CC BY
63
15. Nikolayev V. G., Mikhaylovskiy S. V., Gurina N. M. Sovremennyye enterosorbenty i mekhanizmy ikh deystviya [Modern enterosorbents and mechanisms of their action]. Efferentnaya terapiya [Efferent therapy], 2005, vol. 11, no. 4, pp. 3-17.
16. Panfilova V. N., Taranushenko T. E. Primeneniye enterosorbentov v klinicheskoy praktike [The use of enterosorbents in clinical practice]. Pediatricheskaya farmakologiya [Pediatric Pharmacology], 2012, vol. 9, no. 6, pp. 34-39.
17. Pakhnov D. V., Kuchin Yu. V., Odishelashvili G. D. Sposob likvidatsii bol'shikh polostey posle ekhinokok-kektomii pecheni [Way of elimination of big cavities after a liver echinococcectomy]. Astrakhanskiy meditsinskiy zhurnal [Astrakhan Medical Journal], 2014, vol. 9, no. 3, pp. 118-122.
18. Ramazanov M. V., Butyrina E. V., Kchibekov E. A. Analiz korrelyatsii ferroproteinov pri rasprostranennom peritonite [The analysis of ferroproteins correlation in the distributed peritonitis]. Astrakhanskiy meditsinskiy zhurnal [Astrakhan Medical Journal], 2011, vol. 6, no. 1, pp. 96-99.
19. Saveliev V. S., Gelfand B. R., Filimonov M. I. Peritonit: Prakticheskoe rukovodstvo [Peritonitis: A Practical Guide]. Moscow, Litterra, 2006, 208 p.
20. Khitar'yan A. G., Miziev I. A., Glumov E. E., Karpova I. O., Kovalev S. A., Orekhov A. A. Sovremennye aspekty khirurgicheskogo lecheniya ostroy obturatsionnoy tolstokishechnoy neprokhodimosti opukholevogo geneza [Modern aspects of the surgical treatment of acute obstructive colonic obstruction of tumor origin]. Krymskiy zhurnal eksperimental'noy i klinicheskoy meditsiny [Crimean Journal of Experimental and Clinical Medicine], 2015, vol. 5, no. 4 (20), pp. 48-54.
21. Tsuleiskiri B. T., Yartsev P. A., Osipova N. P, Durnov N. M. Zond dlya vypolneniya lavazha tolstoy kishki [Probe for colon lavage]. Patent RF for utility model, no. 132354, 2013.
22. Tsuleiskiri B. T., Yartsev P. A., Kirsanov I. I., Levitskiy V. D., Petrov D. I. Drenazh dlya drenirovaniya polostey s vyazkim, neodnorodnym soderzhimym i gaza [Drainage for the drainage of cavities with viscous, inhomoge-neous contents and gas]. Patent RF, no. 2621590, 2017.
23. Yartsev P. A., Tsuleiskiri B. T., Levitskiy V. D., Kirsanov I. I., Pinchuk T. P., Savel'yeva N. S. Zond dlya vypolneniya lavazha tolstoy kishki [Probe for colon lavage]. Patent RF for utility model, no. 124550, 2012.
24. Conrad J. K., Ferry K. M., Foreman M. L., Gogel B. M., Fisher T. L., Livingston S. A. Changing management trends in penetrating colon trauma. Dis. Colon. Rectum, 2000, vol. 43, no. 4, pp. 466-471.
14.01.09 - Инфекционные болезни (медицинские науки)
14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика (медицинские науки)
УДК 578.5:579.61 DOI 10.17021/2018.13.4.99.107 © Е.О. Рубальский, Т.С. Чехляева, Н.Т. Тихонова, СВ. Шульга, ТА. Мамаева, М.А. Наумова, В.А. Алешкин, 2018
МЕТОД УНИВЕРСАЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ РНК-СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ ДЛЯ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА КОРИ
Рубальский Евгений Олегович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспот-ребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-961-798-37-53, e-mail: e.o. rubalsky@gmail. com.
Чехляева Татьяна Сергеевна, младший научный сотрудник лаборатории прикладной иммунохимии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Тихонова Нина Тимофеевна, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории прикладной иммунохимии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: [email protected].
Шульга Сергей Викторович, заведующий лабораторией прикладной иммунохимии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Мамаева Тамара Алексеевна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории прикладной иммунохимии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Наумова Марина Александровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории прикладной иммунохимии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Алешкин Владимир Андрианович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный руководитель, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: [email protected].
