CC BY
3
УДК 577.21
Метод получения рекомбинантных VSV с подтверждением биологической активности
В. Д. Мороз1**, Н. Б. Гасанов1**, А. Д. Егоров1, А. С. Малоголовкин1,2, М. О. Нагорных1, Е. Н. Субчева1, Е. С. Колосова1, А. Ю. Физикова1, Р. А. Иванов1, А. В. Карабельский1 Научно-технологический университет «Сириус», Краснодарский край, пгт Сириус, 354340 Россия
2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Минздрава России, Сеченовский университет, Москва, 119435 Россия
# Авторы внесли равный вклад в работу.
*E-mail: [email protected]; [email protected]
Поступила в редакцию 01.11.2023
Принята к печати 30.01.2024
DOI: 10.32607/actanaturae.27314
РЕФЕРАТ Создание новых эффективных средств лечения опухолей является перспективным и актуальным направлением трансляционной медицины. Онколитические вирусы способны индуцировать иммуногенную клеточную смерть, активируя иммунную систему организма для распознавания злокачественной опухоли. В данной работе представлены результаты оптимизации метода получения рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита. Для сборки вирусных частиц получена клеточная линия HEK293TN-T7, стабильно экспрессирующая ДНК-зависимую РНК-полимеразу Т7 для экспрессии вирусного генома, а также получены хелперные плазмиды, кодирующие вирусные гены под контролем CAG-промоторов. Онколитическую активность очищенного препарата модельного вируса определяли на клетках меланомы мыши B16F10Red, экспрессирующих красный флуоресцентный белок. Предложенный метод позволяет получать очищенный вирусный препарат с высоким титром и с онко-литической активностью; благодаря амплификации вирусных частиц в суспензионной культуре клеток HEK293, легко масштабируется и может в дальнейшем использоваться для получения других реком-бинантных онколитических вирусов на основе вируса везикулярного стоматита для иммунотерапии злокачественных опухолей.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА VSV, онколитические вирусы, онкологические заболевания, меланома, рекомбинант-ный вирус везикулярного стоматита.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ VSV - вирус везикулярного стоматита; rVSV - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита; GFP - зеленый флуоресцентный белок; ЦПД - цитопатическое действие; MOI (англ. multiplicity of infection) - множественность заражения; ЦФ - центрифугирование; УЦФ - ультрацентрифугирование; ТСГО50/мл - тканевая инфицирующая доза вируса; RFP - красный флуоресцентный белок.
ВВЕДЕНИЕ цикл репликации в цитоплазме (без интеграции
Онколитические вирусы уже долгое время рас- в геном), возможность получения высокого титра сматриваются как возможные противоопухолевые при наработке VSV в культурах клеток млекопи-средства. В настоящее время разработка новых тающих (BHK-21, HEK293), возможность генети-онколитических вирусов является одним из при- ческой модификации и отсутствие в человеческой оритетных направлений иммунотерапии опухолей. популяции нейтрализующих антител сделали VSV По последним данным ведется более 200 клиниче- идеальным кандидатом для получения вирусных ских исследований безопасности и эффективности вакцин, векторов доставки трансгена и онколи-препаратов на основе онколитических вирусов [1, тических вирусов [3-5]. Сборка rVSV, например 2]. РНК-содержащий вирус везикулярного стома- rVSV-dG-GFP, включает этап трансфекции клеток тита (VSV) эффективно инфицирует разные типы BHK-21 пятью плазмидами и коинфекцию клеток клеток животных и человека, не будучи патоген- вирусом осповакцины (VV) или иным вирусом, экс-ным для человека. Низкая вирулентность, быстрый прессирующим ДНК-зависимую РНК-полимеразу
