CC BY
17УДК 615.9 -615.099
метод оценки
эмбриотропного
действия биоинсектицидов
в эксперименте
Л.Н. Орленкович1, И.М. Ремез2
1ООО «Медицина труда» НИИ охраны труда и здоровья окружающей среды Рижского медицинского университета Паула Страдыня, и/-1007, г. Рига, Латвия 2НИИ охраны труда и здоровья окружающей среды Рижского медицинского университета Паула Страдыня, и/-1007, г. Рига, Латвия
Изучено влияние биоинсектицидов боверина, энтомофторина и лепидоцида на клеточные и субклеточные элементы эффекторов иммунитета плода крыс. Выявлен иммунотоксический эффект препаратов на эмбрион на клеточном и субклеточном уровне. Ключевые слова: биоинсектициды, эмбрион, иммунотоксичность, эмбриотропный эффект.
Введение. Применение производственных штаммов энтомопатогенных микроорганизмов требует санитарной стандартизации готовых форм препаратов на их основе для теплокровного организма. Споры гриба Ве-аveria bassiana (штамма-продуцента боверина) выделяют токсины, вызывающие у работников производства боверина головную боль, субфебрилитет, фолликулярный конъюк-тивит, чешуйчатый блефарит, токсический дерматит, суб- и гипертрофические ринофа-рингиты, вазомоторные риниты, бронхиальную астму, угнетение функции мерцательного эпителия слизистой оболочки носа у 50 % рабочих с большим трудовым стажем. В этой же группе у 40 % рабочих выявлен конъюк-тивит. Аллергизация организма у рабочих зависела от трудового стажа: от года до 5 лет отмечена у 15% рабочих, при большем стаже - у 65 %. Это подтверждено увеличением числа лизированных и агломерированных лейкоцитов, замедлением СОЭ, снижением показателей клеточного и гуморального иммунитета, завершенностью фагоцитоза (5456 %). У инженерно-технического персонала таких заболеваний не выявлено [1, 2, 3, 4]. В США в производстве энтомофторина на основе гриба Entomophthora сoro-nata у 16 мужчин отмечен ринофикомикоз в виде опухолевидных образований на лице без поражения костей лицевого черепа. Диссеминация вы-
явлена после оперативных вмешательств [5]. Энтомофторин на основе гриба E.thaxteriana изучали при планировании производства с оценкой токсичности и опасности в эксперименте [6,7].
Большая занятость женщин в сфере биотехнологии требует от токсикологов обоснования санитарных стандартов с учетом влияния на генеративную функцию, плод и потомство. Регламентация биопрепаратов с учетом количественной и качественной оценки токсического эффекта на плод - главная задача профилактической токсикологии, которая решает вопросы о возможности использования труда женщин в их производстве и применении.
Цель работы - изучение действия биоинсектицидов на клеточные и субклеточные элементы эффекторов иммунитета плода крыс.
Материал и методы исследования. Объектом исследований явились биоинсектициды, созданные на основе энтомопатогенных грибов: энтомофторин (титр препарата (2,5^5)-107 спор/г), боверин (титр препарата (1,5^2)-109 спор/г) и ле-пидоцид (титр препарата 2-109 спор /г), созданный на основе бактерий Bacillus thuringiensis var. rnrstaki. Грибные биопрепараты обладают выраженным токсическим действием на репродуктивную функцию насекомых [8, 9]. Лепидоцид, обладающий общетоксическим действием на насекомых, был использован для сравнительной оценки грибных и бактериальных биоинсекти-
Орленкович Лилия Наумовна (Оrlenkovich и^ Nаumovnа), кандидат медицинских наук, микробиолог-гигиенист ООО «Медицина труда» НИИ Охраны труда и здоровья окружающей среды Рижского университета Паула Страдыня, и/-1007, г. Рига, Латвия, orlenkovich@inbox.ru Ремез Инесса Моисеевна (Remez Inessa Moiseevna), кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник НИИ охраны труда и здоровья окружающей среды Рижского университета Паула Страдыня, и/-1007, г. Рига, Латвия, remezinessa@mail.ru.
цидов при изучении их возможного эмбриотроп-ного эффекта с использованием иммунологических и биохимических показателей.
