CC BY
82
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИММУНОДИАГНОСТИКЕ И ПРОФИЛАКТИКЕ ОСТРОЙ ФОРМЫ ФАСЦИОЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
С.А. ШЕМЯКОВА кандидат ветеринарных наук
Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, e-mail: sveta11@mail.ru М.Д. НОВАК доктор биологических наук
Рязанский государственный агротехнологический университет им. П.А. Костычева, e-mail: peace100@mail.ru
(Одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 23 сентября 2010 г., протокол № 3)
Фасциолез жвачных животных широко распространен в разных природно-климатических зонах РФ и в других странах мира.
Напряженность эпизоотического процесса обусловлена повсеместным расселением промежуточного хозяина Fasciola hepatica - моллюска малого прудовика и его высокой численностью.
Эпизоотическая ситуация по фасциолезу в разных регионах Российской Федерации подтверждает необходимость проведения комплексных профилактических и оздоровительных и мероприятий.
Своевременная и достоверная диагностика - важный этап оздоровительных мероприятий. Используемые в ветеринарной практике лабораторные методы исследований не позволяют объективно оценить эпизоотическую ситуацию. С помощью метода последовательных промываний и различных модификаций копроовоскопических исследований яйца фасциол обнаруживают в фекалиях 45-50 % зараженных животных (Г.А. Котельников, 1984). В период миграции преимагинальных форм фасциол установить диагноз с использованием вышеуказанных методов прижизненного исследования не представляется возможным.
Поэтому практическое значение в диагностике фасциолеза имеет разработка и применение эффективных иммунореагентов для серологических методов. В последние два десятилетия в Российской Федерации и за рубежом достаточно широко апробированы и используются для обнаружения антигенов гельминтов и антител к ним серологические методы: РДПАГ, РНГА, ИФА, ПЦР и др. Ряд тестов применяется и для диагностики трематодозов -фасциолеза, описторхоза, шистосомоза. Антигены получают из различных компонентов трематод.
В качестве иммунодиагностического теста для выявления животных, зараженных F. hepatica, сотрудниками ВИГИС (В.В. Клименко, 1997 и др.) предложена реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДПАГ). Метод рекомендуется использовать для распознавания острой формы фас-циолеза.
Однако выполненные в этом направлении исследования в Российской Федерации немногочисленны.
Необходимо уделять внимание разработке иммунореагентов и иммуно-диагностических тестов на основе доступного и недорогого источника анти-
гена при условии небольшой трудоемкости, простоты постановки, высокой чувствительности, информативности методов.
Следует учитывать возможность адаптации получаемых диагностических препаратов для общепринятых серологических методов, так как одной из задач является одновременное исследование на фасциолез большого числа животных за непродолжительный период времени.
Методы серологической и аллергической диагностики должны применяться комплексно, планомерно в острый и хронический периоды фасциоле-за, а полученные результаты эпизоотологического мониторинга необходимо рассматривать как важный этап оздоровительных и профилактических мероприятий.
Разработка иммунореагентов для иммуноферментного анализа (ИФА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и сероэпизоотологический мониторинг при фасциолезе и парамфистоматозах крупного рогатого скота
Как показали результаты многочисленных исследований отечественных и зарубежных авторов, соматические антигены, выделенные из тегумента и кутикулы трематод, цестод и нематод, не обладают высокой специфичностью и при их использовании в методах иммунодиагностики отмечают недостоверные (ложноположительные или ложноотрицательные) результаты.
Научный поиск в этом направлении в последние годы завершился успешной разработкой высокоспецифичных антигенов гельминтов на основе их экскреторно-секреторных продуктов, а также путем получения клеточных гибридом на молекулярно-генетическом уровне.
Высокоэффективными антигенами гельминтов, используемыми в иммунодиагностике гельминтозов, являются экскреторно-секреторные (ESAg). Такие антигены можно получать в большом количестве, а методы их препаративного выделения не трудоемки.
Экскреторно-секреторные соматические антигены F. hepatica, Param-phistomum ichikawai и другие иммунореагенты для ИФА и РНГА. С целью получения антигенов для диагностики фасциолеза и парамфистоматозов крупного рогатого скота в ИФА и РНГА проводят культивирование марит F. hepa-tica и P. ichikawai в специальной культуральной среде, представляющей собой 1 %-ный раствор глютамина на фосфатно-солевом буфере с добавлением желчи крупного рогатого скота и глюкозы в конечной концентрации 0,5 %.