Современные методы высокопроизводительного секвенирования позволяют получать информацию как о полноразмерных нуклеотидных последовательностях геномов вирусов, так и о метагеномах. Был апробирован метод универсальной подготовки образцов, имеющих в качестве мишеней РНК-содержащие вирусы, и проведено высокопроизводительное секвенирование с использованием подходов метагеномики. На примере изолятов вируса кори показана возможность секвенирования образца с получением данных, достаточных для генотипи-рования вируса. Для получения полноразмерных нуклеотидных последовательностей необходимо проведение секвенирования с большей производительностью или дополнительной очистки образца от РНК культуры клеток.
Ключевые слова: высокопроизводительное секвенирование, секвенирование РНК, секвенирование вирусов, вирус кори, молекулярная эпидемиология.
METHOD OF UNIVERSAL PREPARATION OF RNA-VIRUSES FOR HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING THROUGH THE EXAMPLE OF MEASLES VIRUS ISOLATES
Rubalskii Evgenii O., Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate, Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, tel.: +7-961-798-37-53, e-mail: [email protected].
Chekhlyaeva Tatyana S., Junior Research Associate, Laboratory of Applied Immunochemistry, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, tel.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Tikhonova Nina T., Dr. Sci. (Biol.), Professor, Chief Research Associate, Laboratory of Applied Immunochemistry, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: (495) 452-18-16, e-mail: [email protected].
Shulga Sergei V., Head of Laboratory of Applied Immunochemistry, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, tel.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Mamaeva Tamara A., Cand. Sci. (Biol.), Leading Research Associate, Laboratory of Applied Immunochemistry, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, tel.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Naumova Marina A., Cand. Sci. (Med.), Senior Research Associate, Laboratory of Applied Immunochemistry, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, tel.: (495) 452-28-26, e-mail: [email protected].
Aleshkin Vladimir A., Dr. Sci. (Biol.), Professor, Honored Scientist, Scientific Director, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: +7 (495) 452-18-16, e-mail: [email protected].
Modern methods of high-throughput sequencing allow obtaining data both about full-length nucleotide sequences of viral genomes and about metagenomes. We have tested a method of universal preparation of samples which contain RNA viruses as targets and conducted high-througput sequencing using metagenomic approaches. Through the example of the measles virus isolates the possibility of the samples sequencing with obtaining data enough for the virus
genotyping has been shown. To obtain full-length genome sequences a higher throughput sequencing or an additional purification of the sample from a cell culture RNA is necessary.
Key words: high-throughput sequencing, RNA sequencing, sequencing of viruses, measles virus, molecular epidemiology.
Введение. Генетическая характеристика вирусов кори дикого типа в сочетании со стандартными эпидемиологическими методами является важным компонентом надзора за инфекцией. В настоящее время для обобщения и анализа молекулярно-эпидемиологических исследований функционирует база данных MeaNS (http://www.who-measles.org), куда депонируется преимущественно информация о последовательности N-450 вируса кори (гипервариабельный участок) и в гораздо меньшем количестве сведения о полных последовательностях генов гемагглютинина и нуклеопротеина.
Сегодня достаточно часто данные рутинного генетического мониторинга не позволяют отличить вирусы разного происхождения в случае идентичности их последовательностей N-450, что затрудняет эпидемиологическое расследование.
Современные высокопроизводительные секвенаторы второго и третьего поколений позволяют в короткие сроки получать данные полноразмерных нуклеотидных последовательностей вирусов, что дает возможность избежать сложностей, связанных с секвенированием фрагментов нуклеиновых кислот вирусов.
В этой связи актуальным и наиболее информативным методом представляется полногеномное секвенирование вируса кори. В настоящее время разрабатываются методы секвенирования вируса кори на основе полногеномной амплификации [4, 8], однако такие методы могут приводить к неполной или неравномерной амплификации генома [1].
Перспективным является высокопроизводительное секвенирование с использованием подходов ме-тагеномики. Так, метагеномное секвенирование может являться не только дополнительным методом исследования при инфекционных заболеваниях, но и основным методом постановки диагноза [6].
Поэтому цель настоящей работы - исследование метода универсальной подготовки образцов, имеющих в качестве мишеней РНК-содержащие вирусы, для последующего высокопроизводительного секвенирования с использованием подходов метагеномики на примере вируса кори.
Материалы и методы исследования. В качестве образцов для изучения метода выделения РНК были использованы изоляты вируса кори №№ 1А177 и 3-45, выращенные на культуре клеток Vero\hSLAM. Присутствие в тестируемых образцах нуклеиновых кислот культуры клеток создает условия, приближенные к тем, которые встречаются при секвенировании метагеномов.
