci infection generalized form, genoserogrouping, multilocus sequence-typing
ВВЕДЕНИЕ
Neisseria meningitidis — самый частый этиологический агент бактериального менингита [2, 7, 12]. Генерализованные формы менингококковой инфекции (ГФМИ) — ведущая причина смертности детей от инфекционных заболеваний в Российской Федерации. Она входит в число пяти инфекций, характеризующихся наивысшей смертностью среди всех возрастных групп [6].
Согласно современной номенклатуре [17] на основании антигенных свойств кап-сульного полисахарида и характеристик генов, входящих в локус cps и ответственных за синтез капсулы, выделено 12 серогрупп N. meningitidis, причем ГФМИ вызывают только менингококки серогрупп А, В, С, W (ранее обозначавшейся как W135), Х и Y, представители остальных серогрупп (E, H, I, K, L, Z) выделяют из стерильных локу-сов крайне редко [6, 7, 17, 25]. На территории России наиболее распространены се-рогруппы А, В и С, данные о представителях других серогрупп крайне немногочисленны [1, 2].
Основным инструментом микробиологического мониторинга штаммов N. menin-gitidis является определение серогрупп возбудителей, выделенных при ГФМИ, поскольку для разных серогрупп N. meningitidis характерны свои особенности эпидемического процесса. В предыдущих исследованиях было показано, что рост показателя заболеваемости ГФМИ может быть обусловлен циркуляцией на территории гипервирулентных штаммов менингококка. Соотношение менингококков разных серогрупп может меняться в разное время и на разных территориях, и оно, как правило, различно во время эпидемического неблагополучия по сравнению с периодами спорадической заболеваемости [6, 7, 10, 15]. Информация о серогруппах N. menin-gitidis, циркулирующих на наблюдаемой территории, в совокупности с данными о заболеваемости ГФМИ, позволяет планировать иммунопрофилактические мероприятия [6].
Для генетической и антигенной характеристики бактерий вида N. meningitidis применяют серологические и молекулярно-биологические методы типирования. В схему внутривидовой характеристики и обозначения штаммов N. meningitidis, рекомендованную Европейским обществом по изучению менингококковой инфекции (European Meningococcal Disease Society, http://emgm.eu), серогруппирование входит в сочетании с мультилокусным секвенированием-типированием (МЛСТ) и антигенной характеристикой трех вариабельных фрагментов белков PorA и FetA (http:// neisseria.org/nm/typing). Применение метода МЛСТ позволяет проводить объединение штаммов в клональные комплексы и следить за их распространением. Сравнительный анализ результатов типирования менингококков, полученных в разных лабораториях, проводится c помощью базы данных http://pubmlst.org/neisseria/. Запрос в базу данных позволяет идентифицировать впервые выделенный штамм как новый или как уже известный, или как новый штамм, входящий в известный клональный комплекс, эпидемические особенности которого уже описаны [3, 4, 13, 16, 18]. В последние годы развитие технологии массового параллельного секвенирования позволяет проводить характеристику клинических изолятов бактерий, в том числе, менингококков путем их полногеномного секвенирования. Полученные данные вносятся в базу Bacterial Isolate Genome Sequence Database (BIGSdb), где с помощью специального
программного обеспечения аннотируются почти 1000 локусов генома N. meningitidis, которые в дальнейшем могут быть экспортированы в различные форматы: в виде стандартного МЛСТ (по 7 локусам), расширенного МЛСТ (по 20 локусам), рибосо-мального МЛСТ (по 53 локусам), антигенного профиля, профиля антибиотикорези-стентности и др. [18].