Живых подвижных фасциол и парамфистом, полученных при убое крупного рогатого скота из желчных ходов печени и рубца на мясокомбинатах, помещают в термос, предварительно заполненный небольшим объемом культуральной среды (100-150 мл) и доставляют в лабораторию.
В культуральной жидкости половозрелых трематод содержат при температуре 37-38 °С в термостате в течение 15-18 ч. К концу этого времени трематоды проявляют слабую жизнедеятельность, часть из них погибает. Затем марит отделяют, а среду, содержащую антигены фасциол и парамфистомат, фильтруют через капрон и центрифугируют при частоте вращения 25GG мин" в течение 35 мин. Культивирование и другие лабораторные манипуляции проводят отдельно с каждым видом трематод.
Белок, представляющий собой экскреторно-секреторный продукт трематод, выделяют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом против дистиллированной воды на холоде. Все операции выполняют с использованием рефрижератора (от 0 до 4 °С). Фракционирование белка осуществляют на сефадексе G-200. Перед фракционированием обработку белка ферментами не проводят. Для элюции белковых фракций последовательно используют ацетатный (рН 6,2-6,5), карбонатно-бикарбонатный (рН 8,7-9,0) и фосфатный (рН=7,2-7,4) буферы. Элюцию и отбор белковых фракций выполняют с интервалами 5-7 мин. В полученных фракциях экскреторно-секреторных антигенов определяют концентрацию
белка. Оптимальные показатели содержания пептидов в образцах после фракционирования - 70-80 мкг/мл.
В последующем проводят тестирование белковых фракций с иммунными сыворотками кроликов, иммунизированных по разработанным схемам общим экскреторно-секреторным антигеном фасциол (ESAgF F. hepatica). При этом устанавливают фракции с наиболее высокими показателями активности и специфичности, а также с максимальным содержанием белка. Отбор фракции экскреторно-секреторного антигена осуществляют через 20-25 мин с начала фракционирования.
Изучение белковой структуры экскреторно-секреторных продуктов P. ichikawai проводят с использованием таких же методических приемов, как и для ESAgF F. hepatica. Время сбора элюата с начала фракционирования на сефадексе G-200 составляет 15-17 мин.
Первоначально в каждой полученной фракции при помощи спектрофотометра устанавливают концентрацию белка в мкг/мл и в kDa.
Иммунизацию кроликов выполняют с использованием общего белка -экскреторно-секреторного антигена ESAgF (F. hepatica) и ESAgP (P. ichika-wai). После хранения в морозильной камере вышеуказанные антигены центрифугируют при тех же параметрах - 2500 мин-1 35 мин.
Супернатант после первоначального определения концентрации белка используют для приготовления ESAg антигенов фасциол и парамфистом.
Антигены в равном объеме с неполным адъювантом Фрейнда (ланолин + вазелиновое масло) вводят кроликам парентерально по следующей схеме: первый день - 1,2 мл подкожно в шесть участков брюшной стенки (по 0,2 мл), 14-15 дни - 1 мл подкожно дробно в область поверхностных лимфатических узлов (без адъюванта), взятие крови из вены уха и полное обескровливание через 8-12 сут после заключительной инъекции антигена.
Для иммунизации кроликов используют экскреторно-секреторные антигены фасциол и парамфистом с концентрацией общего белка 110 и 85 kDa соответственно. Выполняется скрининг гипериммунных сывороток кроликов с очищенными фракциями ESAgF (F. hepatica) и ESAgP (P. ichikawai) в ИФА и РНГА: специфические антитела к F. hepatica - 1 : 2560-1 : 10240 и 1 : 6401 : 5120 соответственно, к P. ichikawai - 1 : 1280-1 : 5120 и 1 : 1280-1 : 2560.
Специфичность и активность соматических антигенов SomAgF (F. hepatica) и SomAgP (P. ichikawai) при тестировании в ИФА и РНГА значительно меньше: 1 : 320-1 : 1280 и 1 : 80-1 : 160 к IgG фасциол, 1 : 200-1 : 800 и 1 : 40
- 1 : 80 к IgG парамфистом соответственно.
Соматические антигены из фасциол и парамфистом получают путем гомогенизации тегумента половозрелых трематод с последующей обработкой гомогената детергентом «Тритон-Х 100» и центрифугированием при частоте вращения 2500 мин-1 в течение 40 мин. Супернатант (надосадочную жидкость) используют для приготовления антигенов. Выделение очищенных соматических антигенов фасциол и парамфистом, а также их фракций проводят по вышеуказанной методике. В полученных иммунологически активных фракциях фасциол и парамфистом концентрация белка составляет не менее 90-110 и 65-85 kDa соответственно.
