CC BY
27Вестник защиты растений, ,3, 2001 УДК 633.11:632.95.025.8
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕН РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ К ФУНГИЦИДАМ Г.В.Волкова
Всероссийский НИИ биологической защиты растений, Краснодар
Описан метод определения устойчивости к фунгицидам ржавчинных грибов. Метод основан на выявлении реакции урединиоспор на серию концентраций изучаемых фунгицидов. Описаны необходимые оборудование и материалы, методы сбора биоматериала с помощью технических устройств и вручную, особенности закладки опытов и инкубирования проб.
Возбудители ржавчинных болезней пшеницы распространены практически повсеместно и занимают из года в год доминирующее положение в составе патогенных комплексов, лимитирующих урожайность культуры в сельскохозяйственных регионах России. Инфекционное начало (урединиоспоры) ржавчинных грибов распространяется воздушными потоками на десятки и сотни километров. При благоприятных для развития болезни погодных условиях массовое поражение посевов зерновых культур может охватывать значительные площади, принимая характер разрушительных эпифи-тотий: потери урожая могут достигать 30-50% (Санин,1998). Радикальным приемом защиты от ржавчины является применение фунгицидов. Однако в ряде случаев отмечено возникновение устойчивости у ржавчинных грибов к применяемым препаратам. Так, установлено развитие резистентности возбудителей ржавчинных болезней в полевых или лабораторных условиях у Puccinia graminis Pers. к каптану (Поляков,Менде,1965), у P.striiformis West. к байлетону (Волко-ва,1997) и др. В связи с этим остро стоит вопрос о своевременном выявлении резистентности ржавчинных грибов к применяемым препаратам. Для этого необходима разработка методов определения резистентности. Предлагаемый метод базируется на оценке реакции урединиос-пор ржавчинных грибов на серию концентраций изучаемых фунгицидов.
Для проведения исследований требуется следующее оборудование и материалы: стерильный бокс, камера искусственного климата, холодильник, термостат, камера для обработки растений
фунгицидом, компрессор, лабораторная распылительная установка, весы, микроскоп, лупа, кюветы, изоляторы стеклянные, эксикаторы, скальпель, пульверизатор, прибор для отбора проб воздуха, химическая посуда. Химические реактивы: гидрозид малеиновой кислоты, аде-нин, глютатион, метионин, этанол-ректификат, раствор Кнопа, фунгициды.
Сбор биоматериала может проводиться с помощью технических средств или вручную.
Отбор проб спор ржавчины с помощью технических средств осуществляют из воздушной среды при переносе инфекции либо непосредственно с пораженных растений с помощью технических устройств. Так, дистанционный мониторинг ржавчинной инфекции можно вести с помощью приборов ПАЗР-1АМ (прибор авиационной разведки заспорен-ности атмосферы) или МАП (малогабаритный авиационный прибор). Приборы оснащены устройствами, позволяющими осаждать выделенные из воздушной пробы споры ржавчины на изолированные листья пшеницы (рис.1).
Отбор проб спор ржавчины из воздуха вблизи пораженных посевов можно проводить также с помощью автомобильного пробоотборника ПВА-3 (прибор устанавливают на автомашине типа УАЗ-452). Отбор ведут во время движения автомобиля со скоростью 30-70 км/ч. Рекомендуется отбирать пробы с подветренной стороны контролируемого поля. Продолжительность отбора устанавливается при помощи реле времени с пульта управления прибором (Соколов и др.,1994). После завершения работы образцы доставляют в лабораторию.
С пораженных растений отбор проб спор ржавчины проводят с помощью портативных устройств (рис.2) и ловушек (рис.3). Устройства снабжены встроенным аспиратором и портативным источником
Вестник защиты растений, ,3, 2001 электропитания. Перед отбором проб входные элементы и контейнеры для биоматериала протирают спиртом. Собранный биоматериал доставляют в лабораторию.
Рис. 1. Устройство для осаждения спор фито-патогенных грибов на изолированные листья растений в приборе ПАЗР-1АМ
Рис. 2. Переносной пробоотборник ЛСИ-2
Вручную сбор биоматериала осуществляют на производственных посевах, где обнаружено развитие ржавчины. Пробы берут рендомизированно в 10 точках зараженного массива. Удаление точек друг от друга 50 м. Каждая проба состоит не менее чем из 10 инфицированных патогеном листьев. Отобранные пробы помещают в бумажные мешки и доставляют в лабораторию.
Рис. 3. Устройство для сбора биоматериала в стеклянный контейнер
Для проведения дальнейших исследований споровую суспензию готовят за 30 мин до начала опыта. В пробирку или чашку Петри стряхивают с листа споры ржавчины, наливают небольшое количе-
ство стерильной дистиллированной воды с твином 21 (0.01%) и тщательно взбалтывают. Для инокуляции можно также использовать смесь спор с тальком (1:20). Инфекционная нагрузка - 50 тыс. жизнеспособных спор в 1 мл воды. Для этого сначала определяют с помощью камеры Горяева исходную концентрацию споровой суспензии, а затем разбавляют водой для получения нужной концентрации и снова контролируют с помощью камеры Горяева.
