CC BY
7
УДК 57.085.23
Метод оценки эффективности работы системы эксцизионной репарации нуклеотидов ex vivo
А. А. Попов1, К. Е. Орищенко2,3, К. Н. Науменко1, А. Н. Евдокимов1, И. О. Петрусева1, О. И. Лаврик13*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, 630090 Россия
2Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, 630090 Россия 3Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, 630090 Россия *E-mail: lavrik@niboch.nsc.ru Поступила в редакцию 06.02.2021 Принята к печати 23.04.2021 DOI: 10.32607/actanaturae.11430 РЕФЕРАТ Эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН) - одна из основных систем репарации, которая отвечает за удаление широкого спектра объемных повреждений ДНК. Разработан метод анализа эффективности ЭРН в клетке (ex vivo), основанный на восстановлении продукции флуоресцентного белка TagRFP в результате репарации повреждений, блокирующих экспрессию соответствующего гена. Показано, что сконструированные плазмиды, содержащие объемные повреждения nFlu или nAnt вблизи промотора гена tagrfp, подвергаются репарации в эукариотических клетках (HEK 293T) и могут быть использованы для анализа эффективности ЭРН ex vivo. Сравнительный анализ временной зависимости накопления флуоресцентных клеток после трансфекции nFlu- и nAnt-ДНК выявил различия в эффективности их репарации системой ЭРН клеток HEK 293T. Разработанный метод может быть использован для сравнения репаративного статуса клеток и эффективности репарации повреждений разной структуры. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА эксцизионная репарация нуклеотидов, методы ex vivo, повреждения ДНК. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидов; ОДН - олигодезоксирибонуклео-тид; ATP - аденозинтрифосфат; nFlu - ^[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол; nAnt - ^[6-(9-антраценилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол; MCS - сайт множественного клонирования.
ВВЕДЕНИЕ Использование подходов, ориентированных на из-
Система эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) учение структуры и функций белков-участни-с высокой эффективностью удаляет из ДНК объем- ков ЭРН, позволило выяснить механизм процесса, ные повреждения, возникающие в результате воз- определить основные этапы, влияющие на эффек-действия различных факторов - химически актив- тивность его протекания, а также состав и струк-ных соединений, УФ- и рентгеновского излучения. туру мультибелковых комплексов, возникающих Существуют два типа ЭРН. Общегеномная ЭРН от- и функционирующих на разных этапах ЭРН [1, 3]. вечает за поиск и удаление объемных повреждений Активность эукариотической системы ЭРН in vitro во всем геноме, независимо от его функционально- в большинстве работ оценивают с использовани-го состояния, используя для первичного распозна- ем протяженных ДНК, содержащих в заданной по-вания места повреждения комплексы фактора XPC зиции природные объемные повреждения, либо [1]. ЭРН, связанная с транскрипцией, активируется их синтетические аналоги, а также фракциониро-при блокировании продвижения транскрипционного ванные экстракты клеток, содержащие набор бел-комплекса РНК-полимеразы II объемным повреж- ков ЭРН (ЭРН-компетентные экстракты) [4, 5]. Тем дением в транскрибируемой цепи ДНК [2]. Примерно не менее, актуальной как для фундаментальных, 30 белковых факторов и ферментов, одинаковых так и для прикладных исследований остается разра-для обоих типов ЭРН, формируют затем на ДНК ряд ботка подходов, нацеленных на исследование и срав-комплексов, осуществляющих удаление поврежде- нение эффективности протекания репарации объем-ния, репаративный синтез и лигирование. ных повреждений в живых клетках (ex vivo).