Подготовка РНК. Для выделения тотальной РНК использовали набор QIAamp MinElute Virus Spin Kit («Qiagen», США). Выделение проводили из 400 мкл культуральной жидкости, содержащей изолят, пропорционально увеличив объем реагентов, используемых до этапа нанесения образца на микроколонку. Для предотвращения контаминации выделенной РНК стандартный соосадитель (carrier RNA, который является гомополимером рибонуклеотида), входящий в состав QIAamp MinElute Virus Spin Kit, был заменен на линейный полиакриламид, который добавляли на этапе лизиса клеток из расчета 1 мкл на 1 образец. На заключительном этапе выделения РНК элюирование проводили при помощи 100 мкл воды, свободной от нуклеаз.
Для удаления ДНК применяли фермент DNase I («NEB», США), согласно протоколу производителя. Очистку от инактивированной ДНКазы и буферного раствора проводили с использованием магнитных частиц Agencourt AMPure XP («Beckman Coulter», США). Определение концентрации и качества полученного препарата РНК осуществляли с использованием прибора Bioanalyzer 2100 и набора реагентов RNA 6000 Pico Kit («Agilent Technologies», США), согласно протоколу производителя.
Приготовление библиотек и секвенирование. Библиотеки случайных фрагментов для последующего секвенирования готовили при помощи набора реагентов Ion Total RNA-Seq Kit v2 («Thermo Fisher Scientific», США), согласно протоколу производителя, с использованием стандартных барко-дов. Оценку распределения длин фрагментов библиотек и их концентрацию осуществляли с использованием прибора Bioanalyzer 2100 и набора реагентов Agilent High Sensitivity DNA Kit («Agilent Technologies», США), согласно протоколу производителя.
Клональную амплификацию библиотек, которые были предварительно эквимолярно пулирова-ны, проводили с использованием набора Ion PI Template OT2 200 Kit v3 («Thermo Fisher Scientific», США), согласно протоколу производителя. Непосредственно секвенирование осуществляли при
помощи набора реагентов Ion PI Sequencing 200 Kit v3 и чипа Ion PI Chip Kit v2 на секвенаторе Ion Proton («Thermo Fisher Scientific», США), согласно протоколу производителя.
Биоинформатический анализ. Оценку качества полученных чтений проводили при помощи программного обеспечения FastQC [2], а фильтрацию качества чтений - Trimmomatic v.0.33 [3]. При этом были достигнуты следующие показатели: длина чтений - от 50 до 200 нуклеотидов, среднее качество нуклеотидов в межквартильном диапазоне - не ниже Q20. Мапирование ридов до и после фильтрации проводили в программной среде UGENE v.1.21 («Unipro», Россия) [7] при помощи алгоритма Bowtie 2 в режиме «end-to-end» [5]. Визуализацию мапирования чтений на геном вируса кори осуществляли при помощи программного обеспечения Geneious v.9.1 («Biomatters Ltd.», Новая Зеландия).
Результаты исследования и их обсуждение. Результаты определения концентрации и качества выделенной РНК представлены на рисунке 1.
20 25 30 3 5 40 4 5 50 5 5 60 65 [в]
а
б
Рис. 1. Электрофореграммы выделенной РНК, свободной от ДНК: а) образца № 1А177; б) образца № 3-45
Концентрация РНК образца № 1А177 составляла 32 894 пг/мкл, образца № 3-45 - 186 пг/мкл, а индексы целостности РНК (RNA integrity number, RIN) составляли 2,3 и 2,5, соответственно. Низкие RIN и отсутствие на электрофореграммах пиков, характерных для рРНК эукариот, свидетельствовали о возможной деградации РНК культуры клеток либо о преимущественном содержании мРНК. Например, известно, что более 99 % свободной РНК, внесенной в биологические образцы, деградирует уже в течение первых 15 с [10]. Однако, как показывают данные ряда исследований, в культурах клеток может содержаться большое количество внеклеточной РНК, в том числе из компонентов
среды культивирования [9, 11]. К сожалению, возможности набора RNA 6000 Pico Kit обеспечивают исследование РНК размером только до 6 000 нуклеотидов, что не позволяет оценить наличие пика РНК вируса кори. Тем не менее общая концентрация РНК в образцах была достаточной для приготовления библиотек.
В подготовленных библиотеках концентрация образца № 1А177 составляла 2424,87 пг/мкл, образца № 3-45 - 3287,01 пг/мкл. При проведении оценки распределения длин фрагментов было обнаружено отсутствие характерного узкого пика со средним значением рекомендуемой для секвенатора Ion Proton - «270 п.н. (рис. 2а и 2б).