ТОМ 16 № 1 (60) 2024 | ACTA NATURAE | 59
Т7 (Т7-РНК-полимеразу) [6]. При этом при получении биотехнологических продуктов, которые предполагается использовать в качестве лекарственных препаратов, необходимо минимизировать число вспомогательных вирусов, в частности репликатив-но-активных, поскольку они могут быть источниками вирусной контаминации. Кроме того, готовая лекарственная форма не должна содержать остатков VV или иных вирусов [7]. В современной литературе крайне мало источников с полным и подробным описанием всех этапов получения, очистки, концентрирования и проверки функциональной активности онколитических вирусов на основе VSV для дальнейшего проведения научных исследований. В настоящей работе разработан метод получения очищенного препарата репликативно-активного модельного rVSV, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (rVSV-dM51-GFP), без использования вспомогательного вируса.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Плазмиды и генетическая инженерия
Для клонирования использовали коммерческие плазмиды: pBS-N-ФТ-Кап (cat# EH1013, Kerafast, США), pBS-P-ФТ-Атр (cat# EH1014, Kerafast), pBS-L-ФТ-Атр (cat# EH1015, Kerafast), pBS-G-OT-Kan (cat# EH1016, Kerafast), pCAGGS-G-Kan (cat# EH1017, Kerafast), pVSV-dG-GFP 2.6 (cat# EH1026, Kerafast), а также плазмиду: pCAG-T7pol (cat# 59926, Addgene). Для амплификации плазмид использовали штаммы Escherichia coli (DH5-alpha, NEB® Stable (cat# C3040H, NEB, Англия)). Генетическую трансформацию, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, лигирование, гель-электрофорез и выделение ДНК проводили согласно стандартным протоколам и рекомендациям производителей ферментов [8]. Для выделения ДНК использовали коммерческие наборы (кат. # BC021L, кат. # BC124, ЗАО «Евроген» (Россия)). Направленный мутагенез гена VSVM, кодирующего белок VSVM, проводили с использованием инвертированной ПЦР на матрице pVSV-dG-GFP 2.6 (cat# EH1026, Kerafast) и специфичными праймерами:
прямой GACACCTATGATCCGAATCAATTAAGAT-ATGAGA;
обратный CTCGTCAACTCCAAAATAGGATTTGTC-AATTGGA.
В полученную после мутагенеза плазмиду pVSV-dG-dM51-GFP по сайтам узнавания эндону-клеаз рестрикции Nhel/Xbal клонировали ген VSVG из плазмиды pCAGGS-G-Kan и получали плазми-ду pVSV-dM51-GFP, необходимую для сборки ре-
пликативно-активного rVSV-dM51-GFP. Для получения хелперных плазмид с CAG-промотором (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP) в плаз-миду pCAG-T7pol по XbaI/NotI-сайтам рестрикции клонировали последовательности гена L, гены N и P клонировали по EcoRI/NotI-сайтам. Амплификацию генов проводили с использованием специфичных праймеров, а в качестве матрицы для амплификации генов VSVN, VSVP и VSVL использовали плазмиды pBS-N^T-Kan, pBS-P-ФТ-Атр, pBS-L-ФТ-Amp соответственно. Правильность сборки векторов проверяли секвенированием по Сэнгеру на ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) при стандартных условиях и с использованием реагентов, рекомендованных производителем.
Получение клеточных линий HEK293TN-T7 и BHK-21-T7
Ген T7-RNApol, кодирующий Т7-РНК-полимеразу, клонировали в ретровирусный вектор pBabe-bleo (Plasmid #176) по BamHI/SalI-сайтам рестрикции, корректность сборки вектора pBabe-bleo подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру.