Определение серогрупп N. meningitidis может быть проведено с помощью серологических методик, основанных на взаимодействии капсульного полисахарида со специфическими сыворотками. Однако на практике [1] серогруппу менингококка, вызвавшего ГФМИ, не удается определить в высоком проценте случаев (от 12 до 69%, в зависимости от лаборатории). Более эффективно определение серогруппы возбудителя с помощью исследования клинического материала методом ПЦР [15, 21, 22]. Описаны серогруппоспецифические мишени в геноме N. meningitidis [13, 17, 20, 25]. В российской микробиологических лабораториях на практике применяется набор реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis А, B, C-EPh» производства Центрального НИИ эпидемиологии с электрофоретической детекцией результата амплификации, позволяющий идентифицировать ДНК наиболее часто встречающихся на территории России серогрупп менингококка. Широкое внедрение в лабораторную практику ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РРВ) позволяет существенно упростить все процедуры анализа и увеличить пропускную способность исследования, в связи с чем, нами была проведена работа по созданию и испытанию методики в формате мульти-прайм для определения серогрупп А, B, C и W N. meningitidis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для анализа референсных последовательностей фрагментов генов, вовлеченных в биосинтез капсулы менингококка, были использованы опубликованные данные о специфических серогрупповых локусах генома, а также ресурсы GenBank и Primer-BLAST Национального центра биотехнологической информации (США) — http:// www.ncbi.nlm.nih.gov.
Для экспериментов по определению аналитической чувствительности и специфичности были использованы штаммы N. meningitidis различных серогрупп, предоставленные Российским референс-центром по мониторингу за бактериальными менингитами. Апробация методики проводилась на 187 образцах спинномозговой жидкости, полученных от больных ГФМИ, госпитализированных в Клиническую инфекционную больницу № 2 Москвы в период 2007 — 2010 гг. Все образцы СМЖ были охарактеризованы с помощью набора реагентов «АмплиСенс N. meningitidis/H. influenzae/S. pneumoniae-FL» и содержали ДНК N. meningitidis. В качестве метода сравнения при определении серогрупп использован набор реагентов с электрофоре-тической детекцией продуктов амплификации «АмплиСенс Neisseria meningitidis А, B, C-EPh». Выделение ДНК из штаммов и клинических образцов проводили набором «РИБО-преп».
ПЦР-РРВ проводили в формате мультипрайм в объеме 25 мкл. Компоненты реакции смешивали следующим образом: смесь, содержащая праймеры, зонды и ну-клеотидтрифосфаты (0,44 мМ) — 10 мкл; реактивы «Полимераза TaqF» — 0,5 мкл и «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» — 4,5 мкл; выделенная ДНК — 10 мкл. Постановку ПЦР-РРВ проводили на приборе «RotorGeneQ» («Qiagen», Германия).
Все реактивы, а также использованные наборы реагентов для выделения ДНК, постановки ПЦР и детекции результатов амплификации были произведены в Центральном НИИ эпидемиологии.
Генетическая и антигенная характеристика референсных штаммов и образцов, содержащих ДНК N. meningitidis, была выполнена в соответствии с [4, 13]. При определении нуклеотидных последовательностей использованы реактивы и оборудование фирмы «Applied Biosystems» (США). Анализ нуклеотидных последовательностей и результатов генотипирования проводили с помощью биоинформационных ресурсов
сайта http://pubmlst.org/neisseria/. На момент окончания исследования база данных содержала информацию о 21036 типированных образцах (10137 сиквенс-типов) представителей рода Neisseria.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В табл. 1 приведены выбранные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченные зонды для четырех каналов детекции: продукт амплификации, соответствующий серогруппе А, детектируется по каналу «green» (зонд c флуорофором FAM), серогруппе В — по каналу «yellow» (зонд c флуорофором R6G), серогруппе С — по каналу «orange» (зонд c флуорофором ROX), серогруппе W — по каналу «red» (зонд c флуорофором Cy5). По пятому каналу «crimson» (зонд c флуорофором Cy5.5) проводится детекция продукта амплификации фрагмента гена ctrA, являющегося диагностической мишенью в наборе реагентов «АмплиСенс N. meningitidis/H. influenzae/S. pneumoniae-FL», и присутствующего у всех капсулированных менингококков [17, 25]. Постановку ПЦР-РРВ проводили по следующей программе: 95°С — 15 мин. (1 цикл); 95°С — 10 сек / 56°С — 20 сек / 72°С — 10 сек (45 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала на стадии 56°С). Пороговая линия проводилась на уровне 10% от максимального значения флуоресцентного сигнала для каждого канала детекции.
