CC BY
61
УДК 579.254.26
МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI С КОНСТИТУТИВНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ФОСФОНАТНОГО
ОПЕРОНА
© 2013 Р.М. Бузиков, С.Н. Янов, И.П. Погорельский
Вятский государственный университет, г. Киров
Поступила в редакцию 27.05.2013
В настоящей работе представлены результаты получения рекомбинантных штаммов E. coli c конститутивной экспрессией фосфонатного оперона с помощью сайт-специфичной системы рекомбинации бактериофага.
Ключевые слова: фосфонаты, С-Р лиаза, глифосат, ксенобиотики, биоремедиация, фосфонатный оперон
Широкое применение агрохимикатов вывело сельскохозяйственные технологии на новый уровень, сделало возможным переход к интенсивному принципу ведения хозяйства, что, к сожалению, сопровождается загрязнением почвы и сельхозпродукции, особенно в случаях, связанных с несоблюдением норм внесения агрохимикатов и САмих технологий. У многих агрохимикатов со временем обнаруживаются свойства, отрицательно влияющие на природные экосистемы и здоровье человека. В результате длительного и неконтролируемого применения агрохимикатов сельхозпроизводителями на территории СНГ осталось множество свалок зачастую неизвестных препаратов или их смесей, существенно ухудшающих экологическую обстановку в регионах. До сих пор ситуация не изменилась, нередки случаи использования уже запрещенных веществ и препаратов. Часть ксенобиотиков не может быть достаточно эффективно переработана биотической компонентой экосистемы. Некоторые из них не только устойчивы к физии-ческому воздействию, но и к биодеструкции почвенными микроорганизмами. Более того, они обладают антибиотической активностью.
Одной из групп подобных ксенобиотиков являются фосфонаты (например, производные метилфосфоновой кислоты) - сильные органические фосфатные хелаторы, которые удерживают положительно заряженные ионы Mn, Co, Fe, Zn, Cu и др., необходимые для протекания физиологических процессов в почве, организмах растений и животных. Представителем данной группы соединений является глифосат - неселективный системный гербицид, использующийся для борьбы с сорняками, а его этил- и фенил- фосфонатные производные как инсектициды для борьбы с
Бузиков Рустам Мансурович аспирант. Е-mail: bakter@kirovnet. net
Янов Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии. Е-mail: yanov1947@mail. ru
Погорельский Иван Петрович, доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии. Е-mail: ipogorelsky@inbox. ru
насекомыми. Глифосат занимает среди гербицидов первое место в мире по производству [1]. Долгое время считалось, что для млекопитающих глифосат малотоксичен (ЛД50: для крыс 4900 мг/кг, для кроликов 3800 мг/кг), но при совместном воздействии с другими так называемыми «инертными компонентами» токсичность существенно увеличивается. Были выявлены онкогенный и мутагенный эффекты глифосата [2, 3]. Препарат может поступать с пищей в организм человека, отрицательно влияет на синтез ароматических аминокислот растениями, оказывает угнетающее воздействие на микрофлору кишечника [5].
Характерной особенностью фосфонатов является наличие С-Р связи, устойчивой не только к химическому гидролизу и фотолизу, но и к термическому расщеплению [6]. Благодаря этому фосфонаты способны долгое время сохраняться в почве, быстро адсорбируясь на ее частицах. Многие микроорганизмы в определенных условиях способны к биодеградации фосфонатов с помощью различных ферментов: фосфоноацетальдегидгидролазы (разлагает 2- аминоэтилфосфоновую кислоту); фосфо-ноацетатгидролазы (деградирует фосфоноацетат), фосфонопируватгидролазы и С-Р лиазы - фермента с наиболее широким спектром разлагаемых фос-фонатов. Проблема заключается в том, что биодеградация фосфонатов ингибируется даже невысокими концентрациями неорганических фосфатов, которые являются более доступным источником фосфора для микроорганизмов [6]. В природе практически не встречаются условия, оптимальные для эффективной экспрессии фосфонатного оперона - группы генов, отвечающих за синтез С-Р лиазного ферментативного комплекса и его функционирование. Для определения перспектив и направлений исследования проблемы биодеградации фосфонатных ксенобиотиков необходима селекция микроорганизмов, способных к синтезу С-Р лиазы не только на минимальной питательной среде, но и в почве, содержащей значительное количество фосфатов. Метаболизм фосфонатов и структура фосфонатного оперона требуют более подробного изучения, но на сегодняшний день полученных
Известия Самарского научного центра Российской академии наук, том 15, №3(3), 2013
данных уже достаточно для того, чтобы решить проблему биоремедиации почвы с использованием полученных методами генной инженерии, позволяющих получить четкий, предсказуемый конечный результат.