Раствор фунгицида готовят следующим образом: к отвешенному количеству препарата добавляют воду небольшими порциями и тщательно все перемешивают до получения однородной массы. Затем при постоянном помешивании доливают недостающее количество воды. Для расчета приготовления самого концентрированного из нужных растворов используют формулу:
х = а • v/р,
где v - необходимый для опыта объем раствора, мл; а - содержание действующего вещества в заданном растворе, %; р - содержание действующего вещества в исходном препарате, %.
Растворы разных концентраций готовят методом разбавления. Опыт должен
Вестник защиты растений, ,3, 2001
включать не менее 5-6 концентраций
фунгицида.
Опыты можно проводить на изолированных листьях или на целых растениях.
Для выращивания растений используют 0.5 л вазоны, их наполняют почвенным субстратом (2/3 почвы и 1/3 перегноя с добавлением 5% речного песка). После увлажнения проводят посев наклюнувшимися семенами из расчета 1015 растений на 1 вазон. Затем вазоны помещают в теплицу или камеру искусственного климата с температурой 18-25°С и освещенностью не менее 10 тыс. лк. Когда высота проростков достигает 2 см, в почву вводят 1% раствор гидразида малеиновой кислоты (50 мл на 1 вазон). Растения выращивают до полного раскрытия листа. Затем часть вазонов с растениями обрабатывают фунгицидом в различных концентрациях (для одной концентрации используется 30-50 растений). Необработанные растения служат контролем. Через 2 суток листья срезают и раскладывают на питательную среду, которая включает 5-10% раствор кинети-на - 1 мл/л, 5-10% растворы аденина, глютатиона, метионина по 10 мл/л каждого, агар-агар - 10 г/л. Агаризованные среды готовят на выщелоченном агаре. Кинетин, аденин, глютатион, метионин вводят в среду после охлаждения ее до 50°С. Готовые среды в стерильных условиях разливают в чашки Петри слоем 0.8-1 см. Листья раскладывают горизонтально, нижней стороной к питательной среде. Концы листьев помещают в агари-зованную среду. В одни чашки помещают листья, обработанные фунгицидом, в другие - необработанные. Повторность опыта - 3-5-кратная. Одна повторность -чашка Петри с 10 листьями.
Поскольку ржавчины являются обли-гатными паразитами, оценку чувствительности к фунгицидам можно проводить на целых растениях. Для этого растения выращивают до фазы настоящих листьев. Далее одну партию обраба-
тывают фунгицидом в различных концентрациях, другая - контрольная, без обработки.
Повторность опыта - 3-5-кратная. Одна повторность - 10 растений.
Помещенные в чашки Петри листья растений или целые растения инокули-руют, опрыскивая инфекционной взвесью из расчета 0.5 мл на 1 растение. После инокуляции чашки Петри или целые растения на 20-24 ч ставят во влажную камеру при 20-22°С, затем переносят в теплицу или в камеру искусственного климата, где поддерживают условия: освещенность 10-12 тыс. лк., относительная влажность 70-80%, температура - для бурой ржавчины 18-20°С, для желтой ржавчины 16-18°С, для стеблевой ржавчины 20-22°С.
В случае, когда отбор проб осуществляют с помощью технических средств, доставленные в лабораторию чашки Петри с листьями опрыскивают водой, после чего их переносят в камеру искусственного климата, крышки на чашках слегка приоткрывают. В камере поддерживают необходимые условия (см. выше).
Оценку пораженности листьев ржавчиной проводят на 5-7 сутки после проявления болезни. Тип реакции устанавливают с помощью модифицированной шкалы: Стекмана и Левина - для стеблевой; Майнса и Джексона - для бурой; Гасснера и Штрайба - для желтой ржавчины (Stakman,Levine,1922; Mains, Jack-son,1926; Gassner,Streib,1932). Для определения интенсивности поражения растений бурой, стеблевой, желтой ржавчинами используют шкалу Петерсона и др. (Peterson et al,1948). Для оценки параметров устойчивости используют графический метод «пробит-анализа» Милле-ра-Тейнтера (Беленький,1963). Фактор резистентности высчитывают путем отношения СК50 и СК95 чувствительной к СК50 и СК95 исследуемой популяции. Чем выше фактор резистентности, тем устойчивее популяция к фунгицидам.
58
Литература
Вестник защиты растений, ,3, 2001
Беленький М.Б. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Рига, 1959, 114 с.