Для получения ретровируса полученной плазми-дой трансфицировали клетки Phoenix-AMPHO (CRL-3213 - ATCC) с использованием Lipofectamine® 3000 (cat# L3000015, Thermo Fisher Scientific) согласно рекомендациям производителя. Клетки HEK293TN и BHK-21 заражали культуральной жидкостью с полученным ретровирусом (3 раза каждые 12 ч). Селекцию проводили в течение недели на зеоцине 100 мкг/мл (cat# R25005, Invitrogen by Thermo Fisher Scientific). Выжившие клетки пересевали, через 2 недели после начала селекции проводили скрининг отдельных колоний по наличию встройки гена T7-RNApol в геноме клеток с использованием ПЦР и специфичных праймеров. Для дальнейшей работы отбирали по одному клону клеток HEK293TN-T7 и BHK-21-T7, активность Т7-РНК-полимеразы в которых подтверждали, определяя уровень люминесценции с использованием набора Luciferase Assay System (Promega, США). Для этого проводили транс-фекцию клеток следующими векторами экспрессии: плазмидами pEGFPN3 (cat# 632515, Clontech), плаз-мидой pSmart_5'-Mod-FFLuc-3'-Mod [9], плазмидами pCAG-T7pol и pSmart_5'-Mod-FFLuc-3'-Mod (положительный контроль).
Получение и амплификация rVSV-dM51-GFP
Для сборки rVSV-dM51-GFP клетки HEK293TN-T7 в лунках 12-луночного планшета при достижении 80-85% конфлюентности трансфицировали плаз-мидами pCAG-VSVN, pCAG-VSVP, pCAG-VSVL,
pCAGGS-G и pVSV-dM51-GFP в соотношении 3:5:1:4:8, соответственно, с использованием PEI (соотношение 5:1) и суммарным количеством ДНК (10.5 мкг). Культуральную жидкость, полученную через 72 ч после трансфекции, использовали для последующей амплификации вируса в адгезионных клетках BHK-21 (cat# 85011433, ECACC General Collection) и в суспензионных клетках HEK293, растущих на бессывороточной среде (BalanCD HEK293, Irvine Scientific). Добавляли вируссодержа-щие супернатанты (MOI = 10-4), полученные после ЦФ (3000 g) культуральной жидкости, полученной на предыдущих этапах наработки препарата rVSV-dM51-GFP, и инкубировали клетки в течение 72 ч. Отбирали культуральную жидкость на всех этапах наработки вируса, ЦФ (3000 g) и хранили при -80°С, или использовали сразу для повторной трансдукции или выделения, очистки, исследования вируса и пр. После амплификации вирусов в клетках HEK293 вируссодержащие супернатанты фильтровали через 0.45-мкм фильтры и концентрировали (300 кДа, Vivaspin б, VS0651, Sartorius) в 100-200 раз с переводом в стандартный фосфатно-солевой буфер (PBS) с рН 7.4 для хранения, очистки или анализа.
Очистка rVSV-dM51-GFP методом ультрацентрифугирования
Для очистки и концентрирования препарата rVSV-dM51-GFP методом УЦФ на первом этапе проводили первичную очистку, осаждение вирусных частиц через «сахарозную подушку», представляющую собой раствор 20% сахарозы в буфере HEN (10 мM HEPES pH 7.4, 1 мM EDTA, 100 мM NaCl). В пробирки для УЦФ (cat# 3440б1, Beckman Coulter) переносили супернатант с вирусом и вносили под слой су-пернатанта 4 мл раствора 20% сахарозы. Проводили УЦФ при 120 000 g в течение 1 ч при 4°C, удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 500 мкл буфера ET (1 hM Tris-HCl, pH 7.5, 1 iM EDTA, 10% ДMСO) и инкубировали в течение 2 ч при 4°C. Далее проводили 2 этап УЦФ в ступенчатом градиенте плотности сахарозы в буфере HEN с тремя различными плотностями (25, 45, б0%), ЦФ при 130 000 g и 4°C в течение 1б ч. Отбирали полосу на границе 25 и 45% растворов. На 3 этапе полученный образец разводили в стандартном PBS (рН 7.4) в 12 раз, ЦФ при 120 000 g и 4°C в течение 1 ч. Осадок, содержащий очищенную фракцию препарата, растворяли в необходимом объеме PBS (рН 7.4).
