CC BY
93
УДК: 616.98:579.88-022.7]-036.87-07-08-031.81-036.1
Методи лабораторноУ дiагностики
•• • 1 ••• • трихомонадно1 шфекци у жшок:
иор1вияиия даних аналiзу лгтератури i3
власними дослщженнями
Туркевич О.Ю., Сизон О.О., Туркевич М.О., 1ванишин З.Т.
Львгвський нацгональний медичний университет Украгнська незалежна 1мунолог1чна лаборатор1я (УШЛАБ), Льв1в
методы лабораторной диагностики трихомонАдной инфекции у женщин: сравнение данных АнАлиза литературы с собственными исследованиями
туркевич А.Ю., сизон о.о., туркевич М.А., иванишин з.т.
Точный, надежный, удобный и недорогой алгоритм диагностики трихомонадной инфекции является актуальной проблемой, поскольку даст возможность как вовремя обнаруживать инфекцию, так и предотвращать ее распространение. На данное время не существует ни одного общепринятого алгоритма для подтверждения диагноза трихомониаз. Стандартным методом для выставления диагноза трихомониаз должна быть световая микроскопия по Романов-скому-Гимза, которая должна проводиться высококвалифицированным врачом-цитологом, и иммуно-флюоресцентная диагностика, а ИФА-диагностику сыворотки крови в абсолютном большинстве случаев проводить нецелесообразно. Очевидно, что без дополнительного изучения этиологии трихомонадних поражений мочеполового тракта ПЛР-метод нельзя рекомендовать для широкого применения. Следует определять уровень рН влагалища, а в случаях, когда рН > 4,5, уделять этому внимание и учитывать в лечении и реабилитации пациенток.
methods of laboratory diagnostics of trichomonas infection in female patients: comparison of the literature data with own study
Turkevych o. Yu., syzon 0.0., Turkevych M.o., Ivanyshyn Z.T.
An exact, reliable, handy and inexpensive algorithm of diagnosing Trichomonas infection is the extraordinarily issue of the day, as it will enable both in time to detect the infection and to prevent its spread. At this moment there is no generally accepted algorithm for confirmation of diagnosis of trichomoniasis. On our opinion, the standard method for the putting forward the diagnosis of trichomoniasis must be a light microscopy by Romanovski-Gimza, which must be conducted by highly skilled doctor-cytologist, connected with immunofluorescent diagnostics, and ELISA diagnostics of the blood is not reliable in absolute majority of cases. Obviously, the additional study of etiology of trichomoniasis is necessary before PCR can be recommended as a method of choice. It is necessary to determine the level of vagina pH, and in cases when pH > 4,5 it is necessary to take it into account in treatment and rehabilitations of the patients.
В ступ. Трихомошаз - одне з найбшьш роз-повсюджених захворювань, що переда-ються статевим шляхом (ЗПСШ); приблизно 167 млн. нових випадюв рееструетъся кожен piK у всьому свт, серед них 8 млн. - у США. Trichomonas vaginalis - шфекщя, що призво-дить до симптомiв вапшту, циститу, викликае цервшальну дисплазда, е одшею з причин перинатально! патологи та передчасних полопв. Окpiм того, трихомошаз збшьшуе ризик пере-дачi вipусних захворювань, як то захворювання, що викликаються вipусами HSV-1/2, CMV, EBV, HPV, а також В1Л. Точний, надшний, зручний i
недорогий алгоритм дiагностики на даний час е надзвичайно актуальною проблемою, оскшьки дасть можливють як вчасно виявляти шфекщю, так i запобпати !! розповсюдженню.
Зараз одним з найточшших i найдешевшим вважаеться мшроскошя нативно! ^orai (wet-mount). Враховуючи особливост трихомонад-но! шфекци, мшроскошю нативно! крапт мож-на вважати високоспецифiчним, але низькочут-ливим методом.
Специфiчнiсть - це здатнють тесту забезпе-чити негативний результат, якщо людина, що тестуеться, дiйсно не е iнфiкованою:
Туркевич О.Ю. та спвав. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОIД1АГНОСТИКИ ТРИХОМОНАДНОI1НФЕКЦ11 УЖ1НОК..
негативш результати
Специф1чн1сть =..................................................................х 100 % .