Специфичность методики была проанализирована с использованием референс-ных штаммов N. meningitidis серогрупп А, B, С, E, W, X, Y и Z, а также штаммов других возбудителей бактериального менингита (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae серотипа b, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes). Ложно-отрицательные и ложно-положительные результаты получены не было. Генетические и антигенные характеристики использованных референсных штаммов N. meningitidis опубликованы в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/, идентификационные номера — 20 707 — 20 714. Аналитическая чувствительность для всех четырех серо-групп, оцененная с помощью разведений, приготовленных из соответствующих референсных штаммов, составила 104 копий на 1 мл образца. Значения пороговых циклов для концентрации, соответствующей 104 копий на 1 мл образца, измеренные в десяти повторах, находились в диапазоне от 34 до 38,5.
Клиническая апробация методики проведена на образцах СМЖ, выделенных и поставленных параллельно с набором реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis А, B, C-EPh». Выявлено следующее распределение серогрупп: серогруппа А — 103 образца (55%), В — 45 образцов (24%), С — 30 образцов (16%), W — 5 образцов (3%) и 4
Таблица 1. Праймеры и зонды для определения серогрупп
Серогруппа
Ген и амплиф. фр., п.о.
Назв. олигонук. (конц., мкМ)
5'—3' последовательность
А csaA, 126 п.о. А^ (0,28) АТС-АТС-ТСА-^С-СТТ-АСС^Т^ТГ
^асА., тупА) А^ (0,28) 8Т8^СС-ААС-А88-ТАТ-ТТТ-ТТ8-АТА-в
А^7 (0,08) (FAM)TgC-AgC-AAg-gCT-AgC-TgC-AA(BHQ1) В^ (0,28) TCg-gCT-ggT-AgT-TAT-TAA-TgA-ACC-TC В^ (0,28) ggT-TgA-ggg-TgA-gAg-TAA-Tgg-TgT-AT В^1 (0,08) (R6G)-gAg-gCC-Agg-CCГ-ATA-ATT-CCГ-TTA-ggA-TTT-g-(BHQ1)
С^ (0,36) gCC-gAA-ATT-AAT-TCA-gAA-ATC-AgT-Tg С^ (0,36) TgT-gCA-ggT-Tgg-ATA-gTT-TTg-AgA-A С^ (0,08) (ROX)-AgC-Cgg-gAA-TCg-TTT-CCC-CAA-AAA-AAT-TC-(BHQ2)
W csw, 157 п.о. W-F (0,36) gAC-ATC-AgA-AAg-TgA-ggg-ATT-TCC-A
¡¡шО™ зуп^ W_Y-R (0,36) TgC-CAT-TCC-AgA-AAT-ATC-ACC-AgT
W-Z5 (0,08) (Cy5)CgA-TTg-gAA-TAT(BHQ2)-CAT-ACA-CCA-TgC-CTT-CCA
Примечание. * Жирным шрифтом указано название гена согласно современной номенклатуре [17], в скобках — названия, использовавшиеся ранее.
csb, 127 п.о. (siaD, siaDb, synD)
csc, 153 п.о. (siaD, siaDc, synE)
Таблица 2. Результаты генотипирования образцов, содержащих ДНК N. meningitidis серогрупп А, W, и ctrA-положительных образцов с неопределенной серогруппой
Образец Серогруппа PorA FetA Сиквенс-тип (аллельный профиль) Клональный комплекс
16 изолятов А P1 5-2, 10 F3-5 ST-75 (2, 3, 25, 1, 1, 1, 3) ST-1 comp./subgr. I/II
M980L/09 А P1 5, 2 F3-5 ST-75 (2, 3, 25, 1, 1, 1, 3) «—«
8 изолятов А P1 5-2, 10 F3-5 ST-3349 (2, 3, 282, 1, 1, 1, 3) «—«
M43L/07 А P1. 5-2, 10-67 F3-5 ST-3349 (2, 3, 282, 1, 1, 1, 3) «—«
M12L/07 А P1. 5-2, 10 F3-6 ST-2 (1, 3, 4, 7, 1, 1, 3) «—«
M79L/07 W P1. 22, 26 F3-7 ST-2977 (6, 148, 15, 17, 5, 24, 17) ST-174 comp.