Анализ образцов препарата rVSV-dM51-GFP методом электронной микроскопии
Использовали сканирующий электронный микроскоп Crossbeam 550 (Carl Zeiss, Германия) в режиме
просвечивающей электронной микроскопии (STEM). Образец наносили на предварительно обработанные плазмой воздуха в течение 10 с медные сетки (formvar/carbon (200 mesh), cat#BZ31022a, EMCN, Китай) с помощью установки плазменной очистки Zepto (Diener Electronic), инкубировали в течение 2 мин, далее сетку промывали бидистиллирован-ной водой и контрастировали 1% водным раствором уранилацетата (cat#0379, Polysciences Inc.) 1 мин. Полученные сетки с образцом высушивали на воздухе при комнатной температуре. Съемку проводили при ускоряющем напряжении 30 кВ.
Анализ образцов препарата rVSV-dM51-GFP
Анализ белкового состава образцов проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с использованием додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) по стандартному протоколу [10]. Расчет титра (ТСГО50/мл) препарата rVSV-dM51-GFP осуществляли по методу Рида-Менча [11].
Получение клеточной линии B16F10red
Клеточную линию B16F10Red получали на основе культуры клеток меланомы мыши B16F10 из коллекции опухолевых штаммов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (3-й пассаж), полученную из мыши линии C57BL/6. Клетки B16F10 транс-дуцировали вирусными частицами, которые содержатся в культуральной среде HEK293TN, транс-фицированных плазмидами pMD2.G (cat# 12259, Addgene), pMDLg/pRRE (cat# 12251, Addgene) pRSV-REV (cat# 12253, Addgene) и плазмидой, кодирующей слитый белок H2B-Katushka2 под промотором EF1a. Выжившие в селективной среде клетки пересевали в культуральный флакон площадью 25 см2 и отбирали колонии, имеющие наиболее яркую флуоресценцию репортера H2B-Katushka2. Интенсивность флуоресценции в полученной сублинии B16F10Red детектировали с помощью микроскопа c флуоресцентным модулем (Carl Zeiss Axio Vert.A1).
Мониторинг количества B16F10Red-клеток c помощью lncuCyte S3
Для изучения динамики изменения количества флуоресцирующих клеток B16F10Red после заражения вирусными частицами с разными разведениями препарата rVSV-dM51-GFP клетки инкубировали в течение 84 ч согласно рекомендациям производителя с использованием системы прижизненного клеточного анализа lncuCyte S3, измеряющего количества флуоресцирующих клеток каждые 2 ч.
TOM 1б № 1 (б0) 2024 | ACTA NATURAE | 61
Л
AmpR-промотор Т7-промотор
ВНК-21 Т7
HEK293TN Т7
| | Клетки (контроль)
I | Клетки + люцифераза + субстрат
| | Клетки + pCAG-T7 + люцифераза + субстрат
Б
В
ЩШ
Рис. 1. Сборка вирусных частиц rVSV-dM51-GFP. Л - карта плазмиды с геномом вируса для сборки rVSV-dM51-GFP. Отмечены мутация dM51 и гены, кодирующие белки rVSV-dM51-GFP, включая встроенный ген VSVG;
Б - уровень люминесценции в клетках НЕК293ТМ-Т7 и ВНК-21-Т7; В - микрофотографии клеток НЕК293Т1М-Т7 через 72 ч после трансфек-ции(верхняя строка - отрицательный контроль трансфекции со всеми плазмидами для сборки rVSV-dM51-GFP без коровой плазмиды, кодирующей геном вируса (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN и pCAG-VSVP), нижняя строка - трансфек-ция со всеми плазми-дами (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP и pVSV-dM51-GFP), необходимыми для сборки rVSV-dM51-GFP