негативш результати + хибнопозитивш результати
Чутливють - це здатшсть тесту забезпечити туеться, дшсно шфшована: позитивний результат, якщо людина, що тес-
позитивш результати
Чутливють =..................................................................х 100 % .
негативш результати + хибнопозитивш результати
Отже негативний результат не може свщчи-ти про вщсутшсть трихомошазу. Культураль-ний пошв вважаеться найкращим тестом i е так званим «золотим» стандартом. На жаль, куль-туральш середовища не е широко доступними в практичнiй медицинi, хоча б тому, що потре-бують 3-7 днiв для отримання результату. Iншi методи для щентифшаци Trichomonas - це:
- ДНК-технологи - полiмеразна ланцюгова реакцiя (ПЛР, ПЦР (рос), PCR);
- iмуноферментний аналiз (1ФА, ИФА (рос), ELISA);
- реакщя прямо! iмунофлюоресценсi! (Р1Ф, РИФ (рос.), DFA);
- реакцiя непрямо! iмунофлюоресценсi! (РН1Ф, РНИФ (рос), IFA);
- аглютинацшний тест (АТ, АТ (рос), AT);
- св^лова мiкроскопiя з використанням зафарбування (метиленовим синiм, за Ро-мановським-Гiмза, Граммом, Pappenheim, Papanicolaou).
На даний час не юнуе жодного загальнопри-йнятого алгоритму для шдтвердження дiагнозу трихомонiаз.
Мета роботи - проаналiзувати iснуючi методи лабораторно! дiагностики трихомонадно! iнфекцi! згiдно даним лтератури та порiвняти !х ефектившсть з результатами власних дослщ-жень.
Матерiали та методи:
а) база данихMEDLINE за 1998-2008 рр.; по-шук проводився за словами:
- Trichomonas;
- Trichomonas infections;
- Trichomonas vaginalis;
- Trichomonas vaginitis;
ключовi слова для щентифшаци лаборатор-них методiв дiагностики трихомонадно! шфек-цi!:
- Trichomonas diagnostic tests;
- sensitivity;
- specificity;
б) жшки iз вираженими симптомами трихомошазу, iз малосимптомним перебiгом трихомошазу,
3-4 (11)' 2008
в) наступш лабораторш обстеження:
- мшроскошя (wet-mount, свiтлова iз за-барвленням за Романовським-Гiмза, за Граммом, метиленовим сишм, за Папашко-лау, iмунофлюоресцентна),
- IФА-дiагностика на наявнiсть Ig G (ELISA), ПЛР.
Контрольну групу склали 20 здорових ж> нок.
Використовувалось лщензоване програм-не забезпечення для виконання статистичного аналiзу, обладнання та реактиви сертифiковано! лабораторi! УН1ЛАБ (Львiв).
Усi обстежуванi були повнютю прошформо-ванi про те, як саме обстеження !м будуть про-водитися та з якою метою, i дали добровiльну згоду; але абсолютна бшьшють обстежуваних настоювали на повнш анонiмностi, у зв'язку з чим при оформленш данi вшх пацiенток коду-валися .
Результати та Тх обговорення:
Полiмеразна ланцюгова реакцiя. Дослщжу-ваний матерiал забирають одноразовим зондом, переносять у 100 мкл фiзiологiчного розчину, який знаходиться у полiпропiленовiй пробiрцi на 1,5 мл типу «Eppendorf». Для цього матерiал за зондом вмщують у 100 мкл фiзiологiчного розчину, зонд обрiзають; приготовану пробу використовують для видiлення ДНК або збер> гають при температурi - 20°С не бiльше двох тижшв. Далi, внаслiдок багатократно повто-рювальних ци^в з дезоксинуклеозидтрифос-фатiв, вщповщного сольового буфера та олио-нуклеотидних затравок-праймерiв синтезують специфiчну дiлянку НК (240 нуклеотидних пар). Згiдно даним лггератури, чутливiсть складае 95 %, а специфiчнiсть - 98 %; але мiж тим як нашi результати, так i данi лтератури свiдчать про те, що у бшьшосп пацiенток з клiнiкою хрошчного трихомонiазу та пiдтвердженням наявностi збудниюв роду Trichomonas iншими методами, методом ПЛР не було видшено ДНК Trichomonas vaginalis, що свщчить про те, що або кшьюсть збудника недостатня для прове-дення ДНК тестування, або збудники, що викли-
кають клшшу, належать до роду Trichomonas, але е шших видiв, а саме Trichomonas tenax, Trichomonas hominis тощо.