Эритроцитарные антигенные диагностикумы для РНГА готовят по способу Бойдена (1951) в модификации Каральника (1981).
Для экспериментальных исследований и производственных испытаний используют сыворотки крови крупного рогатого скота, спонтанно зараженного фасциолами и парамфистомами, с титрами антител в ИФА к F. hepatica -1 : 640-1 : 5120 и к Paramphistomum spp. - 1 : 320-1 : 2560.
Краткая схема технологических операций по приготовлению антигенных иммунореагентов и эритроцитарных диагностикумов для скрининга на фасциолез и парамфистоматозы с помощью РНГА
II стадия. Получение антигенов.
Операция 1. Получение живых фасциол и парамфистом в условиях мясокомбината.
Операция 2. Выделение экскреторно-секреторных антигенов.
Живых фасциол помещают в 1 % глютамин на забуференном физиологическом растворе с добавлением желчи и 0,5 % глюкозы, выдерживают в термостате при температуре 37-38 °С в течение 15-18 ч. Культуральную жидкость, содержащую ESAgF (F. hepatica) и ESAgP (P. ichikawai), фильтруют через капрон и центрифугируют. Супернатант после центрифугирования антигенов используют для выделения иммунологически активных фракций. Параметры центрифугирования приведены выше.
Операция 3. Получение соматических антигенов фасциол и парамфи-стом.
Тегументы половозрелых фасциол и парамфистом гомогенизируют в небольшом объеме фосфатно-солевого буфера с последующей обработкой детергентом и центрифугированием. Надосадочную жидкость используют для приготовления антигена. Параметры разрушения тканей тегумента трематод и центрифугирования антигенов приведены выше.
Операция 4. Выделение очищенных антигенов из экскреторно-секреторных и соматических компонентов фасциол и парамфистом. Основные параметры приведены выше.
III стадия. Приготовление пробных образцов антигенных эритроцитар-ных диагностикумов с использованием ESAgF (F. hepatica) и ESAgP (P. ichikawai).
Операция 1. Получение раствора танина.
5 мг танина растворяют в 100 мл фосфатно-солевого буфера на физиологическом растворе pH 7,2.
Операция 2. Обработка 2,5 % взвеси эритроцитов раствором танина.
Соединяют равные количества взвеси эритроцитов и раствора танина, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин.
Операция 3. Отмывание танизированных эритроцитов.
Эритроциты отмывают в фосфатно-солевом буфере двукратным центрифугированием при частоте вращения 1500 мин-1 в течение 10 мин.
Операция 4. Сенсибилизация танизированных эритроцитов антигеном.
Равные объемы 2,5 % взвеси танизированных эритроцитов и растворов антигенов соединяют и оставляют в термостате при температуре 37 °С на 18 ч.
Операция 5. Добавление формалина к суспензии сенсибилизированных эритроцитов в конечной концентрации 1 % за один час до окончания сенсибилизации.
Операция 6. Отмывание диагностикума.
Диагностикум отмывают центрифугированием. Осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере и трехкратно центрифугируют при частоте вращения 1500 мин-1 10 мин, тщательно перемешивая осадок (сенсибилизированные антигенами эритроциты) с раствором ФСБ после каждого центрифугирования. В заключение объем диагностикума доводят до первоначального. Краткая схема технологических операций по приготовлению иммунореагентов для скрининга на фасциолез и парамфистомоз с помощью ИФА
Схема постановки иммуноферментного анализа включает следующие этапы:
1. В лунки плоскодонных микротитровальных полистироловых пластин вносят по 50-100 мкл раствора антигена в концентрации по белку 20-40 мкг/мл (разведение 1 : 50); инкубирование на первом этапе проводят в течение одного часа при 37 °С или 10-12 ч при 4 °С в холодильнике, в последующем удаляют раствор антигена встряхиванием, лунки промывают раствором фосфатно-солевого буфера с твином рН 7,2-7,4 (ФСБТ) трехкратно по 200 мкл в каждую.
2. Исследуемые сыворотки крови в двукратных разведениях 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160 и т. д. вносят по 50-100 мкл и инкубируют 1,5 ч при 37 °С в термостате, затем удаляют встряхиванием и промывают лунки ФСБТ трехкратно по 200 мкл.
3. Конъюгат против иммуноглобулинов IgG крупного рогатого скота в рабочем разведении 1 : 2000, приготовленный на 50 % нормальной сыворотке крупного рогатого скота или фосфатно-солевом буфере, вносят по 50-100 мкл в лунки и инкубируют 45 мин при 37 °С в термостате; конъюгат удаляют и промывают лунки ФСБТ трехкратно по 200 мкл.