M343L/08 W P1. 5, 2 F1-1 ST-11 (2, 3, 4, 3, 8, 4, 6) ST-11 comp./ET-37 comp.
M360L/08 W P1. 5, 2 F3-7 ST-247 (2, 3, 4, 5, 8, 4, 6) «—«
M873L/09 W P1. 5-2, 10 F1-1 ST-11 (2, 3, 4, 3, 8, 4, 6) «—«
M206L/07 Не опр. P1. 18-1,3 F3-4 ST-3015 (219, 5, 275, 17, 11, 8, 21) Не входит в извести. клон. компл.
M380L/08 Не опр. P1. 5-2, 10-1 F5-5 ST-3342 (8, 5, 6, 17, 8, 31, 8) ST-865 comp.
M357L/08 Не опр. P1. 5-3, 10-4 F3-6 ST-10033 (219, 5, 275, 13, 11, 8, 21) Не входит в извести. клон. компл.
M288L/08 Не опр. P1. 5-1, 10-4 F3-6 ST-92 (3, 7, 4, 37, 8, 18, 21) ST-92 comp.
(2%) ctrA-положительных образца, содержащих ДНК N. meningitidis предположительно других серогрупп. При постановке с набором реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C-EPh» были получены совпадающие результаты за исключением 13 образцов, содержащих по данным ПЦР-РРВ, ДНК менингококков серогрупп А, B и С, но отрицательных при постановке с набором реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C-EPh».
Пять образцов, содержащих ДНК менингококков серогруппы W, 4 ctrA-положительные образца с ДНК неизвестных серогрупп, а также 27 образцов, содержащих ДНК N. meningitidis серогруппы А, были охарактеризованы методом МЛСТ в сочетании с антигенной характеристикой [4]. Результаты генотипирования приведены в табл. 2 и опубликованы в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/, идентификационные номера образцов — 19 475-19 503, 19 709, 19 710 и 20 696.
ОБСУЖДЕНИЕ
Серогруппирование менингококков методом ПЦР развивается как направление с конца 90-х годов [5, 9, 11, 16, 19]. При этом методики, применявшиеся в 12 референтных лабораториях Европы в 2004 г., обладали недостаточной чувствительностью и специфичностью. Контроль качества, проведенный на панели 20 образцов СМЖ, показал, что серогруппы A, B, C, W и Y были верно идентифицированы в 63, 83, 68, 69 и 63% случаев, соответственно [23]. Следует отметить, что применение методики, первоначально разработанной в 2000 г. [9] и использующей набор реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C-EPh», позволяет добиться 98 — 100% специфичности и около 90 — 93% чувствительности при определении серогрупп менингококка по образцам СМЖ.
К 2009 г. была создана мультиплексная ПЦР с электрофоретической детекцией, позволяющая в одной реакции выявлять ДНК наиболее эпидемически значимых серогрупп (А, В, С, W, Х и Y). Методика была испытана на 32 штаммах менингококка и 13 образцах СМЖ [14]. Методика, предложенная в [25], позволяет идентифицировать все 12 серогрупп менингококков, но к настоящему моменту испытана только на штаммах, а не на клинических образцах. Ее аналитическая чувствительность сравнительно невысока, порядка 4x105 копий на 1 мл образца, что типично для недостаточно эффективных вариантов ПЦР с электрофоретической детекцией продукта. Методика ПЦР-РРВ, разработанная в CDC (USA) [24], представляет собой развитие подхода, опубликованного ранее [20], и обладает чувствительностью (от 3x103 до 5x104 копий на 1 мл образца в зависимости от типа мишени), сравнимой с нашей методикой.
Технологически для детекции ДНК менингококка по гену ctrA и определения одной из 6 серогрупп (B, C, Y, A, W и X) в этой методике необходима постановка 3 реакций в формате мультипрайм. Пока ее клинические испытания проведены только на образцах, содержащих ДНК менингококков серогруппы С.