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Классический метод сборки rVSV включает транс-фекцию клеток ВНК-21 пятью плазмидами, экс-прессирующими отдельные гены и полный геном VSV, и коинфекцию клеток вирусом осповакцины или иным вирусом, экспрессирующим Т7-РНК-полимеразу, необходимую для сборки rVSV [6]. Использование отдельных вирусов, экспресси-рующих Т7-РНК-полимеразу для сборки rVSV, имеет ряд недостатков, которые были упомянуты выше. Котрансфекция клеток плазмидами для сборки rVSV и плазмидой, кодирующей ген Т7-РНК-полимеразы, позволяет обойтись без нежелательного использования хелперного вируса на этапе сборки rVSV Использование дополнительной плазмиды в трансфекции увеличивает ДНК-нагрузку на клетки, что может иметь токсический эффект и негативно отразиться на сборке вируса. Поэтому нами были получены клеточные линии НЕК293Т^Т7 и ВНК-21-Т7, экспрессирующие Т7-РНК-полимеразу. Для проверки эффективности экс-
прессии полимеразы измеряли интенсивность люминесценции клеток после трансфекции с плазмидой с геном люциферазы светлячка под промотором Т7-РНК-полимеразы. Показано, что уровень экспрессии люциферазы под промотором Т7-РНК-полимеразы в клетках НЕК293Т^Т7 достигает уровня в положительном контроле (клетки после трансфекции плазмидой с геном Т7-РНК-полимеразы), но при этом превышает уровень в клетках ВНК-21-Т7 (рис. 1Б). Поэтому в дальнейшей работе для сборки вирусных частиц модельного rVSV использовали клеточную линию НЕК293Т^Т7. В качестве модельного вируса для отработки оптимизированной методики получения очищенных препаратов rVSV мы использовали rVSV-dM51-GFP с делецией метионина в 51 позиции белка М VSV ^М51). Известно, что rVSV с данной делецией при попадании в здоровые клетки не подавляет экспрессию интерферонов, что делает такую модификацию полезной с точки зрения безопасности терапевтических препаратов на основе rVSV [12].
Сборка rVSV-dM51-GFP (Трансфекция)
pCAG-VSVL
О -
pCAGGS-G pCAGGS-G
pVSV-dM51-GFP
Титрование
BHK-21 rVSV-dM51-GFP
Амплификация 1 (Трансдукция)
Амплификация 2 (Трансдукция)
Амплификация 3 (Трансдукция)
HEK293TN-T7 HEK293TN-T7
Очистка
Диализ в PBS
Целевая фракция
УЦФ 1 ч 120 000 g
Живые
ЦПД
в градиенте сахарозы
HEK293
Концентрирование через сахарозную подушку
АЛ
Супернатант rVSV-dM51-GFP
Центрифугирование 3000 g
Концентрирование в центрифужных концентраторах 300 кДа
20% Сахароза
Я
УЦФ 16 ч 130 000 g
Осадок с rVSV
УЦФ 1 ч 120 000 g
14.3 х 10' ТСЮ50/мл
w
Рис. 2. Схема наработки очищенного препарата rVSV-dM51-GFP в адгезионных и суспензионных культурах клеток
Также геном модельного вируса содержит ген VSVG, кодирующий гликопротеин оболочки, необходимый для проникновения вируса в клетки, что делает его репликативно-активным, а также избавляет от необходимости предварительной трансфекции клеточных культур плазмидой с геном VSVG при наработке вирусных препаратов [6, 13]. Для внесения модификаций в геном модельного вируса мы получили плазмиду pVSV-dM51-GFP с делецией dM51 и геном VSVG (рис. 1А). Эту плазмиду использовали для трансфекции на этапе сборки вируса вместе с хелперными плазмидами (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP). Для повышения эффективности этапа сборки модельного rVSV-dM51-GFP мы также сконструировали хелперные плазмиды с CAG-промотором, ориентируясь на данные об использовании этого промотора для сборки rVSV [14], а также на данные, согласно которым CAG-промотор усиливает синтез белка в клетках HEK293F [15]. Чаще всего rVSV нарабатывают в клетках BHK-21 или Vero [16], однако rVSV-dM51-GFP эффективно собирался только в клетках HEK293TN-T7 (рис. 1В). Однако в клетках BHK-21-T7, а также в BHK-21 и Vero-76, трансфицированных с использованием дополнительной плазмиды pCAG-T7pol, мы не наблюдали ни GFP-сигнала, ни ЦПД.