Фосфонатный оперон E. coli, размером 10,9 т.п.н., состоит из 14 генов:
phnCDEFGHIJKLMNOP, которые транскрибируются с одного промотора, расположенного перед геном phnC. Продукты генов phnC, phnD и phnE кодируют транспортную систему алкилфосфо-натов. Гены phnG-phnM кодируют связанные с мембраной компоненты С-Р лиазного комплекса [8]. Продукты генов phnN и phnP - вспомогательные белки С-Р лиазы. Гены рhnN, рЬиО кодируют регуляторные белки [9, 10]. Промотор фосфо-натного оперона содержит РНО-бокс (CTGTTAGTCACTTTTAAT), сходный с обнаруженной в промоторах pho-генов, что позволяет предположить общность с рЬо-регулоном, который обуславливает ответ микробной клетки на дефицит фосфора и подвергается весьма сложной регуляции, связанной с метаболизмом фосфора [7, 10, 11].
Наиболее приемлемым подходом является невмешательство в сложную систему регуляции фосфатного обмена бактериальной клетки, а исключение из нее фосфонатного оперона. Для этого необходимо заменить регулируемый промотор этого оперона на конститутивный. При этом целесообразнее не клонировать оперон протяженностью 10,9 т.п.н. в вектор с конститутивным промотором, а вставить этот промотор перед геном phnC фосфонатного оперона в месте его локализации (хромосоме бактерии). Методами классической генетики такая манипуляция трудноосуществима. В этой связи было необходимо разработать универсальную систему для встраивания фрагментов ДНК, в том числе и содержащие регуляторные последовательности (промоторы, операторы,
эн-хансеры и др.), в выбранное место в геноме бактерии. С этой целью была сконструирована плаз-мида с генами интеграции бактериофага X (гены exo, в, у встроены в хелперную плазмиду pTrcHis2C) (рис. 1).
Рис. 1. Вектор pTrcHis2c со вставкой генов exo, Р,у
В качестве конститутивного промотора использовался антитетрациклиновый промотор плаз-миды pSC 101, который амплифицировался вместе с геном резистентности к тетрациклину с помощью праймеров, состоящих из двух частей: З'-часть комплементарна фланкирующим конститутивный промотор последовательностям, a 5'-часть гомологична участкам, фланкирующим промотор фосфо-натного оперона (рис. 2).
Механизм замены промотора фосфонатного оперона
Получение штаммов кишечной палочки с конститутивной экспрессией фосфонатного опе-рона сводилось к следующему: компетентные клетки кишечной палочки E. coli Top 10 трансформировали ДНК хелперной плазмиды pTrcHis2 с генами exo, ß,y и амплифи-цированного фрагмента pSC101. Для селекции трансформантов использовали плотную питательную среду с добавлением 100 мкг/мл ампициллина (маркер хелперной плазмиды) и 10 мкг/мл тетрациклина (маркер встраиваемого фрагмента). Полученные трансформанты изучали на наличие вставки гена устойчивости к тетрациклину с помощью ПЦР с праймерами Pr1 и Pr2. Для дальнейшей работы было отобрано 13 клонов, способных к расщеплению изопропило-вого эфира метилфосфоновой кислоты даже в присутствии в питательной среде неорганического фосфата. При множественных пересевах в жидкой питательной среде без селективно давления антибиотиков были получены варианты кишечной палочки, утратившие резистентность к ампициллину (маркер хелперной плазмиды), но сохранившие устойчивость к тетрациклину. Следует заметить, что реципиентный штамм E. coli Top10 является ауксотрофом и не способен конкурировать с аборигенной микрофлорой природных экологических ниш. В дальнейшем разработанную технологию получения штаммов с конститутивной экспрессией фосфонатного оперона планируется использовать применительно к почвенным микроорганизмам с целью разработки биотехнологии для ремедиации загрязненных фосфонатами территорий.
