CC BY
9
Методы исследования
УДК 612.351.11-087.5
Канд. мед. наук Т. А. Попов, О. Б. Леоненко
МЕТОД ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ОКСИДАЗ ПЕЧЕНИ
Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных л пластических масс, Киев
Биотрансформация чужеродных организму химических веществ состоит из ряда метаболических превращений, многие из которых осуществляются с помощью гидроксилирующей ферментной системы эндоплазмати-ческого ретикулума печени — оксидазами смешанной функции (ОСФ). В связи с этим ряд актуальных вопросов гигиены, токсикологии и профпа-тологии, среди которых проблемы адаптации, кумуляции, комбинированного действия, экстраполяции данных с экспериментальных животных на человека, выявления преморбидных состояний химической этиологии, связан с активностью ОСФ.
Известные методы оценки активности микросомальных ОСФ печени целого организма (а не гомогенатов) по накоплению метаболитов амидопирина (пирамидона) — АП в моче (ВгосП и Ахе1гос1) и путем определения снижения концентрации этого препарата в крови (Лоп и соавт.) недостаточно точны. Примененная авторами многократная экстракция хлороформом заведомо снижает точность и воспроизводимость метода. Кроме того, наложение спектров поглощения АП и его метаболитов при последующем спектрофотометрическом изучении искажает результаты. Предложенные за последние годы методы определения метаболитов АП в моче (Огас1шк и Р^эсЬтапп; Т. 01ик1е\у1сг и В. Ои1к1еш1сг) тоже не удовлетворяют современным требованиям, так как обследование проводится полуколичественно (хроматография в тонком слое) после многократной экстракции разными растворителями. Колориметрический метод, примененный М. В. Ко-мендантовой и Е. А. Горбатовой для определения одного из метаболитов АП, основан на диазотировании. Неспецифичность метода и нестабильность появляющейся окраски делают его непригодным. Все это объясняет ограниченное применение методов для оценки активности ОСФ печени целого организма.
Из литературы (М. Д. Швайкова) известно, что биотрансформация АП в организме осуществляется с помощью ОСФ печени и приводит к образованию 2 основных метаболитов — 4-аминоантипирина (4-ААП) и М-аце-тил-4-аминоантипирина (Ы-Ац ААП). Первый этап метаболизма осуществляется путем И-деметилирования АП. Далее 4-ААП как чужеродный амин подвергается реакции биологического ацетилирования через промежуточное соединение с коэнзимом А и образованием ацетилового конъюгата — Ы-Ац ААП (второй этап).
Разработанный нами метод позволяет оценивать активность ОСФ одновременно по динамике взаимосвязанных процессов деметилирования и ацетилирования в целях выявления ранних нарушений функционального состояния печени в клинике и эксперименте. Нагрузку АП проводили из расчета на 1 кг исследуемого живого организма и затем оценивали демети-лирующую способность соответственно по отношению количества 4-ААП и 1^-Ац ААП в моче и введенному количеству АП. Содержание метаболитов в моче определяли разработанным нами колориметрическим методом, основанным на образовании ими с фенолом соединения типа индофенола красного цвета в щелочной среде в присутствии феррицианида калия.
Нагрузка АП (пирамидоном). Исследование следует осуществлять на людях, не принимавших лекарственных препаратов в течение 10 дней и алкоголя за последние 3 дня. АП принимают из расчета 6 мг/кг (максимальная однократная доза по Государственной фармакопее СССР 500 мг соответствует 8,3 мг/кг), поэтому необходимо знать точный вес исследуемого. В облатки вносят соответствующее количество АП в порошке (например, при весе исследуемого 65 кг следует принять 65x6, т. е. 390 мг). Взвешивать АП лучше на торсионных весах.
Облатку с АП выпивают утром натощак со стаканом (200 мл) кипяченой воды (газированной) или слабого чая, фруктового сока, молока, кефира; выделенную до 6-го часа мочу собирают в чистую посуду. Полученное количество точно замеряют в миллиметрах и часть (20—30 мл) профильтровывают через мелкопористый фильтр. То же повторяют вновь (собирают мочу, выделенную в интервале от 6-го до 12-го часа, часть ее профильтровывают). До 24-го часа собирают мочу в чистую посуду и по истечении этого срока перемешивают все количество, полученное от 12-го до 24-го часа, измеряют его в миллилитрах и часть профильтровывают. Последний раз мочу собирают на 48-й час после нагрузки (2—3-часовую порцию от 45—46-го до 48-го часа); полученное количество измеряют и часть профильтровывают.
По истечении 1 ч после нагрузки можно принимать пищу (желательно неострую) в неограниченном количестве. По желанию разрешается пить жидкости, не содержащие алкоголя. Фильтраты мочи можно хранить при комнатной температуре, а определение метаболитов следует производить не позже 24 ч.