В эффективном варианте сборки rVSV-dM51-GFP соотношение плазмид для трансфекции клеток НЕК293Т^Т7 отличалось от опубликованных ранее протоколов [6, 14], когда как при соотношениях плазмид, использованных, например, в статье Витта [6], GFP-сигнал и ЦПД были на уровне отрицательного контроля (данные не приведены, так как совпадали с отрицательным контролем как на рис. 1В). Можно предположить, что соотношения плазмид, оптимальные для сборки вирусных частиц модельного вируса rVSV-dM51-GFP, в разных условиях могут отличаться, поэтому, когда rVSV не собирается, можно изменить соотношение плазмид и выбрать оптимальное в данных условиях. В связи с отсутствием полных протоколов цикла наработки rVSV, в этой работе мы приводим метод, подробно описывающий все этапы наработки очищенного препарата модельного вируса rVSV с этапами определения титра и оценки онколитической активности (рис. 2-4).
Наработка препарата в суспензионной культуре значительно облегчает процесс масштабирования технологического процесса и упрощает процесс масштабирования лабораторной технологии до объемов промышленных биореакторов и, соответственно, процедуру наработки промышленных серий rVSV
Л
1 2 3 4
кДа
250 VSVL
150
100
75
mm VSVG
50
VSVN
37 _
VSVM
25
.0 m
У *
Светлое поле
GFP
С
Рис. 3. Анализ препарата rVSV-dM51-GFP. Л - электрофорез в ПААГ (слева направо):
1 - маркер молекулярной массы белков (10-250 кДа),
2 - супернатант после ЦФ (3000 д) культуральной жидкости с rVSV-dM51-GFP,
3 - образец фракции
с rVSV-dM51-GFP после
2 этапа УЦФ,
4 - образец очищенного препарата rVSV-dM51-GFP после
3 этапа УЦФ;
Б - STEM-микрофотография образца препарата rVSV-dM51-GFP до очистки методом УЦФ, увеличение 130 000;
В - STEM-микрофото-графия образца препарата rVSV-dM51-GFP после очистки путем УЦФ, увеличение 130 000;
Г - расчет ТСЮ50 на клетках ВНК-21 с фотографиями клеток при наличии (сверху) и отсутствии (снизу) ЦПД
Б
В
[17]. Использование на этапе культивирования бессывороточной среды, как в случае суспензионной культуры HEK293, делает необязательной проверку препарата на содержание компонентов животного происхождения [18]. Оптимизация процесса культивирования HEK293, например, использование культуральных подпиток может значительно увеличить титр вируса [17]. Для очистки препарата rVSV-dM51-GFP от примесей, ингибирующих частиц и концентрирования мы проводили трехступенчатую очистку образцов с использованием УЦФ в градиенте плотности сахарозы (рис. 2). Процесс очистки состоял из этапов концентрирования вирусных частиц, очистки в градиенте плотности сахарозы с последующим выделением и диализом целевой фракции вирусов в PBS (рН 7.4). В аналогичных вариантах очистки VSV порядок этапов варьирует, например, этап концентрирования через так называемую «сахарозную подушку» может быть завершающим [19] или отсутствовать [20]. В данной работе мы центрифугировали культуральную жидкость, содержащую rVSV-dM51-GFP, через 20% сахарозу, чтобы не только сконцентрировать образец, но и предварительно очистить его от части
примесей и тем самым увеличить эффективность следующего 2 этапа очистки в градиенте плотности сахарозы. На 2 этапе УЦФ мы использовали следующие концентрации сахарозы: 25%, 45% и 60% [21]. Завершающим этапом очистки был диализ в PBS (рН 7.4) посредством переосаждения с помощью УЦФ (рис. 2). Проведение УЦФ может привести к потере и повреждению вирусных частиц и, соответственно, к снижению титра препарата. Чтобы проверить титр и чистоту препаратов rVSV-dM51-GFP, полученных по предложенной нами схеме (рис. 2), образцы анализировали с помощью ДСН-ПААГ, TCID50 и STEM (рис. 3). Изменение яркости полос, соответствующих пяти белкам rVSV, в ДСН-ПААГ [22, 23] и исчезновение полос неспецифичных примесей указывают на повышение концентрации препарата на каждом этапе очистки (рис. 3А).
