CC BY
28
полиморфизма генов, ассоциированных с ожирением (rs 9939609 гена FTO и Trp64rg гена ADRB3), у населения России. Вопросы питания. 2014; (2): 35-41.
5. Бессесен Д.Г., Кушнир Р. Избыточный вес и ожирение. Профилактика, диагностика и лечение. М.: БИНОМ; 2004.
8. ВОЗ, центр СМИ. 2014. Avaiable at: http://www.who.int/me-diacentre/factsheets/fs311/ru/.
9. Тутельян В.А., Гаппаров М.Г., Погожева А.В., Шарафетди-нов Х.Х., Лейдерман И.Н., Сергеев В.Н. и др. Способ определения пищевого статуса больных и методы его коррекции специализированными продуктами лечебного питания в условиях стационарного и санаторно-курортного лечения: методическое письмо. М.: МЗ и СР; 2004.
10. Наставление по физической подготовке и спорту в Вооруженных Силах Российской Федерации (НФП-2001). Введено в действие приказом Министра обороны РФ № 631 от 31 декабря 2000 года. М.: Редакционно-издательский центр Генерального штаба ВС РФ; 2001.
11. МР 2.3.1.2432-08. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации: Методические рекомендации. М.; 2008.
12. Соколов А.И. Методика оценки энергетических затрат организма. Сердце. 2005; (5): 13-5.
References
1. Martinchik A.N., Maev O.O., Yanushevich O.O. Obshchaya Nutritsiologiya [Obshchaya nutritsiologiya]. Moscow: MEDpress-inform; 2005. (in Russian)
2. O'Rahill S. Dietary fat and obesity: an epidemiologic perspective. Endocrinology. 2003; 144 (9): 57-64.
3. Lapik I.A., Sharafetdinov Kh.Kh., Plotnikova O.A., Semenchen-ko I.Yu. Effect of herbal medicine on the performance of the body composition in patients with obesity and diabetes mellitus type 2. Voprosypitaniya. 2013; (1): 53-8. (in Russian)
4. Baturin A.K., Sorokina E.Yu., Pogozheva A.V., Peskova E.V., Makurina O.N., Tutel'yani V.A. Regional features of polymorphisms of genes associated with obesity (rs9939609 FTO gene and gene Trp64rg ADRB3), the population of Russia. Voprosy pitaniya. 2014; (2): 35-41. (in Russian)
5. Bessesen D.G., Kushnir R. Overweight and Obesity. Prevention, Diagnosis and Treatment [Izbytochnyy ves i ozhirenie. Profilakti-ka, diagnostika i lechenie]. Moscow: BINOM; 2004. (in Russian)
6. Bedrosian R.C., Striegel R.H., Wang C., Schwartz S. Association of binge eating with work productivity Impairment, adjusted for other health risk factors. J. Occup. Environ. Med. 2012; 54 (4): 385-93.
7. Bridger R.S., Bennett A.I. Age and BMI interact to determine work ability in seafarers. Occup. Med. (Lond.). 2011; 61 (3): 157-62.
8. WHO media center. 2014. Avaiable at: http://www.who.int/me-diacentre/factsheets/fs311/ru/. (in Russian)
9. Tutel'yan V.A., Gapparov M.G., Pogozheva A.V., Sharafetdinov Kh.Kh., Leyderman I.N., Sergeev V.N. et al. The Method for Determining the Nutritional Status of Patients and Methods of Correction of Specialized Clinical Nutrition Products Under-stationary and Spa Treatment: Methodological Letter [Sposob opredeleniya pishchevogo statusa bol'nykh i metody ego kor-rektsii spetsializirovannymi produktami lechebnogo pitaniya v usloviyakh statsi-onarnogo i sanatorno-kurortnogo lecheniya: metodicheskoe pis'mo]. Moscow: MZ i SR; 2004. (in Russian)
10. Manual on physical training and sports in the Armed Forces of the Russian Federation (NFP-2001). Enacted by the Minister of Defense of Russian Federation N 631 from December 31, 2000. Moscow: Publishing center of the General Staff; 2001. (in Russian)
11. MR 2.3.1.2432-08. The norms physiological needs for energy and nutrients for different groups of the population of the Russian Federation. Methodical recommendations. Moscow; 2008. (in Russian)
12. Sokolov A.I. Methods of assessing energy expenditure of the body. Serdtse. 2005; (5): 13-5. (in Russian)
Поступила 25.11.14 Принята к печати 30.12.14
Методы гигиенических исследований
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 614.7:616.153-074:543.544
ЗайцеваН.В., Уланова Т.С., Нурисламова Т.В., Мальцева О.А.
МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛ-ТРЕТ-БУТИЛОВОГО ЭФИРА В КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнад-зора, 614045, г. Пермь
Рассмотрены методические приемы, используемые в практике разработки и применения методов определения химических соединений в крови для практических инструментальных исследований, в работах по биомониторингу, оценке рисков для здоровья населения. Приведены результаты экспериментальных исследований по разработке газохроматографического метода определения метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ) в крови - методом анализа равновесной паровой фазы и применением капиллярной газовой хроматографии. Обоснованы оптимальные параметры газохроматографического определения метил-трет-бутилового эфира в крови, достигнута высокая чувствительность определения МТБЭ - 0,0059 мкг/см3 при погрешности не более 23%. В процессе идентификации метил-трет-бутилового эфира в образце крови методом масс-спектрометрии установлено наложение нескольких индивидуальных пиков соединений-изомеров с совпадающими временами удерживания, для устранения которого в основной методике рекомендовано использование двух последовательных капиллярных колонок.
Ключевые слова: метил-трет-бутиловый эфир; капиллярная газовая хроматография; метод анализа равновесной паровой фазы; хромато-масс-спектрометрический метод; масс-спектр.
Для цитирования: Зайцева Н.В., Уланова Т.С., Нурисламова Т.В., Мальцева О.А. Методические особенности определения метил-трет-бутилового эфира в крови с использованием хромато-масс-спектрометрии. Гигиена и санитария. 2016; 95 (2): 215-218. DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-2-215-218
дигиена и санитария. 2016; 95(2)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-2-215-218
Zaitseva N.V., Ulanova T.S., Nurislamova T.V., Maltseva O.A.
METHODICAL ASPECTS OF GAS CHROMATOGRAPHY METHOD FOR METHYL TERTIARY BUTYL ETHER DETECTION IN BLOOD WITH THE USE OF CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY
Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm, 614045, Russian Federation
The article describes the methodical ways used in the development and application of methods for methyl tertiary butyl ether detection in blood. The methods are applied in practical instrumental researches, in bio-monitoring studies as well as in public health risk assessment. The results of the experimental researches on gas chromatography (GC) method development for methyl tertiary butyl ether (MTBE) detection in blood by the headspace analysis method with the use of capillary GC have been presented. The optimal parameters of GC detection of MTBE in blood have been validated and the high sensitivity of MTBE detection in amount of 0.0059 fig/cm3 with the inaccuracy not more than 23% has been achieved. While performing the mass-spectrometric identification of MTBE in blood sample the overlap of several individual peaks of adhesions-isomers having identical holding periods was determined to take place. To eliminate this, the use of two sequential capillary columns is recommended in the basic method.
Keywords: methyl tertiary butyl ether; capillary gas chromatography; headspace analysis method; chromate-mass-spectrometric identification; mass-spectrum.
For citation: Zaitseva N.V., Ulanova T.S., Nurislamova T.V., Maltseva O.A. Methodical aspects of gas chromatography method for methyl tertiary butyl ether detection in blood with the use of chromatography-mass spectrometry. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal) 2016; 95(2): 215-218. (In Russ.). DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-2-215-218
For correspondence: Tatyana V. Nurislamova, professor, DSc in Biology, Head of the Gas Chromatography Laboratory; e-mail: [email protected]
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. The study had no sponsorship.