Нагрузку АП экспериментальных животных (белые крысы) проводят внутрибрюшинным введением препарата из расчета 20 мг/кг. Для повышения диуреза после нагрузки вводят в желудок с помощью металлического зонда обычную воду из расчета 2 мл на 100 г веса. Животных сажают в обменные клетки и отбирают мочу на 3,6 и 24-й час.
Для определения основных метаболитов АП необходимы следующие реактивы: 1) стандартный раствор 4-АДП— 10 мг в 10 мл дистиллированной воды (в 1 мл 1000 мкг), который готовят в день построения калибровочной кривой; 2) 0,02% раствор фенола — 20 мг кристаллического (непо-красневшего) фенола в 100 мл дистиллированной воды; 3) 1 % раствор красной кровяной соли — 100 мг в 10 мл дистиллированной воды; 4) аммиачный буфер (рН 10,50—10,60) — 20 г хлорида аммония растворяют в 100 мл концентрированного 25% аммиака; 5) 12,5% раствор трихлорук-сусной кислоты — 12,5 г в 100 мл дистиллированной воды; 6) концентрированная соляная кислота (36%, удельный вес 1,17—1,19).
Определение 4-ААП. К 5 мл фильтрата мочи добавляют 1 мл аммиачного буфера1 и через 15 мин фильтруют.
К 0,6 мл прозрачного фильтрата добавляют 0,5 мл 12,5% трихлор-уксусной кислоты, 2 мл фенола, 0,1 мл красной кровяной соли и перемешивают. Через 10 мин (не позже 60 мин) замеряют экстинкцию при 510 нм в кювете 10 мм против контроля, содержащего все компоненты пробы, кроме фенола, который заменен 2 мл дистиллированной воды.
Содержание 4-ААП в моче (в микрограммах в 1 мл) учитывают по калибровочной кривой. Общее его количество, выделенное за данный период, определяют умножением полученного результата на количество миллилитров выделенной мочи.
Построение калибровочной кривой производится следующим образом. В ряд из 5 пробирок вносят соответственно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 мл стандартного раствора 4-ААП. В каждую пробирку добавляют 4,95, 4,90, 4,80, 4,70 и 4,60 мл профильтрованной контрольной (заведомо не содержащей 4-ААП) мочи. Во все пробирки вносят по 1,0 мл аммиачного буфера и об-
1 При проведении пробы на животных берут соответственно 1,5 мл мочи и 0,3 мл аммиачного буфера.
рабатывают аналогично описанной выше пробе. Полученные экстинкции соответствуют 5, 10, 20, 30 и 40 мкг/мл.
Для определения ^Ац ААП проводят превращение его в 4-ААП путем гидролиза, условия которого, обеспечивающие эквимолярное превращение 1М-Ац ААП в 4-ААП, отработаны в специальной серии опытов. В колбочку с 10 мл профильтрованной мочи добавляют 2 мл концентрированной соляной кислоты закрывают пробкой, обернутой фольгой, и оставляют при комнатной температуре. Через 20—30 мин колбочку помещают в кипящую водяную баню ровно на 15 мин, затем сразу охлаждают в ледяной воде до комнатной температуры и фильтруют гидролизат через мелкопористый фильтр. В 2,4 мл фильтрата вносят 0,8 мл аммиачного буфера, оставляют на 15 мин 2 и опять фильтруют. К 0,8 мл прозрачного фильтрата добавляют последовательно 2 мл фенола и 0,1 мл красной кровяной соли и перемешивают. Через 10 мин (но не позже 60 мин) замеряют экстинкцию при 510 нм в кювете 10 мм против контроля, содержащего все компоненты пробы, кроме фенола, который заменяют 2 мл дистиллированной воды.
Полученная экстинкция соответствует сумме метаболитов (4-ААП и Ы-Ац ААП). Содержание суммы метаболитов учитывают по калибровочной кривой. Разность между ним и содержанием 4-ААП соответствует количеству Ы-Ац ААП в 1 мл исследуемой мочи. Общее количество его, выделенное за данный период, определяют умножением полученного результата (в микрограммах в 1 мл) на количество миллилитров выделенной мочи.
Построение калибровочной кривой. В ряд из 5 колбочек вносят соответственно 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,50 мл стандартного раствора 4-ААП. В каждую колбочку добавляют соответственно 4,75, 4,50,4,25, 4,00 и 3,75 мл профильтрованной мочи. Во все колбочки помещают 1 мл концентрированной соляной кислоты и обрабатывают аналогично описанной выше пробе. Полученные экстинкции соответствуют 25, 50, 75, 100, 125 и 150 мкг/мл. Обе калибровочные ^кривые подчиняются закону Бугера — Ламберта — Бера в пределах указанных концентрацией.