Волкова Г.В. Резистентность возбудителя желтой ржавчины пшеницы к байлетону. Ав-тореф. канд.дисс. Краснодар, 1997, 21 с.
Поляков И.М., Менде В.Н. Адаптация грибов рода Puccinia к фунгицидам. /Химия в сельском хозяйстве, 1, 1965, с.34-37.
Санин С.С. Эпифитотиология ржавчин зерновых культур: моделирование, мониторинг, контроль. Автореф. докт. дисс. М., 1998, 95 с.
Соколов Ю.Г., Евсюков Н.А., Садковский В.Т. Рекомендации по применению средств контроля инфекции и параметров среды при защите растений от болезней. М., 1994, 34 с.
Gassner G., Straib W. /Arb. Biol. Reichsanst. Land и Forstw, 20, 1932, p.141-163.
Mains E.B., Jackson H.C. /Phytopathol., 16, 1, 1926, p.89-120.
Peterson R.E., Campbell A.B., Hannah E.E. /Canad. J.Rev., 26, 1948, p.496-500.
Stakman E.C., Levine M.N. /Minnes. Agric. Exp. Stat. Tech. Bull. S., 1922, p.3-10.
METHOD FOR ESTIMATING THE RESISTANCE OF THE WHEAT RUST PATHOGEN TO FUNGICIDES
G.V.Volkova
A method for estimating the resistance of cereals' rust pathogens to fungicides has been proposed. The method is based on the reaction of rust fungi spores to a series of fungicide concentrations. Ways of collecting spores in field conditions, peculiarities of the establishment of trials and incubation of samples have been described.
Вестник защиты растений, ,3, 2001 УДК 631.4/.8
ВЗАИМОДЕИСТВИЕ КОМПЛЕКСА ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИИ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ И АЗОБЕНЗОЛА
Н.Д.Конева
Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург
Трансформация и деградация синтетических органических соединений, поступающих в почву, происходит, в основном, под воздействием микроорганизмов. Объектом наших исследований служил нерастворимый в воде пестицид азобензол. Установлено, что при внесении азобензола в почву не происходит изменения качественного состава гетеротрофных бактерий, но при этом наблюдается пространственное перераспределение микроорганизмов относительно частиц соединения в почве. Были выделены бактерии Azotobacter sp., Beijerinckia sp., Bacillus polymyxa и Bac.cereus. Показана их способность к трансформации азобензола в условиях ко-метаболизма в жидкой питательной среде.
Развитие сельского хозяйства и промышленности во всем мире отрицательно сказывается на состоянии биосферы. Попадая в окружающую среду, химические соединения способны вызывать нарушения нормальных циклов биологического круговорота веществ, включаться в цепи питания и, вследствие этого, аккумулироваться живыми организмами. Риск аккумуляции живыми системами особенно велик для гидрофобных соединений, которые, как правило, устойчивы к деградации и сохраняются длительный период в окружающей среде. Среди таких веществ одно из ведущих мест занимают азосоединения, включающие обширную группу азокрасителей для текстильной, пищевой, фармацевтической, косметической и лакокрасочной промышленности, а также пестициды и продукты трансформации ряда гербицидов - производных ароматических аминов. Некоторые из них обладают канцерогенными свойствами и представляют определенную опасность для экосистемы и здоровья человека. Вместе с тем, исследования взаимодействия азосоединений и микрофлоры почвы имеют эпизодический характер.
Ранее в модельных опытах нами было показано, что азобензол в концентрации 50 мг/кг не оказывает существенного влияния на численность и качественный состав гетеротрофных бактерий в почве (Конева,1998,1999). На протяжении двух месяцев разнообразие бактериального
комплекса почвы, которое оценивали по изменению индекса видового богатства и индекса Шеннона, увеличивалось. Однако спустя 4 месяца инкубации в варианте с азобензолом индекс Шеннона был ниже, чем в контроле, что говорит об изменении в структуре бактериального комплекса и снижении его разнообразия.
Поскольку азобензол нерастворим в воде, а распределение его в почве имеет дискретный характер, было изучено влияние азобензола на топографию распределения микроорганизмов в почве (Koneva,Kruglov,2000). Пространственное распределение микроорганизмов изучали методом стекол обрастания Н.Г.Холодного в модификации А.В.Рыбалкиной и Е.В.Кононенко. Установлено, что азобензол оказывает существенное влияние на пространственное перераспределение микроорганизмов, которое проявляется в концентрации вокруг частиц азобензола специфической микрофлоры, устойчивой к этому соединению. При этом преимущественное развитие получают различные бактериальные виды микроорганизмов. Постепенно происходит массовое обрастание частиц азобензола бактериальными клетками, постепенное расслоение и исчезновение частиц.
Цель настоящей работы - изучить влияние азобензола на комплекс гетеротрофных бактерий почвы и оценить возможность микробной деградации азобензола.