Эксперименты проведены на белых нелинейных самках крыс массой 250-290 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария при естественном освещении на стандартном пищевом рационе. Статистическая группа состояла из 15-20 особей. Исследования проведены в соответствии с методическими рекомендациями [10] согласно правилам Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986). Введение препаратов проводили при повторном ингаляционном поступлении в течение всей беременности на уровне недействующей (1,1±0,1 мг/м3), подпорого-вой (4,1±0,2 мг/м3), пороговой (8,0±0,4 мг/м3) и действующей (19,0±2,4 мг/м3) концентраций энтомофторина, ПДК (0,3±0,05 мг/ м3) и действующей (5,0±0,3 мг/м3) дозы бовери-на, ПДК (0,7±0,08 мг/м3) и действующей (6,0±0,3 мг/ м3) концентрации лепидоцида. Вышеуказанные концентрации препаратов получены по изменениям общетоксических показателей в 4-месячных хронических экс-
периментах при изучении функционального состояния нервной системы и внутренних органов, а также иммунной системы и микрофлоры кишечника при санитарной стандартизации биопрепаратов [4,6,7,10].
Извлечение эмбрионов осуществляли на 20 день беременности после декапитации беременных самок. Для проведения исследований у 15-20 плодов из опытной группы и параллельного контроля выделяли тимус и селезенку. Оценку состояния иммунокомпетентных органов эмбриона проводили разработанным нами «Способом определения эмбриотропно-го действия микробных препаратов». Содержание Т-лимфоцитов в тимусе определяли методом розеткообразования лимфоцитов, активированных ФГА, которые соединяли с эритроцитами барана [11]. Вс3-лимфоциты в селезенке плода определяли активированными ФГА лимфоцитами, соединяя с маркерами В-кле-ток - зернами зимозана, обработанными жидким комплементом сыворотки крови морской свинки [12]. Для оценки влияния биопрепаратов на субклеточном уровне изучали показатели содержания ДНК и РНК в тимусе плода [13].
В настоящее время оценка эмбриотропного действия проводится общепринятыми мето-
Таблица
Показатели содержания Т-лимфоцитов в тимусе, ВсЗ-лимфоцитов в селезенке, ДНК и РНК в тимусе эмбрионов самок, подвергавшихся воздействию биоинсектицидов в течение всей
беременности (М ± т, п = 15-20)
Концентрация препарата, мг/м3 Т-лимфоциты в тимусе % Вс3-лимфоциты в селезенке, % Содержание ДНК в тимусе, мг/гткани Содержание РНК в тимусе, мг/гткани
Контроль 14,0 ± 0,3 29,4 ± 0,4 13,2 ± 0,4 9,7 ± 0,2
Энтомофторин:
1,1 ± 0,1 12,9 ± 1,3 33,0 ± 1,7 10,8 ± 0,7 8,2 ± 0,9
4,1 ± 0,2 12,5 ± 0,3 20,6 ± 1,3** 7,9 ± 0,3** 7,6 ± 1,0
8,0 ± 0,4 11,3 ± 1,2 17,2 ± 1,1** 6,3 ± 0,3** 5,6 ± 0,6**
19,0 ± 2,4 11,0 ± 1,2 12,0 ± 1,1** 3,2 ± 0,3** 3,8 ± 0,5**
Боверин:
0,3 ± 0,05 12,2 ± 0,8 26,3 ± 2,3 13,7 ± 0,8 9,2 ± 0,8
5,0 ± 0,3 12,5 ± 2,8 22,9 ± 1,9** 11,3 ± 0,6 7,7 ± 0,7
Лепидоцид:
0,7 ± 0,08 12,6 ± 1,4 27,1 ± 1,2 11,5 ± 0,5 8,1 ± 0,8
6,0 ± 0,3 11,2 ± 1,5 23,3 ± 2,2* 6,2 ± 0,9** 4,5 ± 1,1**
Примечание. Различия между группами достоверны при * - Р < 0,02; ** - Р < 0,001.
дами исследования с применением морфоме-трических, микроанатомических, гистохимических методов исследования эмбриона [14,15, 16].
Результаты и обсуждение. При изучении общего токсического действия в 20-дневном эксперименте установлено, что особенностью патогенеза энтомофторина, боверина и лепи-доцида является преимущественное поражение иммунной системы как у взрослых особей, так и у потомства [17, 18]. Выявление иммуно-токсического действия препаратов на эмбрион является одним из ранних признаков проявления эмбриотропного эффекта у млекопитающих. Этот малоизученный вопрос представляет научную новизну и ценность.
