CC BY
307
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2
Методика
УДК 636:619:591.111:57.08
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
В.Я. САРУХАНОВ, Н.Н. ИСАМОВ, И.М. КОЛГАНОВ
Предложена методика определения лизоцимной активности сыворотки крови у сельскохозяйственных животных и человека. У крупного рогатого скота, овец и коз смесь нативной сыворотки и тест-культуры необходимо инкубировать в течение 180 мин. Сыворотку крови лошадей и человека следует инактивировать и затем инкубировать с тест-культурой в течение 180 мин. Использование фосфатного буфера в качестве жидкой фазы в суспензии тест-культуры приводит к осаждению ее частиц, вследствие чего возможно искажение результатов исследований. Этого не наблюдается при использовании 0,75 М раствора сахарозы.
Ключевые слова: естественная резистентность, сельскохозяйственные животные, кровь, ли-зоцимная активность.
Keywords: nature resistance, agriculture animals, blood, lysozyme activities.
В антиинфекционной защите организма участвуют как высокоспецифичная иммунная система, так и система факторов естественной резистентности, включающая бактериолизины, которые действуют на грампо-зитивную (лизоцим, р-лизины) и грамнегативную (система комплемента) микрофлору. Защитное действие комплемента, лизоцима, р-лизинов и антител изучено достаточно подробно (1-3). Лизоцим — фермент мурамида-за, гидролизующий мукополисахариды клеточной стенки бактерий. Его количество снижается при интоксикации солями тяжелых металлов (хром, свинец, цинк) (4, 5). Облучение в сублетальных дозах приводит к повышению активности лизоцима крови, в летальных дозах — к снижению этого показателя (6). При остром периоде пневмонии титр лизоцима уменьшается, тогда как выздоровление сопровождается его нормализацией (7).
Методы определения лизоцимной активности крови можно разделить на чашечные и нефелометрические. Первые основаны на диффузии лизоцима сыворотки крови в агаровом геле с культурой Micrococcus lyso-decticus, вторые — на изменении светопропускания микробной взвеси M. lysodecticus под действием лизоцима сыворотки крови. Надо отметить, что на тест-культуру M. lysodecticus, помимо лизоцима сыворотки крови, влияет система комплемента: добавление к тест-культуре даже 0,03 мл сыворотки крови может изменить ее оптические свойства, что приведет к искажению результатов исследования. Следовательно, перед определением лизоцимной активности крови комплемент сыворотки следует инактивировать нагреванием, а реакцию учитывать по выраженной в процентах разнице оптической плотности смеси сыворотки крови с тест-культурой до и после инкубации (оптические измерения в образце осуществляются против соответствующей кюветы со смесью сыворотки крови и жидкой фазы суспензии тест-культуры, что исключает вклад дополнительных факторов в конечный результат) (3). Для исключения ошибки измерения оптическая плотность должна лежать в диапазоне от 0,10 до 1,00. При значении < 0,10 высокая погрешность измерения связана с малой интенсивностью луча, тогда как при > 1,00 — с близкими значениями, получаемыми при его прохождении через пробу и контрольную кювету (8).
Целью настоящей работы была оптимизация параметров методики определения лизоцимной активности сыворотки крови у сельскохозяйст-
венных животных и человека.
Описание методики. Объектом исследования служила сыворотка крови животных-аналогов: коров черно-пестрой породы (п = 20), беспородных лошадей (п = 10), овец романовской породы (п = 10), беспородных коз (п = 10) и клинически здоровых людей (п = 10). Кровь у животных отбирали из яремной вены утром натощак. Сыворотку получали общепринятым методом. В реакции использовали ацетоновый порошок M. lysodecticus. Активность лизоцима определяли как стандартным, так и модифицированным методом (6). Сыворотку крови инактивировали нагреванием в водяной бане при 56 °С в течение 20 мин. Светопропускание и оптическую плотность определяли на фотоэлектроколориметре КФК-ХЛ4,2 (Россия).
В соответствии со стандартной методикой определения лизоцимной активности нефелометрическим методом готовили микробную суспензию тест-культуры в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) со светопропуска-нием взвеси 20 %, что соответствовало оптической плотности 0,70 (зеленый светофильтр, 1 = 540 нм). К 1,47 мл тест-культуры добавляли 0,03 мл сыворотки крови и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С. Ли-зоцимную активность определяли по разнице светопропускания тест-культуры и ее смеси с сывороткой крови после инкубации (7).