Результаты представляются в процентах от введенного количества. Например, исследуемый человек весом 60 кг принял 360 мг АП и за 6 ч выделил 500 мл мочи, в которой содержание 4-ААП было 5 мкг/мл, а Ы-Ац ААП — 30 мкг/мл, т. е. всего выделено 4-ААП 2,5 мг, Ы-Ац ААП 15 мг. Эти количества соответствуют 0,69 и 4,16% принятого АП.
При определениях одной и той же величины, проведенных в одинаковых условиях, могут получаться разные результаты, что можно объяснить случайными (несистематическими) ошибками. Статистические критерии дают возможность оценить количественно вероятность ошибочных результатов. Основными критериями служат показатели точности (Р) метода и относительной вариабельности (У) получаемых результатов. Значения этих показателей по результатам 10 параллельных определений подсчиты-ваются по формулам:
Р = -^-100%; V = ■^"•100%.
Оба показателя были ниже 1 %, что свидетельствует о высокой воспроизводимости метода.
Предлагаемый метод апробирован нами в экспериментальных исследованиях на крысах с моделированной индукцией и ингибицией ОСФ, а также при исследовании людей, имеющих профессиональный контакт с пестицидами.
1 При проведении пробы на животных берут в пробирку соответственно 1,5 мл мочи и 0,3 мл концентрированной соляной кислоты. к
При проведении пробы на животных к охлажденному гидролизату добавляют 0,6 мл аммиачного буфера.
Выводы
1. Разработан новый метод оценки активности ОСФ печени у людей и экспериментальных животных, основанный на проведении нагрузки АП с последующим определением деметилирующей и ацетилирующей способности соответственно по отношению количества 4-ААП и N-Ац ААП в моче к введенному амидопирину.
2. Разработанный колориметрический метод определения метаболитов АП обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью.
3. Метод может быть использован для выявления доклинических форм патологии печени у людей и ранней диагностики нарушений функционального состояния этого органа в условиях эксперимента.
ЛИТЕРАТУРА. Комендантова М. В., Горбатова Е. А.— «Фармакол. и токсикол.», 1964, № 4, с. 409—413,— Швайкова М. Д. Токсикологическая химия. М., 1975, с. 376. — Brodi В., AxelrodJ.—«J.Pharmacol, exp. Ther.», 1950, 99, 171—184. — Dutkiewicz Т., DutkiewiczB. — «Chem. ana-lit.», 1972, v. 17, p. 643—646. —Gradnik B.,Fleischmann L.— «Pharm. Acta helv.», 1973, Bd 48, S. 181—191. — J о r i A., Di Salle E., Q a d г i A. — «Pharmacology», 1972, v. 8, p. 273—279.
Поступила 27/VII 1976 r.
УДК 614.72:646.224-31
К. А. Буиипуева, М. Д. Манита, Т. А. Вильнер, А. А. Галич
О КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ СЕРНИСТОГО ГАЗА В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ
Центральный институт усовершенствования врачей, Москва, Московская городская санэпидстанция
Для количественного определения сернистого газа в атмосферном воздухе при массовых анализах в настоящее время используются преимущественно нефелометрический и фотометрический (парарозанилиновый) методы. В нашей стране в последние годы нашел применение регистрирующий кулоно-полярографический газоанализатор ГКП-1 (Е. А. Перегуд и соавт.). При воспроизводимости нефелометрического метода1 мы получили калибровочную прямую зависимость оптической плотности (О) от концентрации (С) сернистого газа в растворе D = /-С (рис. 1). Как видно из рис. 1, имеется значительный разброс оптической плотности всех испытанных эквивалентных концентраций 502 стандартных растворов, что свидетельствует о неудовлетворительной воспроизводимости: чувствительность составляет 5 мкг в пробе (Р = 0,03) с относительной ошибкой измерения на ФЭК <±30%. Определению мешают БОз, Нг504 и растворимые сульфаты.
Описано несколько модификаций фотометрического парарозанилино-вого метода. В модификации, рекомендованной в рамках стран — членов СЭВ — для улавливания сернистого газа из воздуха используется 0,1 М поглотительный раствор тетрахлормеркурата натрия (ТХМ) и указывается, что присутствие в воздухе двуокиси азота в концентрации 4 мг/м* мешает определению сернистого газа*. По модификации, рекомендованной ВОЗ в 1972 г., вместо 0,1 М используется 0,04 М поглотительный раствор; для связывания ионов тяжелых металлов в растворе, которые могут окислять 502 в БОз, рекомендуется добавлять двунатриевую соль этилен-диаминтетрауксусной кислоты (трилон Б); для разрушения аниона нит-
1 Инструктивно-методические указания по организации исследования загрязнения атмосферного воздуха. М., Медгиз, 1963, с. 28.
* Сборник СЭВ «Унифицированные методы определения [атмосферных загрязнений». М. 1970, ч. 1, с. 7.