Received 30 April 2014 Accepted 4 June 2015
Введение
В задачах обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации определено, что для осуществления контроля за содержанием токсичных соединений в объектах окружающей среды и биосредах приоритетным направлением является разработка и внедрение в практику современных методов, отвечающих требованиям чувствительности, селективности, высокой точности и достоверности определения [1].
Крупнейшим источником загрязнителей окружающей среды в промышленности РФ являются предприятия топливно-энергетического комплекса (ТЭК), в том числе по добыче и переработке нефти и газа. На их долю приходится около 48% выбросов вредных веществ в атмосферу, 27% сброса загрязненных сточных вод, свыше 30% твердых отходов и до 70% общего объема парниковых газов [2].
В процессе глубокой химической переработки углеводородного сырья (фракций нефти, природного и попутного газа) образуются химические вещества: этилен, пропилен, бутиле-ны, бензол, толуол, этилбензол, стирол, кумол и т. д., в том числе метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ), которые негативно влияют на окружающую среду и обладают широким спектром токсического действия на население.
Метил-трет-бутиловый эфир - кислородосодержащий высокооктановый компонент при получении неэтилированных экологически чистых бензинов. Введение МТБЭ позволяет улучшить экологические свойства топлива, снижает содержание токсичных продуктов в выхлопных газах, увеличивая полноту сгорания углеводородов: введение 2% кислорода в составе оксигената снижает содержание в отработавших газах оксида углерода и углеводородов на 7-10% [3]. Вместе с тем многолетнее применение МТБЭ в составе автомобильных бензинов показало, что он оказывает отрицательное влияние на здоровье человека. При хроническом воздействии МТБЭ возникают бронхиальная астма, кратковременная потеря памяти, головная боль, раздражение кожи, другие токсические проявления со стороны центральной нервной системы, в том числе обусловленное наркотическим эффектом [4]. Доказано, что ведущей системой-мишенью при хроническом воздействии в условиях производства МТБЭ является репродуктивная система мужчин [5].
Для корреспонденции: Нурисламова Татьяна Валентиновна, проф., д-р биол. наук, зав. лаб. методов газовой хроматографии, E-mail: [email protected].
Для определения низких концентраций МТБЭ в крови необходим метод, отвечающий современным требованиям надежности, чувствительности и селективности определений при анализе сложных биологических матриц. Разрабатываемая методика должны быть унифицирована, аттестована и введена в действие нормативными документами и соответствовать методикам, применяемым различными контролирующими органами РФ, а также международному стандарту.
Цель работы - разработка высокочувствительного и селективного метода определения метил-трет-бутилового эфира в крови и идентификация определяемого соединения в образце крови с использованием хромато-масс-спектрометрии.
Материалы и методы
Исследования выполняли специалисты химико-аналитического отдела ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения». Объектами исследований являлись биологическая среда (кровь), стандартные растворы МТБЭ, капиллярные колонки, метрологические характеристики измерительного процесса, способы пробоподготовки крови к анализу, масс-хроматограммы, масс-спектры МТБЭ и сопутствующих соединений.
Исследования крови на содержание МТБЭ выполняли методом капиллярной газовой хроматографии на газовом хроматографе «Кристалл-5000» с детектором ионизации в пламени с применением неполярной капиллярной колонки DB-624 60 м-0,32 мм-1,8 мкм и полярной HP-1 30 м-0,32 мм-0,25 мкм. Для построения градуировочного графика готовили серию стандартных растворов МТБЭ различной концентрации и применяли газохроматографический анализ равновесной паровой фазы (ГХ АРПФ).