Выводы: итогом работы является разработка методологической основы получения штаммов микроорганизмов, выделенных из различных экологических ниш, с модифицированной регуляцией фосфонатного оперона, перспективных для использования при создании биопрепарата и технологии его применения при очистке территорий от фосфонатных соединений.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Gasnier, C. Glyphosate-based herbicides are toxic and endocrine disruptors in human cell lines / C. Gasnier et al. // Toxicology. 2009. Vol. 10. P. 33-35.
2. De Roos, J. Cancer Incidence among Glyphosate-Exposed Pesticide Applicators in the Agricultural Health Study / J. De Roos et al. // Environmental Health Perspectives, 2005, P. 113.
3. Dallegrave, E. The teratogenic poten al of the herbicide glyphosate-Roundup® in Wistar rats / E. Dallegrave et al. // Toxicology Leers. 2003. Vol. 142(1-2). P. 45-52.
4. Hardell, L. A Case-Control Study of Non-Hodgkin Lymphoma and Exposure to Pesticides / L. Hardell, M. Eriksson // Cancer. 1999. Vol. 85. P. 1353-1360.
5. Brandli, D. Herbicides found in Human Urine / D. Brandli, S. Reinacher // Ithaka Journal. 2012. Vol. 1. P. 2-4.
6. Нифантьев, Э.Е. Химия фосфорорганических соединений. - М.: Изд-во МГУ, 1971. 24 с.
7. Микробные биотехнологии ремедиации почв, загрязненных фосфорорганическими пестицидами [электронный ресурс] // Коммерческая биотехнология. 01.07.09 URL: http://www.cbio.ru/
8. Metcalf, W. W. Mutational Analysis of an Eschenichia coli Fourteen-Gene Operon for Phosphonate Degradation, Using TnphoA' Elements / W.W. Metcalf, B.L Wanner // Journal of bacteriology. 1993. Vol. 6. P. 3430-3442.
9. Jochimsen, B. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway / B. Jochimsen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 7. P. 12-28.
10. Datsenko, KA. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products / KA. Datsenko, B.L. Wanner // Communicated by Jonathan Beckwith, Harvard Medical School, Boston, MA (received for review February 13, 2000).
11. Kamat, S.S. Intermediates in the transformation of phosphonates to phosphate by bacteria / S.S. Kamat, H.J. Williams, F.M. Raushel // Nature. 2011. Vol. 480. P. 570-573.
METHOD OF RECEIVING THE ESCHERICHIA COLI STRAINS WITH CONSTITUTIVE EXPRESSION OF PHOSPHONATE OPERON
© 2013 R.M. Buzikov, S.N. Yanov, I.P. Pogorelskiy
Vyatka State University, Kirov
In this work results of receiving the recombinant strains of E. coli with constitutive expression of phosphonate operon with the help of site-specific system of bacteriophage recombination are presented.
Key words: phosphonates, LiAZ S-R, gliphosat, xenobiotics, bioremediation, phosphonate operon
Rustam Buzikov, Post-graduate Student. E-mail: bakter@kirovnet.net Sergey Yanov, Doctor of Biology, Professor at the Microbiology Department. E-mail: yanov1947@mail.ru
Ivan Pogorelskiy, Doctor of Medicine, Professor at the Microbiology Department. E-mail: ipogorelsky@inbox.ru