Как следует из данных таблицы, не выявлено изменений содержания Т-лимфоцитов в тимусе при воздействии всех препаратов. Снижение показателей содержания Вс3-лимфоцитов в селезенке наблюдалось на всех уровнях воздействия энтомофторина, кроме наименьшего. Воздействие боверина и лепидоцида вызывало снижение содержания Вс3-лимфоцитов в действующей концентрации.
Для установления эмбриотропного действия наряду с показателями содержания Т-лимфо-цитов в тимусе и Вс3-лимфоцитов в селезенке использованы биохимические методы оценки содержания ДНК и РНК в тимусе эмбрионов.
В пороговой и действующей концентрациях энтомофторина, а также в действующей дозе лепидоцида выявлено снижение содержания РНК в тимусе эмбрионов опытных групп. На всех уровнях воздействия энтомофторина, кроме минимального, установлено снижение содержания ДНК в тимусе эмбрионов в зависимости «доза-эффект».
Снижение содержания ДНК и РНК без изменения содержания иммунокомпетентных клеток свидетельствует о формировании лимфоцитов со сниженным содержанием нук-леи-новых кислот. Это может существенно влиять на их функциональную активность [19]. Снижение содержания ДНК и РНК с параллельным уменьшением количества Вс3-лимфоци-тов свидетельствует об иммунотоксическом эффекте энтомофторина, что в процессе пост-
натального развития потомства проявилось в виде неполноценности гуморального иммунитета [17,18].
Исследование показателей функционального состояния иммунокомпетентных органов плода является новым дополнением к комплексной оценке эмбриотропного действия с применением морфометрических, микроанатомических, гистохимических методов исследования эмбриона. Ранее нами был выявлен эмбриотропный эффект энтомофторина в системе «мать - потомство» [17]. Для выявления возможного эмбриотропного действия энтомо-фторина на более ранних этапах развития нами в качестве экспериментальной модели был использован эмбрион.
Таким образом, нами установлено, что проявление эмбриотропного действия возможно устанавливать на ранних этапах эмбриогенеза.
В отличие от дорогостоящих методов оценки негативного воздействия на клеточные мембраны лимфоцитов, например, по методу ELISA [20], проточной цитометрии [21], наш метод является общедоступным для лабораторий, связанных с гигиеническим нормированием препаратов биологической и химической природы.
Заключение. Данный способ оценки эмбрио-тропного действия биоинсектицидов позволяет проводить комплексную оценку их вредного действия на клеточном (мембранный аппарат клетки) и субклеточном (ДНК и РНК клетки) уровне. Проведенное исследование показателей функционального состояния имму-нокомпетентных органов эмбриона является чувствительным показателем при оценке токсичности и опасности биопрепаратов и новым дополнением к комплексной оценке с применением морфометрических, микроанатомических, гистохимических методов исследования развивающегося эмбриона.
Мы полагаем, что все новые биоинсектициды с выраженным эмбриотоксическим и го-надотоксическим действием на насекомых подлежат обязательной гигиенической регламентации с целью выявления возможного эм-бриотропного и гонадотропного эффектов в эксперименте.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ИзрайлетЛ. И., Зглите М. э. Промышленность и иммунологическое состояние организма: Научный обзор. М.: ВНИИМИ. Медицина и здравоохранение, 1978; 1.
2. Чечура А. Н., Джагинян А. И., Шляхецкий Н. С., Андреева Л. Н. Особенности изменения иммунологических показателей у рабочих при контакте с биологическими факторами производственной среды. Гигиена труда
и профзаболевания. 1986; 10: 17-20.
3. Израйлет Л. И., Безлюдова Е. П., берзиня Л. А. и др. Гигиена труда
и состояние здоровья рабочих в производстве микробиологических средств защиты растений. Гигиена и профзаболевания. 1974; 1: 172-76.
4. Израйлет Л. И., эглите М. э., Дроздова Л. В. Гигиеническая оценка боверина и некоторые перспективы при-
менения микробиологических средств защиты растений. Гигиена и санитария. 1975; 11: 91-4.
5. Garrison R.G., Nariot F.A., Byyd K.S., Tally G.R. Ultrastructura and election cytochemical studies of Entomophthora coronata. Annales de Microbiologie. 1975; 126 (21): 149-73.