Идентификация выполнена при использовании системы газовая хроматография - масс-спектрометрия (ГХ-МС). Хро-матографическое разделение проводили на газовом хроматографе Agilent 7890А с использованием масс-селективного детектора 5975С и капиллярной колонки HP-5MS 30 м-0,250 мм-0,25 мкм. Ионизацию газовых молекул МТБЭ осуществляли методом электронного удара [6]. Поиск характеристических ионов МТБЭ выполняли с помощью банка библиотеки масс-спектральных данных NIST 08.L.
Количественное определение МТБЭ выполняли методом абсолютной калибровки по пяти сериям стандартных растворов в диапазоне концентраций 0,0059-0,050 мг/л. Градуиро-
вочную характеристику признавали стабильной при условии [8, 9]:
|Ст - С| < 0,10 • с,
где С - заданная массовая концентрация МТБЭ в градуировоч-ном растворе; Ст - результат измерения массовой концентрации МТБЭ в образце для градуировки.
Результаты и обсуждение
Для обеспечения селективности метода определения МТБЭ в крови изучены условия разделения эфира с другими углеводородами, с высокой степенью вероятности присутствующими в биосредах, с близкими физико-химическими свойствами на капиллярных колонках с различными характеристиками неподвижных жидких фаз: GasPro 25 м-0,32 мм-0,5 мкм, Ро-raPk>t Q 25 м-0,53 мм-0,5 мкм и DB-624 50 м-0,32 мм-1,8 мкм. Хроматограммы представлены на рис. 1.
Качественное разделение МТБЭ с другими углеводородами, присутствующими в биологической матрице, было достигнуто на капиллярной колонке серии DB-624 50 м-0,32 мм-1,8 мкм.
Оптимальную температуру газохроматографического анализа определяли путем подбора, ориентируясь на температуры кипения и летучесть исследуемого соединения и свойства сорбента капиллярной колонки [7]. В условиях эксперимента были отработаны газохроматографические параметры: Т 50-200 "С расход газа-носителя 32 мл/мин, деление по-
колонки 7 г 7
тока азот:воздух 1:20.
Хроматограмма стандартного раствора МТБЭ с другими углеводородами при отработанных характеристических параметрах представлена на рис. 2.
В процессе исследований по выбору оптимальных условий пробоподготовки образца крови для газохроматографи-
ческого анализа и устранения матричного эффекта изучена эффективность извлечения МТБЭ из крови путем применения ряда неорганических и органических кислот. Установлено, что средняя полнота извлечения МТБЭ с добавлением 5% раствора серной кислоты составила 92,6%.
Для увеличения полноты экстракции проведены дополнительные исследования с использованием различных концентраций серной кислоты и энергичного встряхивания во время экстракции. Установлено, что максимальная степень извлечения (97,97%) МТБЭ из крови методом анализа равновесной паровой фазы достигается при использовании 1% раствора серной кислоты при рН = 2-3, энергичном встряхивании биопробы в течение 10 мин.
Большой спектр токсичных химических соединений, присутствующих в зонах воздействия предприятий химической и нефтехимической промышленности, требует надежной и достоверной идентификации определяемых контаминантов в биологических средах.
С целью подтверждения присутствия в анализируемых образцах близких по характеристикам органических соединений в современных исследованиях рекомендуют подтверждать состав определяемых контаминантов методом масс-спектрометрии [10, 11]. Для идентификации МТБЭ в образце крови методом масс-спектрометрии использовали режим полного сканирования. Было установлено, что на масс-хроматограмме пик со временем удерживания в диапазоне 1,567-1,615 мин является результатом взаимного наложения нескольких индивидуальных пиков соединений-изомеров с совпадающими временами удерживания: 2-метилпентан (время удерживания 1,567 мин), МТБЭ (время удерживания 1,575 мин) и 3-метил-пентан (время удерживания 1,615 мин) (рис. 3 см. на 3-й стр. обложки). Для разделения изомеров предельных углеводородов (2-метилпентан, 3-метилпентан) и МТБЭ
Рис. 1. Хроматограммы стандартного раствора метил-трет-бутилового эфира, полученные на капиллярных колонках с различными неподвижными жидкими фазами: а) колонка РогаРЫ Q 25 м-0,53 мм-0,5 мкм, б) колонка GasPro 25 м-0,32 мм-0,5 мкм, в) колонка ЭБ-624 50 м-0,32 мм-1,8 мкм.