1муноферментний метод. У луночки стрша або планшети додають буфер i вщповщну кшь-кiсть дослiджуваного матерiалу. При iнкубацiï проходить зв'язування антитш з антигеном (антиген повинен бути прикршлений до полiстеру); луночки вщмивають вiд неспецифiчних речовин i додають вiзуалiзуючi антитiла (це антитша до типоспецифiчних антитiл дослiджуваноï речо-вини, кон'югованi з ферментом). При завершен реакцiï додають проявляючу сушш (субстрат для фiксованого ферменту), кольорову реакщю зупиняють стабiлiзатором. Кiлькiсну ощнку ви-явлених антитiл проводять на iмуноферментно-му аналiзаторi. Згiдно даним лггератури, чут-ливiсть складае 82 %, а специфiчнiсть - 73 %.
Результати наших дослщжень показали, що у бшьшост пацiенток з ктшкою як гострого, так i хрошчного трихомонiазу рiвень Ig G до Trichomonas vaginalis не вщповщае даним ш-ших дослiджень та ктшщ захворювання. Також Ig G до Trichomonas vaginalis може виявлятись i у здорових жшок; це свiдчить, що, як мшмум, при вирiшеннi питання дiагнозу трихомонiаз сиворотковi Ig до Trichomonas vaginalis не е по-казником, на основi якого можна беззаперечно виставляти дiагноз. Очевидно, е сенс спробу-вати визначати наявнiсть специфiчних Ig G до T. vaginalis у вапнальному секретi, i, можливо, це зiграе iстотну роль у встановленш дiагнозу у випадках малосимптомного протiкання.
Реакцiя непрямоï iмунофлюоресценцiï:
- висушений на повiтрi матерiал фшсують у 96-вiдсотковому етиловому спиртi 5 хв.;
- на фiксований препарат наносять 30 мкл антитрихомонадно1' сироватки i помiщають у вологу камеру при 37° на 15 хв.;
- скло промивають у проточнш водi 2 хв, сполiскують дистильованою водою, висушують на повiтрi;
- наносять 30 мкл ФПЦ^чених антитш;
- скло помщають у вологу камеру при 37° на 15 хв.;
- скло промивають у проточнш водi 2 хв, сполюкують дистильованою водою, висушують на повггрц
- на висушений мазок наносять краплю мон-туючо1' рщини, прикривають покривним склом, наносять зверху краплю нефлюоресцентного масла i мшроскопують у люмшесцентному мiкроскопi, використовуючи об'ектив 90х, окуляр 4-7 х, у св^ловому потоцi з довжиною хвит, не бiльше 490 нм, i емюю з довжиною хвил^ не бiльше 520 нм.
Зпдно даним лiтератури, чутливiсть складае
85 %, а специфiчнiсть - 99 %. Приблизно таю ж даш отримали i ми, але все ж таки були досить часто випадки, описаш вище (стосовно ПЛР-дiагностики), що свiдчить про те, що, очевидно, мае мюце шфшування iншими видами роду Trichomonas, яю, маючи той же ж танк-ефект, що i Trichomonas vaginalis, не визначаються тестами яю спрямованi на визначення Trichomonas vaginalis.
Методи св^ловоТ мжроскопп
Забарвлення метиленовим ситм. Висушений на повiтрi препарат, фiксують 96-вщсотко-вим спиртом або сумшшю Нiкiфорова протя-гом 3 хв., шдсушують, наносять на нього 1-вщ-сотковий розчин метиленового синього на 1 хв., змивають водою, висушують та
Забарвлення за модифшованим методом Гра-ма. Препарат накривають смужкою фшьтруваль-ного паперу, на який наливають 1-вщсотковий розчин кристалвiолету на 1 хв.; пашр знiмають, промивають водопровiдною водою i заливають розчином Люголя, витримують декшька секунд до потемнiння мазка. По^м розчин Люголя змивають i знебарвлюють, занурюючи у 96-вщ-сотковий етиловий спирт. Знебарвлення ощню-ють вiзуально i припиняють його, коли з бшьш тонких дiлянок препарату перестають стiкати струмочки фарби i мазки в цьому мющ набува-ють блiдо-сiрого забарвлення; препарат швидко змивають проточною водою i заливають 1-вщ-сотковим розчином нейтрального червоного (або 1-вiдсотковим водним розчином сафраш-ну) на 1 хв., змивають водопровщною водою, висушують. Як нашi данi, так i даш лтератури показали, що з метсдов свiтловоï мiкроскопiï, на загал досить ефективних, цi два е найменш чут-ливi та специфiчнi, i, очевидно, не мае сенсу ви-користовувати ix для дiагностики трихомонiазу.