В соответствии с модифицированным методом, который применяли для определения активности лизоцима крови у сельскохозяйственных животных и человека, в три пробирки (№№ 1, 2, 3) разливали по 0,2 мл сыворотки или плазмы крови. Перед постановкой реакции сыворотку крови лошадей и человека инактивировали нагреванием на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. Для приготовления суспензии тест-культуры ацетоновый порошок M. lysodecticus растирали в ступке с небольшим количеством 0,75 М раствора сахарозы и фильтровали через неплотный слой ваты. Затем оптическую плотность суспензии доводили раствором сахарозы до 0,70 (зеленый светофильтр; кювета с длиной оптического пути 3 мм). В пробирки №№ 2 и 3 добавляли по 1,2 мл тест-культуры. Пробирки № 1 и № 2 помещали в холодильник, пробирку № 3 — в термостат при температуре 37,5 °С на 180 мин. В пробирку № 1 добавляли 1,2 мл 0,75 М раствора сахарозы и определяли оптическую плотность содержимого пробирок №№ 2 и 3 против смеси сыворотки крови и 0,75 М раствора сахарозы (пробирка № 1).
Активность лизоцима рассчитывали по разнице оптической плотности контрольных и опытных образцов, выраженной в процентах, по формуле:
ЛА = [(ОБк - ОБо)/ОБк] х 100, где ЛА — лизоцимная активность крови, %; ОБк — оптическая плотность контрольных образцов (смесь сыворотки крови и тест-культуры без инкубации); ОБо — оптическая плотность опытных образцов (смесь сыворотки крови и тест-культуры после инкубации).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel.
При использовании стандартной процедуры определения добавление к 1,47 мл тест культуры 0,03 мл сыворотки крови крупного рогатого скота привело к увеличению светопропускания с 20 до 23-28 %. После инкубации в течение 60 мин этот показатель увеличился до 25-30 %. Следовательно, показатели активности лизоцима были близки к нулевым значениям.
В варианте с использованием фосфатного буфера в качестве жидкой фазы суспензии частицы тест-культуры осаждались после инкубации, что могло привести к искажению результатов исследований. Осаждения не
наблюдалось в 0,75 М растворе сахарозы. При увеличении объема сыворотки крови в параллельных пробах до 0,2 мл и соответствующего уменьшения объема тест-культуры до 1,2 мл оптическая плотность их смеси до и после инкубации при 37,5 °С в течение 120 мин составила соответственно 0,51 и 0,33-0,38, а лизоцимная активность крови колебалась от 25,5 до 33,3 % (табл. 1). В сыворотке крови овец, коз и лошадей лизоцимная активность составила соответственно 25,5±1,1; 30,2±1,2 и 46,8±3,4 %.
1. Лизоцимная активность сыворотки крови у коров черно-пестрой породы в параллельных пробах при определении модифицированным методом
Оптическая плотность образцов Лизоцимная активность, %
ОБк 1 ОБо
0,51 0,34 33,3
0,51 0,34 33,3
0,51 0,38 25,5
0,51 0,33 35,3
0,51 0,34 33,3
0,51 0,34 33,3
0,51 0,34 33,3
0,51 0,34 25,5
П р и м е ч а н и е. Для приготовления суспензии тест-культуры используется 0,75 М раствор сахарозы.
ОПк — оптическая плотность контрольных образцов; ОБо — оптическая плотность опытных образцов.
Для повышения чувствительности определения продолжительность инкубации была увеличена со 120 до 180 мин (модифицированный метод). При этом показатели лизоцимной активности крови у крупного рогатого скота, овец, коз и лошадей повысились до 39,5±1,5; 37,8±2,1; 39,6±2,5 и 65,9±3,2 % (табл. 2). Оптическая плотность опытных и контрольных образцов колебалась от 0,20 до 0,50.
2. Лизоцимная активность сыворотки крови (%) у сельскохозяйственных животных в зависимости от продолжительности инкубации при определении модифицированным методом (Х±х)
Вариант Продолжительность инкубации, мин
120 | 180
Крупный рогатый скот 32,2±2,2 39,5±1,5
Овцы 25,5±1,1 37,8±2,1
Козы 30,2±1,2 39,6±2,5
Лошади 46,8±3,4 65,9±3,2
Инактивация комплемента сыворотки крови не привела к значительному изменению показателей лизоцимной активности у жвачных животных (значения понизились только на 11,1-16,2 %). При использовании сыворотки крови лошадей и человека этот показатель снижался почти на 50 %. Однако лизоцимная активность оставалась высокой и составила соответственно 30,7±1,5 и 40,1±3,5 % (табл. 3).