гиена и санитария. 2016; 95(2)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-2-215-218
ПИД-1, мВ
5 10 15 20
Время, мин
Рис. 2. Хроматограмма стандартного раствора метил-трет-бутилового эфира (0,116 мкг/см3), бензола (с = 0,04 мкг/см3) и толуола (с = 1,04 мкг/см3) (время удерживания МТБЭ - 9,7±0,02 мин).
были оптимизированы хроматографические параметры, позволившие достичь селективности относительно присутствующих в пробах органических соединений.
Для устранения недостаточного разрешения в исследованиях использовали специальные колонки, которые позволили разделить изомеры и МТБЭ в образце крови. Применение различных колонок дает возможность по изменению индексов удерживания одних и тех же веществ в анализе определиться с точной идентификацией. Для разделения изомеров и МТБЭ применяли две последовательные ГХ колонки: неполярную колонку с рабочей жидкой фазой на основе полиметилсилок-сана DB-624 60 м*0,32 мм*1,8 мкм и полярную колонку на основе полиэтиленгликоля с высоким разрешением и низким пределом детектирования HP-1 30 м-0,32 мм-0,25 мкм. В этих условиях достигнуто оптимальное разделение изомеров 2-ме-тилпентана, 3-метилпентана и МТБЭ. Время удерживания МТБЭ составляет 11,3 мин.
Таким образом, предложенные методические приемы на этапе пробоподготовки и идентификации образцов крови с использованием хромато-масс-спектрометрии позволяют с высокой степенью точности, селективности и чувствительности выполнять определение МТБЭ в крови в диапазоне концентраций от 0,0059 до 0,059 мкг/см3 при погрешности метода 23%.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литер ату р а
1. Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2010 года и на дальнейшую перспективу: утвержденные Президентом РФ В.В. Путиным 04.12.2003г. (П. 2149). М.; 2003.
2. Булатов А.И., Макаренко П.П., Шеметов В.Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности. М.: Недра; 1997.
3. Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН. Ок-таноповышающие и стабилизирующие оксигенатные добавки к бензинам, получаемые на основе полиолов из возобновляемого сырья. В кн.: Алдошин С.М., Бородин В.А., Варфоломеев С.Д., Гринберг Р.С., Зеленый Л.М., Лаверов Н.П. и др., ред. РАН, Информационный сборник «Важнейшие исследования и разработки научных учреждений РАН в 2011 году, готовые к практическому применению». М.: РАН; 2012: 23-4.
4. Сайфутдинов Р.Г., Трифонова Э.В. Острая токсичность метил-трет-бутилового эфира. Казанский медицинский журнал. 2010; (3): 351-3.
5. Овсянников А.А., Бачинский Р.О. Изучение особенностей гона-дотоксического действия нитробензола и метилтретбутилово-го эфира в условиях холодового стресса. Успехи современного естествознания. 2011; (8): 124-5.
6. Клюев Н.А., Бродский Е.С. Современные методы масс-спектрометрического анализа органических соединений. Российский химический журнал. 2002; XLVI (4): 57-63.
7. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию. М.: «Высшая школа»; 1983.
8. ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. М.; 2002.
9. РМГ 61-2010. ГСОЕИ. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. М.; 2012.
10. Онучак Л.А., Арутюнов Ю.И., Жосан А.И., Дмитриева Е.В., Александрова С.В. Количественная газовая хроматография с жидкокристаллическим сорбентом под действием электрического поля. Вестник Самарского государственного университета. 2009; 6 (72): 149-58.