Виявлення трихомонади у нативному препарата На пiдiгрiте предметне скло наносять краплю теплого iзотонiчного розчину хлориду натрда, розмiшують, накривають покривним склом i спостерпають тд мiкроскопом (об'ектив 40х, окуляр 10х), краще з фазово-кон-трастною приставкою i об'ективом. Як ми пе-реконалися, це - високоспецифiчний, але низь-кочутливий метод, а отже негативний результат не може свщчити про вщсутшсть триxомонiазу; окрiм цього, вимагае безпосереднього виконан-ня вiдразу пiсля забору матерiалу, а отже до-статньо часто його е складно виконати.
Забарвлення по Папанiколау. Пiсля взяття мазок негайно фшсують у 95-вщсотково-му спирт протягом 30-45 хв. у спещально-му контейнерi. У лаборатори препарат 10-15
Туркевич О.Ю. та спвав. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОÏД1АГНОСТИКИ ТРИХОМОНАДНОÏ НФЕКЦН УЖ1НОК..
раз1в опускають у спирт низхщно! концентра-ци - 95°, 80°, 70°, 50°, прополюкують у проточ-нш вод^ забарвлюють гематоксилш еозином 2 хв. i знову промивають проточною водою. Препарат помщають у слабкий розчин соляно! кислоти на 10 с. (1 крапля HCl на 50 мл. дис-тильовано! води). Пiсля цього препарат помщають у спирт висхщно! концентраци - 50°, 70°, 80°, 90°, 100°. Забарвлюють розчином ОГ-6 (оранж) протягом 3 хв., помщають на 1 хв. у 95-вщсотковий спирт. Тодi забарвлюють барв-ником ЕА-50 протягом 3 хв., знову помщають у 95-вщсотковий i 100-вiдсотковий спирт на 1 хв. (у кожний), далi - у ксилол I на 5 хв., ксилол II - на 10 хв. Пюля забарвлення вологий препарат накривають покривним склом з вико-ристанням малшолу. Як за даними аналiзу лте-ратури, так i за нашими практичними даними метод високоефективний та специфiчний, але трудо- i часомiсткий.
Забарвлення за методом Романовського-Пм-за. Висушений на повiтрi препарат фiксують 1-2 хв. етиловим спиртом, занурюють у фарбу Романовського-Пмза на 5-6 хв., промивають водопровщною водою, висушують на повггрь За нашими практичними даними, метод високо-ефективний та специфiчний.
При мшроскопи позитивнi результати були отриманi:
- у 85 % забарвленого за Романовським-Лм-за препарату;
- у 86 % забарвленого за Папашколау (PAP) препарату (але, як вже зазначалося, ця методика набагато бшьш трудо- та часомютка, шж забарвлення за Романовським-Пмза);
- у 71 % - при мшроскопи нативного препарату;
- у 51 % - при мкроскопи препарату, забарв-леного за Граммом;
- у 42 % забарвленого метиленовим сишм препарату.