3. Лизоцимная активность (ЛА, %) в нативных и инактивированных образцах сыворотки крови у сельскохозяйственных животных и человека при определении модифицированным методом
Вариант
Сыворотка крови (Х±х)
нативная
инактивированная
Снижение ЛА в инактивированной сыворотке крови, %
Крупный рогатый скот 40,5±2,2
Овцы 37,6±2,6
Козы 39,6±2,1
Лошади 65,9±3,2
Человек 79,3±8,7
35,2±2,1 31,5±1,2 35,2± 1,5 30,7± 1,5 40,1 ±3,5
13.1
16.2 11,1 46,9 49,4
Лизоцимная активность при исследовании параллельных проб сыворотки крови коров достоверно не различалась и составила соответственно 46,6±2,5 и 45,9±1,5 %. Аналогичная закономерность наблюдалась при использовании сыворотки крови овец, коз, лошадей и человека.
Таким образом, использование фосфатного буфера в качестве жидкой фазы суспензии тест-культуры вызывает осаждение ее частиц во время инкубации, что может привести к искажению результатов исследований. Этого не наблюдалось при использовании 0,75 М раствора сахарозы. При определении активности лизоцима в крови у всех видов сельскохозяйственных животных смесь сыворотки и тест-культуры необходимо инкубировать в течение 180 мин. Для исключения действия на тест-культуру системы комплемента сыворотку крови лошадей и человека следует подвергать инактивации. Предложенный метод позволяет эксплуатировать фотоэлектроколориметр в оптимальном режиме — оптическая плотность измеряемых образцов лежит в диапазоне от 0,10 до 1,00.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. К о л я к о в Я.Е. Ветеринарная иммунология. М., 1986.
2. Б а ш м а к о в Г.А. Факторы естественной резистентности и методы их изучения. Военно-медицинский журнал, 1982, 6: 38-40.
3. Б у х а р и н О.В., В а с и л ь е в Н.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине. Томск, 1977.
4. Б у х а р и н О.В., В а с и л ь е в Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск, 1974.
5. Ш к у р а т о в а И.А. Состояние здоровья животных в условиях экологического неблагополучия и способы снижения техногенных воздействий. Мат. межд. науч. конф. ветеринарных терапевтов и диагностиков, посвященной 70-летию Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. Улан-Удэ, 2001: 126-129.
6. К а р т а ш о в П.А., К и р ш и н В.А., И л ь и н В.Г. и др. Лучевая болезнь сельскохозяйственных животных. М., 1978.
7. Д о р о ф е й ч у к В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом. Лабораторное дело, 1968, 1: 28-30.
8. Б у л а т о в М.И., К а л и н к и н И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам исследования. М., 1986.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию
радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии, 31 января 2011 года
249030 Калужская обл., г. Обнинск, Киевское ш., 109 км, e-mail: riarae@riar.obninsk.org
METHOD FOR DETECTION OF BLOOD LYSOZYME ACTIVITY IN AGRICULTURAL ANIMALS
V.Ya. Sarukhamv, N.N. Isamov, I.M. Kolgamv S u m m a r y
The method was presented for detection of lysozyme activity of blood serum in agricultural animals and human. For cattle, sheep and goat the mixture of native serum and test-culture must be incubate during 180 min. The serum of horse and human must be inactivate and after that to incubate with test-culture during 180 min. The use of phosphate buffer as liquid phase in suspension of test-culture causes the precipitation of its units, which can distorts the results of investigations. It is not observed at the use of 0.75 M sucrose.
Новые
К а м к и н А.Г., К и с е л е в а И.С. Физиология и молекулярная биология мембран клеток. М.: изд-во «Академия», 2008, 592 с.
Изложены современные представления об электрофизиологии и молекулярной биологии мембран клеток. Освещены вопросы молекулярной организации биологических мембран, пассивных электрических свойств мембран, путей перемещения ионов через мембраны клеток. Даны общие представления о струк-
книги
туре и функциях ионных каналов. Описан пассивный ионный транспорт, рассматриваются потенциалы клеток и их связь с ионными токами. Приведены молекулярная организация и функции потенциалуправляемых натриевых, кальциевых и калиевых каналов, обсуждаются отдельные аспекты лигандуправляе-мых каналов, подробно рассмотрена работа механосенситивных каналов. Представлена новая классификация каналов.