Pcmv ie
I. Рестрикция
Химические структуры повреждений Q
Фрагмент
Т4-ДНК-лигаза ATP
с повреждением
II. Лигирование
IV.Фазово-контрастная и флуоресцентная микроскопия
Lipofectamine™ 2000 III. Трансфекция
V. Анализ изображений
Время, ч
Рис. 1. Схема метода оценки эффективности работы системы ЭРН ex vivo
В данной работе приведено описание разрабо- Последовательности °ДН танного нами метода, который позволяет проводить такие оценки с использованием модельных плазмид с объемным повреждением вблизи промоторной области гена, кодирующего флуоресцентный белок TagRFP. Схема создания модельных плазмид с объемным повреждением и оценки эффективности ЭРН ex vivo путем наблюдения за результатом восстановления репаративным аппаратом эукариотических клеток экспрессии репортерного флуоресцентного белка, нарушенной присутствием объемного повреждения в ДНК, представлена на рис. 1.
№ ОДН
1 5'-P-agctgctgctcatctcgagatctgagtacattggattgccat-tctccgagtgtattaccgtgacg-3'
2 5'-P-gatccgtcacggtaatacactcggagaatggcaatcca-atM1tactcagatctcgagatgagcagc-3', где Ml - nFlu
3 5'-P-gatccgtcacggtaatacactcggagaatggcaatcca-atM2tactcagatctcgagatgagcagc-3', где M2 - nAnt
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клетки НЕК 293Т культивировали в среде IMDM (Gibco) с добавлением 10% FBS (Gibco), 1% GlutaMAX™ Supplement (Gibco), 105 ед. /л пенициллина, 100 мг/л стрептомицина, 2.5 мг/л амфотерици-на в, при температуре 37°С и 5% СО2.
ОДН для создания вставок синтезированы в лаборатории биомедицинской химии (ИХБФМ СО РАН) по методике, описанной в работе [5]. Последовательности ОДН приведены в таблице.
Из плазмиды pTagRFP-N с помощью эндонуклеаз рестрикции HindIII и BamHI («СибЭнзим») вырезали участок длиной 38 п.н. (622-660 п.н., MCS) путем инкубации 1 мкг плазмиды с 1 ед. HindIII и 1 ед. BamHI в буфере W («СибЭнзим») в течение 1 ч при 37°С. После инактивации ферментов (70°С, 20 мин) и осаждения ДНК по стандартной методике [6], линеари-
зованную плазмиду растворяли в воде и добавляли 40-кратный молярный избыток ДНК-вставки, 2 ед. Т4-ДНК -лигазы («СибЭнзим») в SE-буфере и 5 мМ ATP. Лигирование плазмиды проводили при температуре 12°С в течение 16 ч, затем реакционную смесь прогревали (65°С, 20 мин), а ДНК, содержащуюся в реакционной смеси после лигирования, разделяли в 0.8% агарозном геле. Кольцевую плазмиду с введенными вставками элюировали из агарозного геля с использованием набора для элюции ДНК (diaGene) согласно протоколу производителя.
Трансфекцию клеток плазмидой проводили с помощью Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) согласно протоколу производителя. Клетки рассаживали на 24-луночный планшет в количестве 2.5 х 104 клеток на лунку в 500 мкл культуральной среды, не содержащей антибиотиков. По достижению 5070% конфлюентности среду удаляли и добавляли к клеткам комплекс плазмиды (150 нг) с реагентом Lipofectamine™ 2000 в среде, не содержащей сыворотки. Флуоресценцию регистрировали с исполь-
зованием системы для длительного прижизненного наблюдения за клетками Cell-IQ MLF (Chip-Man Technologies, Финляндия) в ЦКП клеточных технологий ФИЦ ИЦиГ СО РАН. Съемку клеток проводили с интервалом 10 мин в режимах фазового контраста и флуоресценции с использованием Х10 объектива Nikon CFI Plan Fluorescence DL. Полученные изображения анализировали с помощью программы ImageJ и программного обеспечения Cell-IQ Analyser.