На практике даже в развитых странах Европы и Америки методы ПЦР-диагностики ГФМИ и, в особенности, ПЦР-серогруппирования применяются недостаточно широко и зачастую по устаревшим технологиям [12, 16, 21, 22]. Исключением является Англия, где усилиями Менингококкового референсного отдела в Манчестере ПЦР-диагностика ГФМИ и геногруппирование по ДНК в образцах СМЖ и крови проводятся с 1997 г. [11, 15]. Ежегодно до 700 случаев ГФМИ или около 45% от их общего количества в стране диагностируются исключительно методом ПЦР. Рутинно применяемые методы позволяют идентифицировать ДНК серогрупп B, C, Y, W и A.
Наша методика позволяет проводить одновременное обнаружение 5 мишеней в одной ПЦР-смеси. В результате оптимизации условий ПЦР-РРВ удалось с чувствительностью не хуже 104 копий ДНК N. meningitidis на 1 мл образца детектировать наиболее часто встречающиеся на территории России серогруппы менингококка. Заявленной чувствительности достаточно для серогруппирования клинических образцов СМЖ, полученной от больных менингококковым менингитом [8]. Возможность определения серогрупп данной методикой при отрицательном результате с использованием набора реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C-EPh» в 13 (или 7%) случаях, вероятно, объясняется недостаточной чувствительностью электрофоре-тической методики детекции продукта ПЦР. Значения пороговых циклов для двух из этих образцов составляли 29 и 30,5, а для 11 образцов находились в диапазоне от 32,5 до 37, что свидетельствует о низкой концентрации бактериальной ДНК в СМЖ.
Все образцы, содержащие ДНК N. meningitidis серогруппы W, были истинно отрицательными при постановке с набором реагентов «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C-EPh». Согласно информации, представленной в базе данных http://pubmlst. org/neisseria/, для менингококков серогруппы W наиболее часто определяется принадлежность к следующим клональным комплексам: «ST-11 complex/ET-37 complex» (45%), «ST-22 complex» (33%), «ST-174 complex» и «ST-175 complex» (по 8%), принадлежность менингококков серогруппы W к остальным клональным комплексам выявлена в единичных случаях. При этом менингококки клонального комплекса «ST-11 complex/ET-37 complex» принадлежат преимущественно к серогруппе С (60%) и встречаются у серогруппы W (23%). Менингококки, входящие в клональный комплекс «ST-174 complex», принадлежат преимущественно к серогруппе W (62%), реже — серогруппе Y (22%) и B (14%). Таким образом, МЛСТ образцов, положительных при определении серогруппы W, позволило выявить принадлежность к клональным комплексам, характерным для этой серогруппы.
Образцы, содержащие ДНК N. meningitidis, серогрупповую принадлежность которых определить не удалось, входили в клональные комплексы «ST-865 complex» и «ST-92 complex» (по одному образцу) или не принадлежали к описанным ранее клональным комплексам (2 образца). Клональный комплекс «ST-865 complex» содержит, по данным http://pubmlst.org/neisseria, менингококки серогруппы В (48%) и негруп-пируемые менингококки (22%). Клональный комплекс «ST-92 complex» содержит негруппируемые менингококки (45%) и менингококки серогруппы Y (37%), преимущественно выявляемые от носителей. Представители других серогрупп встречаются в этих клональных комплексах существенно реже. Четыре из 5 штаммов с ST-3015 принадлежали серогруппе Y. Изолят M357L/08 с ST-10033 идентичен по своим генетическим характеристикам российскому референсному штамму REF_Y1065 серогруппы Y. Негруппируемыми менингококками (обозначаются как «NG») могут быть как безкапсульные штаммы, так и штаммы, серогрупповую принадлежность которых определить примененными методами не удалось. В связи с отсутствием культуры фенотипическое (серологическое) определение серогрупп для менингококков, при-сутствоваших в образцах M206L/07, M380L/08, M357L/08 и M288L/08, невозможно. При необходимости их дальнейшая характеристика может быть проведена путем
секвенирования нуклеотидных последовательностей локусов, ответственных за синтез капсулы. Судя по всему, эти менингококки не представляют эпидемической опасности, поскольку их редко выделяют от больных ГФМИ, и по данным МЛСТ они не относятся к известным гипервирулентным клональным комплексам.