Анализ образцов препаратов методом STEM также показал, что после УЦФ препарата rVSV-dM51-GFP количество вирусных частиц в поле видимости возрастает, а количество примесей снижается (рис. 3Б,В). Чтобы проверить, насколько вирусные частицы сохраняют при этом жизнеспособность, мы определили титры препа-
Рис. 4. Зависимость доза-эффект препарата rVSV-dM51-GFP на клетках линии B16F10Red. А - микрофотографии клеток полученной линии B16F10Red; Б - динамика изменения ЦПД на клетках линии B16F10Red после добавления препарата rVSV-dM51-GFP в разных разведениях
ратов rVSV-dM51-GFP до и после УЦФ, используя определение TCID50 как метод, определяющий именно количество инфекционных вирусных частиц, обладающих цитопатическим действием [11]. В подтверждение данным, полученных методами ДСН-ПААГ-электрофореза и STEM, титр rVSV-dM51-GFP в супернатантах до концентрирования (2* 108 ТСГО50/мл) был ниже, чем после очистки и концентрирования препарата с помощью УЦФ (4.3 * 109 ТСГО50/мл) (рис. 3Г). Кроме проведения качественного и количественного анализа нами были также проверены онколитические свойства и зависимость доза-эффект полученного данным методом препарата модельного rVSV на клеточной линии меланомы мыши B16F10 (рис. 4Б), которая часто используется для оценки терапевтических свойств различных препаратов, включая онколи-тические вирусы, в том числе и для проведения исследований in vivo [24-26]. Визуализация живых клеток при помощи флуоресцентных белков позволяет контролировать рост раковых клеток как в in vitro, так и в in vivo, что в свою очередь дает возможность оценивать терапевтический эффект противоопухолевых препаратов. Для оценки зависимости доза-эффект in vitro мы получили клеточную линию B16F10, экспрессирующую RFP (B16F10Red) (рис. 4A), и использовали метод прижизненного мониторинга количества клеток c помощью lncuCyte S3 (рис. 4Б). В вариантах без добавления препарата и в вариантах с добавлением препарата в больших разведениях (108 и 1010) наблюдали схожую динамику роста: фаза роста (~0-40 ч), фаза плато (~40-75 ч) и фаза гибели клеток (~75 ч и более). А в варианте с меньшим разведением
препарата (107) динамика роста клеток сильно отличалась - примерно через 25 ч после фазы роста начиналась фаза гибели клеток. Строили кривые зависимости количества флуоресцентных объектов от степени разведения добавляемого препарата и наблюдали зависимость доза-эффект количества препарата и количества живых клеток (рис. 4Б). Исходя из этого можно сделать вывод, что после предложенных нами этапов сборки, амплификации и очистки вирусные частицы модельного вируса не теряют жизнеспособность и онколитические свойства, сохраняют способность лизировать раковые клетки при больших разведениях (107-108) препарата.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами разработана масштабируемая методика получения очищенного препарата модельного rVSV-dM51-GFP без использования хелперного вируса, включающая этапы наработки, очистки, проверки титра и онколитической активности вируса. Полученный с помощью предложенной нами методики препарат модельного вируса может быть использован для оценки его терапевтических свойств в сингенных in vivo моделях мышей с B16F10-клетками, в том числе, в сравнении с армированными вариантами rVSV, обладающими иммуностимулирующими свойствами [12, 26, 27]. •
Финансирование проекта осуществлялось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-10-2021-093;
Проект GTH-RND-2113).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Pearl T., Markert J., Cassady K., Ghonime M. // Mol. Ther. Oncolytics. 2019. V. 13. P. 14-21.