а
б
Рис. 2. Распределение длин фрагментов: а) библиотеки образца № 1А177; б) библиотеки образца № 3-45
Поэтому в отношении обеих библиотек была проведена селекция фрагментов необходимой длины при помощи прибора E-Gel Size Select («Thermo Fisher Scientific», США). Концентрация библиотек и средний размер фрагментов образцов составляли соответственно:
- № 1А177 - 9,41 пг/мкл (55 пмоль/л) и 259 п.н.;
- № 3-45 - 41,7 пг/мкл (239 пмоль/л) и 264 п.н. (рис. 3).
Рис. 3. Распределение длин фрагментов после выбора фракции заданного размера библиотеки образца № 3-45
Для повышения концентрации библиотеки образца изолята № 1А177 была проведена ее амплификация (4 цикла по стандартному протоколу). После амплификации концентрация ее составила 259,55 пг/мкл (1414 пмоль/л) при среднем размере фрагментов 279 п.н. (рис. 4).
Рис. 4. Библиотека случайных фрагментов образца № 1А177 после амплификации
Полученные результаты позволили перейти к этапам клональной амплификации и секвениро-вания. В результате проведенного секвенирования было получено 1 069 869 прочтений библиотеки образца изолята № 1А177 и 3 474 556 прочтений библиотеки образца изолята № 3-45, при этом на референсную последовательность вируса кори было выравнено 686 (0,064 %) и 300 (0,008 %) прочтений, соответственно.
После фильтрации Trimmomatic было получено 682 260 прочтений образца изолята № 1А177 и 2 267 746 прочтений образца изолята № 3-45, из которых на референсную последовательность вируса кори выравнено 332 (0,049 %, рис. 5а) и 267 (0,012 %, рис. 5б) прочтений, соответственно.
Рис. 5а. Выравнивание прочтений библиотеки образца изолята № 1А177 после фильтрации качества и длины
Рис. 5б. Выравнивание прочтений библиотеки образца изолята № 3-45 после фильтрации качества и длины
Несмотря на малый процент ридов, мапированных на референсную последовательность кори, была определена принадлежность изолята № 1А177 к генотипу D4, а изолята № 3-45 - к генотипу D6. Немапированные прочтения были в дальнейшем выравнены на геном африканской зеленой мартышки, клетки которой представляют собой культуру Vero\hSLAM.
Заключение. Апробированный метод позволяет независимо от нуклеотидной последовательности обеспечивать секвенирование РНК-мишеней, в том числе РНК-содержащих вирусов, что было показано на примере изолятов вируса кори. Дополнительная амплификация библиотеки может негативно влиять на соотношение РНК вируса кори и культуры клеток. Для повышения селективности полногеномного секвенирования перед процедурой выделения РНК возможно проведение дополнительной очистки образца от РНК культуры клеток. Однако при этом концентрация РНК вируса должна быть достаточной для:
1) подготовки библиотеки используемой платформы секвенирования без этапа амплификации;
2) получения покрытия генома вируса прочтениями, достаточного для поставленной задачи (диагностика или генотипирование) в зависимости от производительности секвенатора.
Список литературы
1. Ребриков, Д. В. NGS : высокопроизводительное секвенирование / Д. В. Ребриков, Д. О. Коростин, Е. С. Шубина, В. В. Ильинский; под общ. ред. Д. В. Ребрикова. - М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. - 232 с.
2. Andrews, S. FastQC : a quality control tool for high throughput sequence data / S. Andrews. - Режим доступа : http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc, свободный. - Заглавие с экрана. - Яз. англ. - Дата обращения : 10.09.2018.
3. Bolger, A. M. Trimmomatic : A flexible trimmer for Illumina sequence data / A. M. Bolger, M. Lohse, B. Usadel // Bioinformatics. - 2014. - Article btu170. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.
4. Gardy, J. L. Whole-genome sequencing of measles virus genotypes H1 and D8 during outbreaks of infection following the 2010 Olympic winter games reveals viral transmission routes / J. L. Gardy, M. Naus, A. Amlani, W. Chung, H. Kim, M. Tan, A. Severini, M. Krajden, D. Puddicombe, V. Sahni, A. S. Hayden, R. Gustafson, B. Henry, P. Tang // The Journal of Infectious Diseases. - 2015. - Vol. 212, № 10. - P. 1574-1578. doi: 10.1093/infdis/jiv271.
5. Langmead, B. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 / B. Langmead, S. L. Salzberg // Nature Methods. - 2012. - Vol. 9, № 4. - P. 357-359.