Основной вклад в заболеваемость ГФМИ на территории России вносят штаммы менингококков серогрупп А, B и С, выделяемые за последнее десятилетие со средней частотой 34, 28 и 20% в год соответственно. Менингококки других серогрупп встречаются существенно реже — в 1 — 2% [1, 2]. Выявленное в данном исследовании распределение серогрупп несколько отличается от такового в среднем по России, что отражает особенности эпидемического процесса в Москве. Территориальные различия в распределении серогрупп в федеральных округах России были показаны ранее [1]. Относительно высокая доля менингококков серогруппы А, циркулирующих на территории Москвы, не является предвестником осложнения эпидемической обстановки. Результат генотипирования образцов СМЖ данного исследования свидетельствует о том, что все охарактеризованные менингококки принадлежат к клональному комплексу «ST-1 complex/subgroup I/II», как правило, к субгруппе X по классификации [12] и имеют преобладающий генетический профиль «P1. 5-2, 10: F3-5», что типично для наблюдаемой территории в межэпидемический период [3]. Менингококки серогруппы W и менингококки с неопределенной серогруппой были выявлены в 9 случаях (5%), что согласуется с данными многолетнего микробиологического мониторинга: доля неагглютинирующихся менингококков и штаммов редких серогрупп, циркулирующих на территории Москвы в предыдущие годы, не превышала 6% [1].
Применение в лабораторной практике ПЦР-РРВ позволяет сократить время проведения анализа и повысить чувствительность исследования, что существенно при характеристике клинического материала, используемого в ретроспективном исследовании. Использование ПЦР в формате мультипрайм дает возможность увеличить пропускную способность исследования и использовать дополнительные каналы флуоресцентной детекции для определения серогрупп-специфической мишени для менингококков серогруппы W, а также включить в систему положительный внутренний контроль присутствия в исследуемом образце ДНК N. meningitidis.
Таким образом, созданная методика позволяет определять четыре серогруппы N. meningitidis, что должно обеспечить серогруппирование не менее 95% штаммов, выделенных от больных ГФМИ, или образцов СМЖ, содержащих ДНК N. meningitidis. В совокупности с другими основанными на ПЦР подходами для МЛСТ менингококков, определения субтипа по белку PorA и аллеля VR белка FetA [4, 13, 16, 18] использование разработанной методики в лабораторной практике позволяет проводить комплексную характеристику образцов, содержащих ДНК N. meningitidis, без этапа высева возбудителя, что в перспективе должно привести к существенному снижению доли не характеризованных штаммов N. meningitidis, циркулирующих на территории Российской Федерации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Королева И.С., Белошицкий Г.В., Королева М.А. и др. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты в Российской Федерации — десятилетнее эпидемиологическое наблюдение. Эпидемиол. инфекц. бол. Актуальные вопросы. 2013, 2: 15-20.
2. Королева И.С., Демина А.А., Платонов А.Е. и др. Эпидемиологический надзор за гнойными бактериальными менингитами: материалы 20-летних наблюдений. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003, 5 (12): 10-13.
3. Миронов К.О., Платонов А.Е., Королева И.С. и др. Генетическая характеристика московских штаммов Neisseria meningitidis. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2011, 13 (2): 135-148.
4. Миронов К.О., Шипулин Г.А., Королева И.С., Платонов А.Е. Генотипирование Neisseria meningitidis. Эпидемиол. инфекц. бол. 2009, 4: 18-21.
5. Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Королева И.С., Шипулина О.Ю. Перспективы диагностики бактериальных менингитов. Журн. микробиол. 1999, 2: 71-76.
6. Платонов А.Е., Харит С.М., Платонова О.В. Вакцинопрофилактика менингококковой инфекции в мире и в России. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009, 5 (48): 32-46.
7. Покровский В.И., Фаворова Л.А., Костюкова Н.Н. Менингококковая инфекция. М., Медицина, 1976.