Статистический анализ осуществляли с помощью программы StatisticalO. Все эксперименты проведены минимум 3 раза, а статистическую значимость определяли, используя t-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Подход, основанный на реактивации экспрессии флуоресцентных белков после удаления повреждения из ДНК, блокирующего их экспрессию, ранее успешно применяли в исследованиях ЭРН [7, 8]. Мы решили модифицировать этот подход и регистрировать флуоресцентный сигнал в живых клетках с помощью оборудования для прижизненных исследований Cell-IQ MLF, которое сочетает в себе микроскоп с фазово-контрастным и флуоресцентным режимами съемки, а также систему для подачи СО2 и поддержания температуры, обеспечивающую создание оптимальных для клеток условий при достаточно длительном процессе съемки. Прилагаемое к оборудованию программное обеспечение позволяет анализировать изображения и извлекать информацию об общем количестве и количестве клеток, экс-прессирующих флуоресцентные белки, интенсивности флуоресцентного сигнала, подвижности клеток, а также анализировать другие параметры.
Для создания ДНК с объемными повреждениями использовали вектор pTagRFP-N (4.7 т.п.н.), ко-
торый содержит ген tagrfp, кодирующий мономерный флуоресцентный белок RFP морских актиний Entacmaea quadricolor [9]. Преимущества использования TagRFP заключаются в генерируемом ярком флуоресцентном сигнале, стабильности белка при высоких значениях рН, быстром созревании, а также в отсутствии токсического влияния на клетки. Ген tagrfp находится под контролем раннего промотора цитомегаловируса (Pcmv ie), вблизи которого находится сайт множественного клонирования (MCS) с участками узнавания различных эндонуклеаз рестрикции, что дает возможность клонирования необходимой ДНК-вставки в данную область.
Синтезированы рекомбинантные плазмиды, содержащие объемные повреждения nFlu и nAnt (далее nFlu- и nAnt-ДНК соответственно). Выраженные субстратные свойства данных повреждений, выявленные в реакции специфической эксцизии, катализируемой белками ЭРН различных клеточных экстрактов in vitro [5, 10], учитывали при использовании nFlu и nAnt для создания модельных плазмид.
Проанализирована эффективность протекания ЭРН nFlu- и nAnt-ДНК в клетках эмбриональной почки человека HEK 293T. Оценено время появления клеток, флуоресценция которых свидетельствовала о восстановлении экспрессии белка TagRFP (рис. 2). В качестве контроля использовали плазмиду, содержащую ДНК-вставку без объемного повреждения. Оценка количества флуоресцентных клеток в общей популяции клеток с помощью Cell-IQ Analyser и ImageJ выявила различия в эффективности репарации nAnt- и nFlu-ДНК. В случае клеток, для транс-фекции которых использовали nAnt-ДНК, первые флуоресцентные клетки можно было наблюдать через 10 ч после трансфекции, в то время как в случае nFlu-ДНК время появления первых флуоресцент-
Контроль
nFlu-ДНК
6 ч
«И • - , ■•
12 ч
34»' „ <*r&V ¿'•с ■ - \JM ..
18 ч
•'Чл <
nAnt-ДНК
ими •-•uß Frmi 1к.
в «1 л ; ; 1л ».m ж улйа^» «; ч 1ч 'l'î'^-" шш
24 ч
Рис. 2. Экспрессия TagRFP в клетках НЕК 293Т, трансфициро-ванных плазмидными ДНК. Представленные изображения получены путем наложения флуоресцентных и фазово-контрастных снимков с помощью ImageJ. Слева указаны типы плазмидных ДНК-субстратов; сверху -время после трансфек-ции клеток
35
o4 X 30
X
ет л 25
X
е 20
X
т н 15
е
ZS
и е 10
р
о 5
л
e 0
Л
Контроль nFlu-ДНК nAnt-ДНК
0 2 4 6 8
10 12 14 16 18 20 22 24 Время, ч
X X
т е л
X
.0
н т н
е и
и
е р
о л
е
л
12 ч
16 ч
Контроль □ nFlu-ДНК ; nAnt-ДНК
Рис. 3. Анализ эффективности ЭРН плазмидных ДНК ex vivo в клетках HEK 293T. А - график изменения количества флуоресцентных клеток (%) во времени после трансфекции плазмидными ДНК; Б - репрезентативная диаграмма, демонстрирующая различия в количестве флуоресцентных клеток, трансфицированных nFlu- или nAnt-ДНК, через 12 и 16 ч после трансфекции. Статистические уровни значимости соответствуют *p < 0.01 и **p < 0.05
Б
ных клеток составило 8 ч (рис. 3А). Через 12 ч после трансфекции клеток nAnt-ДНК количество флуоресцентных клеток составило 1.56 ± 0.39%, в то время как в случае nFlu-ДНК количество флуоресцентных клеток составило 4.59 ± 0.76% (рис. 3Б). Для достижения близкого количества флуоресцентных клеток, трансфицированных nAnt-ДНК, потребовалось еще 2 ч, и через 14 ч оно составило 4.27 ± 0.67%.