6. Спруджа Д. Р., Слинько В. Н., устиненко А. Н., Калинина Л. Н. Харак-
тер биологического действия мико-инсектицида энтомофторина. Гигиена и санитария. 1987; 3: 76-7. 7. Слинько В. Н., Спруджа Д. Р., Квятковская И. я., Калинина Л. Н. Влияние биопрепарата энтомофторина на теплокровный организм. В кн.: Материалы конференции «Вопросы гигиены труда, профпатологии и охраны окружающей среды в микробиологи-
ческой промышленности». М.: 1986; 41-4.
8. Жданова Т. Д. Репродуктивное поведение насекомых. Доступен в: http://uchit.net/catalog/Biologiya_i_ himiya/86925/.
9. Чударе з. П. Патогенность энто-мофторовых грибов. Известия АН Латвийской ССР. 1982;10: 99-1
10. Саноцкий И. В., ред. Методические рекомендации по токсикометрии. М.: Секретариат СЭВ; 19
11. Novak I.T., Cabral H.R. Rosette formation by macrophages with adhered T-lymphocytes is precluded by inhibitors of antigen processing and presentation. Biocell. 2008; 32 (2): 16912. Калинина Л. Н., Ремез И. М. Векслер х. М., Иващенко М. Е. Способ
REFERENCES:
1. Izraylet L. I., Eglite M.E. Industrial and immunological condition of organism: Scientific review. M.: VNIIMI. Meditsina i zdravookhraneniye, 1978; 1 (in Russian).
2. Chechum A.N., Jaghinyan A.I., Shlyahetsky N.S., Andreeva L.N. Changes of immunolo-gical parameters of workers in contact with working biological factors. Gigiyena truda i prof-zabolevaniya. 1986; 10: 17-20 (in Russian).
3. Izraylet L.I., Bezlyudova E.P., Berzinya.L.A. Occupational and health status of workers in the production of microbial plant protection products. Gigiyena i profzabolevaniya. 1974; 1: 172-76 (in Russian).
4. Izraylet L.I., Eglite M.E., Drozdova L.v. Boverin hygienic evaluation and some prospects for the application of microbial plant protection preparations. Gigiyena
i sanitariya. 1975; 11: 91-4 (in Russian).
5. Garrison R.G., Nariot F.A., Byyd K.S., Tally G.R. Ultrastructura and election cytochemi-cal studies of Entomophthora coronata. Annales de Microbiologie. 1975; 126 (21): 149-73.
6. Sprudzha D.R., Slinko v.N, ustinenko A.N., Kalinina L.N. Fungus insecticide
определения эмбриотропного действия микробных препаратов. А.С. № 1561036 (СССР): Бюллетень изо-брете-ний. 1990; 16.
13. GallagherS.R. Quantitation of DNA and RNA with Absorption and Fluorescence Spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 2011; Appendix 3D. Available at: http:// www.10.1002/0471142727.mba03ds
14. Wilson J.G. Present status of drugs as teratogen in man. Teratology. 1970; 50: 1140-45.
15. Дыбан А. П., Баранов В. С., Акимова И. М. Основные методические подходы к тестированию тератогенной активности химических веществ. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1970; 10: 89-99.
entomo-ftorin biological action character. Gigiyena i sanitariya. 1987; 3: 76-7 (in Russian).
7. Slinko V.N., Sprudzha D.R., Kvyatkovskaya I.Y., Kalinina L.N. Biopreparation entomofto-rin influence on warm-blooded animals organism. In: Issues of occupational health, occupational diseases and environmental protection in the microbiological industry»: Materials of the conference. M.: 1986; 41-4 (in Russian).
8. Zhdanova T.D. Reproductive behavior of insects. Available in: http://uchit.net/ catalog/Biologiya_i_himiya/86925/.
9. Chudare Z.P. Entomophthorales fungi pathogenicity. Latvian SSR Sciences Academy Proceedings. 1982; 10: 99104. (in Russian)
10. Sanotskiy I.V., ed. Methodical recommendations in toxicometry. M.: Sekretariat SEV; 1987 (in Russian).
11. Novak I.T., Cabral H.R. Rosette formation by macrophages with adhered T-lymphocytes is precluded by inhibitors of antigen processing and presentation. Biocell. 2008; 32 (2): 16912. Kalinina L.N., Remez I.M., Veksler
16. Каспаров А. А., Саноцкий И. В. ред. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду.