2. Malogolovkin A., Gasanov N., Egorov A., Weener M., Ivanov R., Karabelsky A. // Viruses. 2021. V. 13. № 7. P. 1271.
3. Geisbert T., Feldmann H. // J. Infectious Dis. 2011. V. 204. № suppl_3. P. 1075-1081.
4. Zemp F., Rajwani J., Mahoney D. // Biotechnol. Genet. Engin. Rev. 2018. V. 34. № 1. P. 122-138.
5. Velazquez-Salinas L., Naik S., Pauszek S., Peng K., Russell S., Rodriguez L. // Hum. Gene Ther. Clin. Dev. 2017. V. 28. № 2. P. 108-115.
6. Whitt M. // J. Virol. Methods. 2010. V. 169. № 2. P. 365-374.
7. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 89 «Об утверждении Правил проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза» (в ред. решений Совета Евразийской экономической комиссии от 15.07.2022 № 110, от 04.07.2023 № 77).
8. Green M., Sambrook J. Mol. Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition. New York, 2012. V. 2.
9. Kirshina A., Vasileva O., Kunyk D., Seregina K., Muslimov A., Ivanov R., Reshetnikov V. // Biomolecules. 2023. V. 13. № 11. P. 1677. doi: 10.3390/biom13111677.
10. Laemmli U. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.
11. Lei C., Yang J., Hu J., Sun X. // Virologica Sinica. 2021. V. 36. № 1. P. 141-144.
12. Felt S., Grdzelishvili V. // J. Gen. Virol. 2017. V. 98. № 12. P. 2895-2911.
13. Finkelshtein D., Werman A., Novick D., Barak S., Rubinstein M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. № 18. P. 7306-7311.
14. Takahashi K., Yokobayashi Y. // ACS Synth. Biol. 2019. V. 8.
№ 9. P. 1976-1982.
15. Dou Y., Lin Y., Wang T., Wang X., Jia Y., Zhao C. // FEBS Open Bio. 2021. V. 11. № 1. P. 95-104.
16. Abdelmageed A., Ferran M. // Curr. Protoc. Microbiol. 2020. V. 58. № 1. e110.
17. Elahi S., Shen C., Gilbert R. // J. Biotechnol. 2019. V. 289. P. 144-149.
18. Van der Valk J., Bieback K., Buta C., Cochrane B., Dirks W., Fu J., Hickman J., Hohensee C., Kolar R., Liebsch M. // ALTEX. 2018. V. 35. № 1. P. 99-118.
19. Kim I., Jenni S., Stanifer M., Roth E., Whelan S., van Oijen A., Harrison S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. V. 114.
P. 28-36.
20. Sakata M., Tani H., Anraku M., Kataoka M., Nagata N., Seki F., Tahara M., Otsuki N., Okamoto K., Takeda M. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 11607.
21. Moerdyk-Schauwecker M., Hwang S., Grdzelishvili V. // Virol. J. 2009. V. 6. P. 166.
22.Thomas D., Newcomb W., Brown J., Wall J., Hainfeld J., Trus B., Steven A. // J. Virol. 1985. V. 54. № 2. P. 598-607.
23. Buonocore L., Blight K., Rice C., Rose J. // J. Virol. 2002. V. 76. № 14. P. 6865-6872.
24. Durham N., Mulgrew K., McGlinchey K., Monks N., Ji H., Herbst R., Suzich J., Hammond S., Kelly E. // Mol. Ther. 2017. V. 25. № 8. P. 1917-1932.
25. Abdulal R., Malki J., Ghazal E., Alsaieedi A., Almahboub S., Khan M., Alsulaiman R., Ghaith M., Abujamel T., Ganash M. // Front. Mol. Biosci. 2023. V. 10. P. 1190669.
26. Isaeva A.S., Porozova N.O., Idota E., Volodina S.I., Luka-shev A.N., Malogolovkin A.S. // Sechenov Med. J. 2023. V. 14. № 4. P. 17-30.
27. Cristi F., Gutiérrez T., Hitt M., Shmulevitz M. // Front. Mol. Biosci. 2022. V. 9. P. 831091.