Репарация nFlu-ДНК проходит быстрее, чем nAnt-ДНК, что согласуется с результатами изучения репарации nAnt- и nFlu-содержащих ДНК-дуплексов in vitro в присутствии белков ЭРН-компетентных экстрактов различных линий раковых клеток (HeLa, SiHa, C33A) [5].
Существует много факторов, определяющих разницу в эффективности удаления объемных повреждений системой ЭРН. Это могут быть структурные различия повреждений, определяющие характер первичного узнавания поврежденного участка и эффективность последующей верификации повреждения белками комплекса TFIIH [11], а также скорость и эффективность ответа системы ЭРН различных
клеток на повреждающее воздействие. Дальнейшее изучение ЭРН с использованием комбинации методов in vitro и ex vivo может способствовать значительному прогрессу в понимании функционирования данного процесса в клетках эукариот.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, предложенный нами метод позволил определить эффективность удаления объемных повреждений nAnt и nFlu из модельных плазмид системой ЭРН клеток HEK 293T. Метод является перспективным инструментом изучения ЭРН, он позволяет сравнивать как репаративный статус различных клеток, так и эффективность репарации повреждений различной структуры.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-74-10056), получение и анализ изображений частично выполнены в рамках бюджетного проекта № 0259-2021-0011.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Schärer O.D. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013. V. 5. № 10. P. 1-20.
2. Svejstrup J.Q. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. V. 3. № 1. P. 21-29.
3. Luijsterburg M.S., von Bornstaedt G., Gourdin A.M., Politi A.Z., Mone M.J., Warmerdam D.O., Goedhart J., Vermeu-len W., van Driel R., Höfer T. // J. Cell Biol. 2010. V. 189. № 3. P. 445-463.
4. Reardon J.T., Sancar A. // Methods Enzymol. 2006. V. 408. P. 189-213.
5. Evdokimov A., Petruseva I., Tsidulko A., Koroleva L., Serpok-rylova I., Silnikov V., Lavrik O. // Nucl. Acids Res. 2013. V. 41. № 12. P. 1-10.
6. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor University Press, 2001. 2231 p.
7. Kitsera N., Gasteiger K., Lühnsdorf B., Allgayer J., Epe B., Carell T., Khobta A. // PLoS One. 2014. V. 9. № 4. P. 1-6.
8. Kitsera N., Rodriguez-Alvarez M., Emmert S., Carell T., Khobta A. // Nucl. Acids Res. 2019. V. 47. № 16. P. 8537-8547.
9. Merzlyak E., Goedhart J., Shcherbo D., Bulina M., Shcheglov A., Fradkov A., Gaintzeva A., Lukyanov K., Lukyanov S., Gadella T.W.J., et al. // Nat. Methods. 2007. V. 4. № 7. P. 555-557.
10. Lukyanchikova N., Petruseva I., Evdokimov A., Silnikov V., Lavrik O. // Biochem. 2016. V. 81. № 3. P. 263-274.
11. Batty D.P., Wood R.D. // Gene. 2000. V. 241. № 2. P. 193-204.