6. Naccache, S. N. Diagnosis of neuroinvasive astrovirus infection in an immunocompromised adult with encephalitis by unbiased next-generation sequencing / S. N. Naccache, K. S. Peggs, F. M. Mattes, R. Phadke, J. A. Garson, P. Grant, E. Samayoa, S. Federman, S. Miller, M. P. Lunn, V. Gant, C. Y. Chiu // Clinical Infectious Diseases. - 2015. - Vol. 60, № 6. - P. 919-923.
7. Okonechnikov, K. Unipro UGENE : a unified bioinformatics toolkit / K. Okonechnikov, O. Golosova, M. Fursov, the UGENE team // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28, № 8. - P. 1166-1167. doi : 10.1093/bioinformatics/bts091.
8. Penedos, A. R. Assessment of the utility of whole genome sequencing of measles virus in the characterisation of outbreaks / A. R. Penedos, R. Myers, B. Hadef, F. Aladin, K. E. Brown // PloS one. - 2015. - Vol. 10, № 11. -Article e0143081. doi : 10.1371/journal.pone.0143081.
9. Tosar, J. P. Ribonucleic artefacts : are some extracellular RNA discoveries driven by cell culture medium components? / J. P. Tosar, A. Cayota, E. Eitan, M. K. Halushka, K. W. Witwer // Journal of extracellular vesicles. -2017. - Vol. 6, № 1. - Article 1272832. doi :10.1080/20013078.2016.1272832.
10. Tsui, N. B. Stability of endogenous and added RNA in blood specimens, serum, and plasma / N. B. Tsui, E. K. Ng, Y. M. Lo // Clinical Chemistry. - 2002. - Vol. 48, № 10. - P. 1647-1653.
11. Wei, Z. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA / Z. Wei, A. O. Batagov, D. R. Carter, A. M. Krichevsky // Scientific reports. - 2016. - Vol. 6. - Article 31175. doi : 10.1038/srep31175.
References
1. Rebrikov D. V., Korostin D. O., Shubina E. S, Il'inskiy V. V. NGS: vysokoproizvoditel'noe sekvenirovanie [NGS: high throughput sequencing]. Ed. D. V. Rebrikov, Moscow, Publishing house BINOM. Laboratoriya znaniy, 2014, 232 p.
2. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Available at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (accessed 10 September 2018).
3. Bolger A. M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics, 2014, Article btu170. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.
4. Gardy J. L., Naus M., Amlani A., Chung W., Kim H., Tan M., Severini A., Krajden M., Puddicombe D., Sahni V., Hayden A. S., Gustafson R., Henry B., Tang P. Whole-genome sequencing of measles virus genotypes H1 and D8 during outbreaks of infection following the 2010 Olympic winter games reveals viral transmission routes. The Journal of Infectious Diseases, 2015, vol. 212, no. 10, pp. 1574-1578. doi: 10.1093/infdis/jiv271.
5. Langmead B., Salzberg S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods, 2012, vol. 9, no. 4, pp. 357-359.
6. Naccache S. N., Peggs K. S., Mattes F. M., Phadke R., Garson J. A., Grant P., Samayoa E., Federman S., Miller S., Lunn M. P., Gant V., Chiu C. Y. Diagnosis of neuroinvasive astrovirus infection in an immunocompromised adult with encephalitis by unbiased next-generation sequencing. Clinical Infectious Diseases, 2015, vol. 60, no. 6, pp. 919-923.
7. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., the UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics, 2012, vol. 28, no. 8, pp. 1166-1167. doi:10.1093/bioinformatics/bts091.
8. Penedos A. R., Myers R., Hadef B., Aladin F., Brown K. E. Assessment of the utility of whole genome sequencing of measles virus in the characterisation of outbreaks. PloS one, 2015, vol. 10, no. 11, e0143081. doi: 10.1371/journal.pone.0143081.
9. Tosar J. P., Cayota A., Eitan E., Halushka M. K., Witwer K. W. Ribonucleic artefacts: are some extracellular RNA discoveries driven by cell culture medium components? Journal of extracellular vesicles, 2017, vol. 6, no. 1, 1272832. doi:10.1080/20013078.2016.1272832.
10. Tsui N. B., Ng E. K., Lo Y. M. Stability of endogenous and added RNA in blood specimens, serum, and plasma. Clinical Chemistry, 2002, vol. 48, no. 10, pp. 1647-1653.
11. Wei Z., Batagov A. O., Carter D. R., Krichevsky A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific reports, 2016, vol. 6, 31175. doi: 10.1038/srep31175.