4. Субстрат, содержащий ортофенилендиамин (pH 8,2), растворенный в дистиллированной воде, вносят в лунки по 50-100 мкл; компоненты инкубируют в течение 10-15 мин при комнатной температуре; реакцию останавливают путем добавления равного объема 10%-ного раствора серной кислоты.
Активность и рабочие титры полученных антигенных препаратов устанавливают с использованием иммунных кроличьих сывороток (IgG к ESAg F. hepatica и IgG к ESAg P. ichikawai) в иммуноферментном анализе и в реакции непрямой гемагглютинации. Кроме того, используют позитивные на фасцио-лез и парамфистомоз сыворотки крови от спонтанно зараженных трематодами животных (в острый период болезни, август-октябрь).
Оптимальные рабочие разведения экскреторно-секреторных антигенов, используемые для сенсибилизации полистирола (в ИФА), эритроцитов (в РНГА) и для контроля эритроцитарных диагностикумов в реакции торможения гемагглютинации, следующие: ESAgF для ИФА - 1 : 80, ESAgP для ИФА
- 1 : 50, ESAgF для РНГА - 1 : 40, ESAgP для РНГА - 1 : 20.
Средние оптимальные рабочие разведения соматических антигенов, используемые для сенсибилизации полистирола планшетов и эритроцитов, следующие: SomAgF для ИФА - 1 : 25, SomAgP для ИФА - 1 : 10, SomAgF для РНГА - 1 : 10 и SomAgP для РНГА - 1 : 5.
При иммунологическом скрининге в гомологичной и гетерологичной системах между антигенами F. hepatica и P. ichikawai установлен диагностический титр в ИФА на фасциолез - 1 : 160, на парамфистомоз - 1 : 100, в
РНГА - 1 : 80 и 1 : 50 соответственно.
Чувствительность ИФА и РНГА при фасциолезе крупного рогатого скота составляет 95,5 и 82,6 % соответственно, при парамфистомозе - 88,4 и 82 % соответственно.
На основании сероэпизоотологического мониторинга в комплексе с по-слеубойными исследованиями при фасциолезе крупного рогатого скота в хозяйствах Центрального района Российской Федерации подтверждена высокая диагностическая эффективность ИФА и РНГА, оптимальное соотношение специфичности антигенов и чувствительности методов.
Серологический скрининг при помощи ИФА и РНГА является достоверным как при острой, так и при хронической формах фасциолеза крупного рогатого скота. Серопозитивные результаты исследований наблюдают у де-гельминтизированных животных, в печени которых фасциолы не обнаружены, но установлены патологические изменения, свойственные для фасциоле-за. Показатели серопозитивности сохраняются продолжительный период (4-8 нед), их причиной является сенсибилизация тканей животных экскреторносекреторными антигенами преимагинальных фасциол.
Практические рекомендации
После широкой апробации в хозяйствах Российской Федерации серологические методы диагностики фасциолеза рекомендуется использовать для эпизоотологического мониторинга. Постановку ИФА и РНГА на фасциолез следует осуществлять в областных и межрайонных ветеринарных лабораториях. Иммуноферментный анализ и реакцию непрямой гемагглютинации с экскреторно-секреторными антигенами F. hepatica и P. ichikawai рекоменду-
ется применять как в острый, так и хронический периоды фасциолеза и па-рамфистомоза.
Серологические исследования необходимо проводить в конце пастбищного периода (октябрь), затем после дегельминтизаций (декабрь - январь и апрель).
В племенных хозяйствах в конце лета и осенью рекомендуется дегель-минтизировать животных только с симптомами фасциолеза и серопозитивных в ИФА и РНГА.
Контроль эффективности дегельминтизаций в осенний и зимний периоды следует осуществлять через 30 и 60 сут комплексно с использованием серологического и копроовоскопического (зимой) методов диагностики. Осенью (октябрь-ноябрь) первично положительно реагирующих в ИФА или РНГА животных обрабатывают антигельминтными препаратами, эффективными против преимагинальных фасциол (триклабендазол). Зимой дегельминтизации проводят на основании результатов копроовоскопических исследований, используя антигельминтные препараты, эффективные против половозрелых трематод.
При проведении дегельминтизаций крупного рогатого скота в неблагополучных по фасциолезу хозяйствах необходимо учитывать особенности динамики эпизоотического процесса в различных регионах Российской Федерации.