М.: Центр Международных Проектов ГКНТ; 19
17. Ремез И. М., Орленкович Л. Н. Влияние биоинсектицида энтомофто-рина на показатели иммунитета беременных самок крыс и их потомства. В кн.: Материалы ХМ кон-ференции «Современные проблемы медицины труда, гигиены и экологии человека». Кемерово: 2011; 54-7.
18. Ремез И. М., Орленкович Л. Н. Оценка риска воздействия биоинсектицидов боверина и лепидоцида на иммунную систему материнского организма и потомства в эксперименте. В кн.: Материалы Х1/!! конференции
H.M., Ivashchenko M.E. Method of microbial prepa-rations embryotropic effect definition. Patent USSR, Nr. 1561036; 1990 (in Russian).
13. Gallagher S.R. Quantitation of DNA and RNA with Absorption and Fluorescence Spe-ctroscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 2011; Appendix 3D. Available at: http:// www.10.1002/0471142727.mba03ds
14. Wilson J.G. Present status o f drugs as teratogen in man. Teratology. 1970; 50: 1140-45.
15. Dyban A.P., Baranov V.S., Akimova
I.M. The main methodical approaches of chemical substances teratogenic activity testing. Arkhiv anatomii, gistologii i embriologii. 1970; 10: 89-99
(in Russian).
16. KasparovA.A., Sanotskiy I.V. ed. Toxicometry of chemicals, polluting the environment. M.: Tsentr Mezhdunarodnykh Proektov GKNT; 1986 (in Russian).
17. Remez I.M., Orlenkovich L.N. Bioinsecticide entomoftorin influence at immunity indi-ces of pregnant females rats and their posterity. In: Occupational,
«Влияние окружающей и производственной среды на здоровье человека, пути решения и проблемы». Кемерово: 2012; 16919. Хаитов Р. М. Иммунология. М.: Медицина; 2011
20. kolosova A.Y., Park J-H., Eremin S.A., Park S-J., kang S-J, Shim W-B. et al. Compara-tive study of three immunoassays based on monoclonal antibodies for detection of the pesticide parathionmethyl in real samples. Analytica Chimica Acta. 2004; 511: 323-31.
21. Mittar D., Paramban R., Mclntyre C. Flow Cytometry and High-Content Imaging to Iden-tify Markers of Monocyte-Macrophage Differentiation. BD Biosciences. 2011; 1: 1-18.
hygiene and human eco-logy modern problems: XLVI Confer. Kemerovo, 2011; 54-7 (in Russian).
18. Remez I.M., Orlenkovich L.N. Bioinsecticides boverin and lepidocid risk influence esti-mation on the immune system of the females organism and posterity in the experiment. In: Environmental and occupational influence on human health, solutions and problems: XLVII Confer. Kemerovo, 2012; 169-73 (in Russian).
19. KhaitovR.M. Immunology. M.: Meditsina; 2011 (in Russian).
20. Kolosova A.Y., Park J-H., Eremin S.A., Park S-J., Kang S-J., Shim W-B. et al. Compara-tive study of three immunoassays based on monoclonal antibodies for detection of the pesticide parathionmethyl in real samples. Analytica Chimica Acta. 2004; 511: 323-31.
21. Mittar D., Paramban R., McIntyre C. Flow Cytometry and High-Content Imaging to Iden-tify Markers of Monocyte-Macrophage Differentiation. BD Biosciences. 2011; 1: 1-18.
L.N. Orlenkovich1, I.M. Remez2
ASSESSMENT METHODS OF EMBRYOTROPIC ACTION OF BIO INSECTICIDES
IN EXPERIMENTS
'Limited Liability Company «Institute of Occupational Health», Institute of Occupational Safety and Environmental Health, P.Stradins Riga Medical University,LV-1007, Latvia
institute of Occupational Safety and Environmental Health, P.Stradins Riga Medical University,LV-1007, Latvia
The impact of bio-insecticides Boverin, Entomophthora and Lepidicide on cellular and sub-cellular immune effectors elements in rat fetuses was investigated. Preparations immunotoxic effect on embryos at the cellular and sub-cellular levels was found out. Keywords: bio-insecticides, embryo, immunotoxicity, embryotropic effect.
Переработанный материал поступил в редакцию 07.11.2014 г.