Висновки
Ми провели систематичний лтературний огляд дiагностичних тестiв та систематичний практичний аналiз найбiльш поширених ме-тодiв лабораторно! дiагностики трихомошазу. 1деальний метод лабораторно! дiагностики повинен мати високу чутливють, специфiчнiсть i бути легко доступним, простим для виконання i недорогим. Зараз для дiагнозу трихомонiазу нативна крапля - найдешевший для виконан-ня метод; все ж його чутливють незадовшьна. ПЛР для дiагнозу трихомонiаз мае високу чутливють i специфiчнiсть, але вище були зазна-ченi недолши методу. Очевидно, що без до-даткового вивчення етiологi!' трихомонадних уражень сечостатевого тракту цей метод не можна рекомендувати для широкого вжитку. Виявлення нежиттездатних органiзмiв у па-цiенток, що ранiше лiкувались, недоступнють для бiльшостi установ, неефективнiсть у плат мониторингу вилiкуваностi в коротю промiжки часу - це тшьки деякi з недолiкiв технiки ПЛР. У майбутньому, кшькюний метод ПЛР, можли-во, вирiшить багато з цих проблем, але, як вже зазначалось, - тшьки пюля додаткового вивчення етюлоги трихомонадних уражень сечостатевого тракту. Iншi методи, як, наприклад, 1ФА дае нижчу чутливють. Наше дослщження пока-зуе, що на даний момент стандартним методом для виставлення дiагнозу трихомонiаз мае бути
Л1ТЕРАТУРА
1. Gerbase A.C., Rowley J.T., Mertens T.E. Global epidemiology of sexually transmitted diseases // Lancet. - 1998. - Vol. 351. - P. 2-4.
2. World Health Organization. Report on the
св^лова мшроскошя за Романовським-Пмза, яка повинна проводитися висококвалiфiкованим лшарем-цитологом, поеднана з iмунофлюорес-центною мшроскошею, а культуральш методи та ДНК-технологи е сенс використовувати лише в найбшьш сшрних випадках, чи, для прикладу, з метою точного визначення виду збудника при старих, малосимптомних захворюваннях. Що стосуеться IФА-дiагностики сироватки кровi, то в абсолютнiй бшьшосп випадкiв !! прово-дити недоцшьно. У подальших дослiдженнях ми спробуемо проаналiзувати статистичну до-стовiрнiсть визначення наявносп специфiчних Ig G до T. vaginalis у вагшальному секрет^ i, можливо, це зiграе ютотну роль у встановленнi дiагнозу у випадках малосимптомного протшан-ня, а також дозволить дещо iнакше шдходити до постановки дiагнозу трихомонiаз. О^м цього, слiд зазначити, що при будь-яких проявах вап-нальних розладiв у жiнок, як то видшення, свер-бiж, печiя, обов'язково слщ визначати рiвень pH пiхви, а у випадках, коли pH > 4,5 придшяти ць-ому увагу та враховувати в л^ванш й реабш-тацi! пацiенток.
Автори висловлюють вдячнiсть Укра!нськiй незалежнiй iмунологiчнiй лаборатори УН1ЛАБ (Львiв) за надану тдтримку (сертифiковане об-ладнання та реактиви) у проведенш вищеописа-них дослщжень
global HIV/AIDS epidemic June 1998 - HIV and AIDS: the global situation. - 1998. -http://www.who.int/emchiv/global_report/rep_ html/report2.html
3-4 (11)' 2008
Дерматовенерология. Косметология. Сексопатология
3. Petrin D., Delgaty K., Bhatt R., Garber G. Clinical and microbiological aspects of Trichomonas vaginalis // Clin. Microbiol. Rev. - 1998. -No 11. - P. 300-317.
4. Gram I.T., Macaluso M., Churchill J., Stalsberg H. Trichomonas vaginalis (TV) and human papillomavirus (HPV) infection and the incidence of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) grade III // Cancer Causes Control. -1992. - No 3. - P. 231-236.
5. Manual of Clinical Microbiology / Ed.: Murray P. - Washington: American Society for Mibrobiology; 1999. - P 1346-1347, 14011403.
6. Bickley L.S., Krisher K.K., Punsalang A. Jr., Trupei M.A., Reichman R.C., Menegus M.A. Comparison of direct fluorescent antibody, acridine orange, wet mount, and culture for detection of Trichomonas vaginalis in women attending a public sexually transmitted diseases clinic // Sex. Transm. Dis. - 1989. - Vol. 16. -P. 127-131.
7. Wiese W.J., PatelS.R., PatelS.C., OhlC, Estrada C.A. A meta-analysis of the Papanicolaou smear and wet mount for the diagnosis of vaginal trichomoniasis // Am. J. Med. - 2000. - Vol. 108. - P. 301-308.
8. Centers for Disease Control and Prevention. 1998 Guidelines for treatment of sexually transmitted diseases // MMWR. - 1998. - Vol. 47 (RR-1). - P. 70.