8. Родионова Е.Н., Платонов А.Е., Венгеров Ю.Я. и др. Определение концентрации ДНК Neisseria meningitidis методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для оценки тяжести и прогноза течения менингококкового менингита. Эпидемиол. инфекц. бол. 2007, 5: 60-61.
9. Тютюнник Е.Н. Использование полимеразной цепной реакции для диагностики и прогнозирования течения менингитов: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 2001.
10. Achtman M, van der Ende A., Zhu P. et al. Molecular epidemiology of serogroup A meningitis in Moscow, 1969 to 1997. Emerg. Infect. Dis. 2001, 7 (3): 420-427.
11. Borrow R., Claus H., Guiver M. et al. Non-culture diagnosis and serogroup determination of meningococcal B and C infection by a sialyltransferase (siaD) PCR ELISA. Epidemiol. Infect. 1997, 118 (2): 111-117.
12. Brouwer M.C., Tunkel A.R., van de Beek D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 2010, 23 (3): 467-492.
13. Fox A.J., Taha M.K., Vbgel U. Standardized nonculture techniques recommended for European reference laboratories. FEMS Microbiol. Rev. 2007, 31 (1): 84-88.
14. Fraisier C., Stor R., Tenebray B. et al. Use of a new single multiplex PCR-based assay for direct simultaneous characterization of six Neisseria meningitidis serogroups. J. Clin. Microbiol. 2009, 47 (8): 2662-2666.
15. Gray S.J., Trotter C.L., Ramsay M.E. et al. Epidemiology of meningococcal disease in England and Wales 1993/94 to 2003/04: contribution and experiences of the Meningococcal Reference Unit. J. Med. Microbiol. 2006, 55 (7): 887-896.
16. Harrison O.B., Brueggemann A.B., Caugant D.A. et al. Molecular typing methods for outbreak detection and surveillance of invasive disease caused by Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae, a review. Microbiology. 2011, 157 (Pt 8): 21812195.
17. Harrison O.B., Claus H., Jiang Y et al. Description and nomenclature ofNeisseria meningitidis capsule locus. Emerg. Infect. Dis. 2013, 19 (4): 566-573.
18. Jolley K.A., Hill D.M., Bratcher H.B. et al. Resolution of a meningococcal disease outbreak from whole-genome sequence data with rapid Web-based analysis methods. J. Clin. Microbiol. 2012, 50 (9): 3046-3053.
19. Molling P., Jacobsson S., Backman A., Olcen P. Direct and rapid identification and genogroup-ing of meningococci and porA amplification by LightCycler PCR. J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (12): 4531-4535.
20. Mothershed E.A., Sacchi C.T., Whitney A.M. Use of real-time PCR to resolve slide agglutination discrepancies in serogroup identification of Neisseria meningitidis. J. Clin. Microbiol. 2004, 42 (1): 320-328.
21. Munoz-Almagro C., Rodriguez-Plata M.T., Marin S. et al. Polymerase chain reaction for diagnosis and serogrouping of meningococcal disease in children. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2009, 63 (2): 148-154.
22. Papavasileiou K., Papavasileiou E., Tzanakaki G. et al. Acute bacterial meningitis cases diagnosed by culture and PCR in a children's hospital throughout a 9-Yfear period (2000-2008) in Athens, Greece. Mol. Diagn. Ther. 2011, 15 (2): 109-113.
23. Taha M.K., Alonso J.M., Cafferkey M. et al. Interlaboratory comparison of PCR-based identification and genogrouping of Neisseria meningitidis. J. Clin. Microbiol. 2005, 43 (1): 144149.
24. Wang X., Theodore M.J., Mair R. et al. Clinical validation of multiplex real-time PCR assays for detection of bacterial meningitis pathogens. J. Clin. Microbiol. 2012, 50 (3): 702-708.
25. Zhu H., Wang Q., Wen L. et al. Development of a multiplex PCR assay for detection and genogrouping of Neisseria meningitides. J. Clin. Microbiol. 2012, 50 (1): 46-51.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Миронов Константин Олегович, к.м.н.,
111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3А, р.т. (495)974-96-46