11. Хатмуллина Р.М., Китаева И.М., Сафарова В.И., Кудашева Ф.Х., Смирнова Т.П. О возможности количественного определения компонентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии при наложении пиков. В кн.: VIIIВсероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика 2011" и Школа молодых ученых, посвященные 300-летию со дня рождения М.В. Ломоносова. Архангельск; 2011: 285.
References
1. Fundamentals of the state policy in the field of chemical and biological security of the Russian Federation for the period up to 2010 and beyond: approved by President Vladimir Putin 04.12.2003g. (P. 2149). Moscow; 2003. (in Russian)
2. Bulatov A.I., Makarenko P.P., Shemetov V.Yu. Environmental Protection in the Oil and Gas Industry [Okhrana okruzhayushchey sredy v neftegazovoypromyshlennosti]. Moscow: Nedra; 1997. (in Russian)
3. N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of Academy of Sciences, A.V. Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis of RAS. Octane and oxygenate stabilizing additive to gasoline produced on the basis of polyols from renewable raw materials. In: Aldoshin S.M., Borodin V.A., Varfolomeev S.D., Grinberg R.S., Zelenyy L.M., Laverov N.P. et al, eds. Russian Academy of Sciences, Information Collection "The Most Important Research and Development of Scientific Institutions of Academy of Sciences in 2011, Ready for Practical Application." [RAN, Informatsionnyy sbornik "Vazh-neyshie issledovaniya i razrabotki nauchnykh uchrezhdeniy RAN v 2011 godu, gotovyekprakticheskomuprimeneniyu"]. Moscow: Russian Academy of Sciences; 2012: 23-4. (in Russian)
4. Sayfutdinov R.G., Trifonova E.V. Acute toxicity of methyl t-butyl ether. Kazanskiy meditsinskiy zhurnal. 2010; (3): 351-3. (in Russian)
5. Ovsyannikov A.A., Bachinskiy R.O. The study features gonado-toxic action nitrobenzene and methyl tertiary butyl ether under cold stress. Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya. 2011; (8): 124-5. (in Russian)
6. Klyuev N.A., Brodskiy E.S. Modern methods for mass spectromet-ric analysis of organic compounds. Rossiyskiy khimicheskiy zhurnal. 2002; XLVI (4): 57-63. (in Russian)
7. Ayvazov B.V. Introduction to Chromatography [Vvedenie v khro-matografiyu]. Moscow: "Vysshaya shkola"; 1983. (in Russian)
8. GOST R ISO 5725-1-6-2002. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Moscow; 2002. (in Russian)
9. RMG 61-2010. State system for ensuring the uniformity of measurements. Accuracy, trueness and precision measures of the procedures for quantitative chemical analysis. Methods of evaluation. Moscow; 2012. (in Russian)
10. Onuchak L.A., Arutyunov Yu.I., Zhosan A.I., Dmitrieva E.V., Alek-sandrova S.V. Quantitative gas chromatography sorbent liquid crystal under an electric field. Vestnik Samarskogo gosudarstvennogo universiteta. 2009; 6 (72): 149-58. (in Russian)
11. Khatmullina R.M., Kitaeva I.M., Safarova V.I., Kudasheva F.Kh., Smirnova T.P. On the possibility of quantifying components in HPLC peaks when applied. In: VIII All-Russian Conference on the Analysis of Environmental Objects "Ecoanalytics 2011" and the School of Young Scientists, Dedicated to the 300th Anniversary of M.V. Lo-monosov [VIII Vserossiyskaya konferentsiya po analizu ob"ektov okruzhayushchey sredy "Ekoanalitika 2011" i Shkola molodykh uchenykh, posvyashchennye 300-letiyu so dnya rozhdeniyaM.V. Lo-monosova]. Arkhangel'sk; 2011: 285. (in Russian)
Поступила 30.04.14 Принята к печати 04.06.15