9. Irwig L., Tosteson A.N., Gatsonis C. et al. Guidelines for meta-analyses evaluating diagnostic tests // Ann. Intern. Med. - 1994.
- Vol. 120. - P. 667-676.
10. Cochrane Methods Working Group on Systematic Review of Screening and Diagnostic Tests: Recommended Methods. - 1996. - http:// som.flinders.edu. au/fusa/cochrane/.
11. Boeke A.J., Dekker J.H., Peerbooms P.G. A comparison of yield from cervix versus vagina for culturing Candida albicans and Trichomonas vaginalis // Genitourin. Med. - 1993. - Vol. 69.
- P. 41-43.
12.Sharma P., Malla N., Gupta I., Ganguly N.K., Mahajan R.C. A comparison of wet mount, culture and enzyme linked immunosorbent assay for the diagnosis of trichomoniasis in women // Trop. Geogr. Med. - 1991. - Vol. 43.
- P. 257-260.
13.Jeremias J., Draper D., Ziegert M. et al. Detection of Trichomonas vaginalis using the polymerase chain reaction in pregnant and nonpregnant women // Infect. Dis. Obstet. Gynecol. - 1994. - No 2. - P. 16-19.
14.Krieger J.N., Tam M.R., Stevens C.E. et al. Diagnosis of trichomoniasis. Comparison of conventional wet-mount examination with
cytologic studies, cultures, and monoclonal antibody staining of direct specimens // JAMA.
- 1988. - Vol. 259. - P. 1223-1227. 15.Schmid G.P., Matheny L.C., Zaidi A.A., Kraus
S.J. Evaluation of six media for the growth of Trichomonas vaginalis from vaginal secretions // J. Clin. Microbiol. - 1989. - Vol. 27. -P. 1230- 1233.
16.de Carli G.A., Bertschinger B., Saraiva P.J., Miron C.F. Laboratory diagnosis of Trichomonas vaginalis among women attending a venereal diseases control division. First report // Rev. Latinoam. Microbiol. - 1987. - Vol. 29.
- P. 301-303.
17. Watt R.M., Philip^ A., Wos S.M., Sam G.J. Rapid assay for immunological detection of Trichomonas vaginalis // J. Clin. Microbiol.
- 1986. - Vol. 24. - P. 551-555.
18.Philip A., Carter-Scott P., Rogers C. An agar culture technique to quantitate Trichomonas vaginalis from women // J. Infect. Dis. - 1987.
- Vol. 155. - P. 304-308.
19.Spence M.R., Hollander D.H., Smith J., McCaig L., Sewell D., Brockman M. The clinical and laboratory diagnosis of Trichomonas vaginalis infection // Sex. Transm. Dis. - 1980. - Vol. 7.
- P. 168-171.
20.SmithR.F. Detection of Trichomonas vaginalis in vaginal specimens by direct immunofluorescence assay // J. Clin. Microbiol. - 1986. - Vol. 24.
- P. 1107-1108.
21.Imandel K., Aflatoni M., Behjatnia Y. Clinical manifestations of female trichomoniasis and comparison of direct microscopy and culture media in its diagnosis // Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales. - 1985. - Vol. 78. - p. 360-367.
22.Thomason J.L., Gelbart S.M., Sobun J.F., Schulien M.B., Hamilton P.R. Comparison of four methods to detect Trichomonas vaginalis // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol. 26. - P. 18691870.
23.Mason P.R. Serodiagnosis of Trichomonas vaginalis infection by the indirect fluorescent antibody test // J. Clin. Pathol. - 1979. - Vol. 32. - P. 1211-1215.
24.Su K.E. Antibody to Trichomonas vaginalis in human cervicovaginal secretions // Infect. Immun. - 1982. - Vol. 37. - P. 852-857.
25. Weinberger M.W., Harger J.H. Accuracy of the Papanicolaou smear in the diagnosis of asymptomatic infection with Trichomonas vaginalis // Obstet. Gynecol. - 1993. - Vol. 82.
- P. 425-429.
26.Romia S.A., Othman T.A. Detection of antitrichomonal antibodies in sera and cervical secretions in trichomoniasis // J. Egypt. Soc. Parasitol. - 1991. - Vol. 21. - P. 373-381.
