CC BY
108
УДК 615.1; 543.257.063
С. Ю. Гармонов, Н. С. Шитова, А. В. Яковлева,
Р. А. Юсупов, В. И. Погорельцев, М. В. Макарова
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОТИПА АЦЕТИЛИРОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА МЕТАВАНАДАТА АММОНИЯ И ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ У БОЛЬНЫХ
ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С
Разработан метод определения фенотипа ацетилирования при использовании в качестве реагента метаванадата аммония и проведена оценка активности N-ацетилтрансферазы гепатоцитов у больных вирусным гепатитом С
Одной из важных проблем фармацевтической химии, которая возникает при обеспечении безопасного и эффективного применения лекарственных средств (ЛС), является подбор индивидуальных терапевтических доз для каждого больного. В связи с этим весьма актуальной является оценка активности ферментативных систем организма человека, отвечающих за процессы биотрансформации лекарственных веществ (ЛВ).
Значительное расширение перечня используемых в клинической практике ЛС, методов фармакотерапии, объема информации о действии ЛВ в последние годы предполагают расширение и усовершенствование уже имеющихся подходов к исследованию процессов биотрансформации, а также разработку новых высокоэффективных технологий био-фармацевтического анализа. Все это позволяет разрабатывать оптимальные режимы фармакотерапии, контролировать процесс лечения, предупреждать возможное побочное действие лекарств, а также осуществлять раннюю досимптоматическую диагностику заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает использование фармакокинетических исследований для выявления особенностей действия ЛВ при различных патологических состояниях [1,2,3]. При этом на первое место во всем мире выходят методы биофармацев-тического анализа, основанные на избирательной, чувствительной, высокопроизводительной и достаточно доступной для клинической практики оценке активности ферментативных систем биотрансформации [4-8]. При этом роль аналитических технологий чрезвычайно важна для определения всевозможных генных нарушений. Из них конкретные генные мутации предпочтительнее определять с помощью цитогенетических и молекулярно-генетических методов, а продукты деятельности гена и генетически детерминированные процессы метаболизма посредством методов фармацевтической и биоаналитической химии.
Анализ активности NAT проводится с помощью прямых и косвенных методов. Прямые методы включают в себя отбор биоптата печени, содержащий фермент и определение его количества in vitro аналитическими и биохимическими методами. При отборе проб таким образом возникает ряд трудностей. Во-первых, процедура биопсии печени представляет собой травматичное для обследуемого мероприятие. Во-вторых, исследование биопсийных проб ткани печени предполагает технические и методические трудности при их пробоподготовке. В-третьих, сам анализ является достаточно дорогостоящим, так как после инкубации образца ткани с субстратом обработка его гомогената также предусматривает обязательное использование методов разделения и концентрирования компо-
нентов (жидкостная и твердофазная экстракция), а дальнейшие аналитические определения осуществляются, в основном хроматографическими методами. Более доступны для прямых методов анализа лимфоциты и моноциты крови, а также кожа и волосяные фолликулы, но, к сожалению, содержание фермента в них чрезвычайно мало.
Косвенная оценка активности NAT предусматривает использование тест-маркеров, вводимых в организм пациента, изучение параметров кинетики выведения которых в биологических жидкостях позволяет оценивать активность ферментных систем детоксикации. Для фармакокинетических исследований генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ в организме человека путем N-ацетилирования нашли применение вещества, содержащие аминные функциональные группы (гидразиды кислот, производные изоникотиновой и п-аминобензойной кислот, сульфаниламиды и др.), в связи с достаточно высокой избирательностью их детектирования в биологических субстратах [1,9-15]. Чаще всего фенотипирование полиморфизма ацетилирования проводится исследованием фармакокинетики тест-препаратов в крови или при выведении с мочой пациента. Многократный забор крови является достаточно травматичным, а также возникает необходимость создания безопасных условий для взятия и хранения крови. При проведении фармакокинетических исследований с использованием мочи пациента исчезает опасность занесения инфекций в организм, риск которого сохраняется при периодическом отборе крови обследуемого, проводимого в течение нескольких часов.
Цель работы состояла в разработке метода определения фенотипа ацетилирования при использовании в качестве аналитического реагента метаванадата аммония для контроля содержания тест-препарата изониазида в моче человека, а также оценке влияния активности N-ацетилтрансферазы у больных вирусным гепатитом С.
Результаты и их обсуждение
При взаимодействии ГИНК с метаванадатом аммония в кислой среде при нагревании образуется комплексное соединение красно-коричневого цвета [16]. В последствии описан способ, допускающий идентификацию свободного ГИНК без использования повышенных температур при проведении реакции дереватизации [16]. При использовании данной реакции для идентификации ГИНК в моче, отмечено, что компоненты раствора, содержащего аналитический реагент, легко образуют буферные смеси с мочевыми солями, благодаря чему аналитический продукт разлагается, и окраска со временем исчезает. Следует отметить, что все эти обстоятельства диктуют необходимость исследования реакции комплексообразования ГИНК с метаванадатом аммония в зависимости от кислотности среды, наличия компонентов реакционной смеси, времени завершения реакции деревати-зации, а также оптимизации спектрально-аналитических характеристик образующегося комплекса и установления его состава.
В зависимости от pH среды ванадаты в водных растворах могут существовать в виде различных ионов. В связи с этим изменение pH существенно влияет на устойчивость образованного комплекса [17]. На рисунке 1 показаны спектры поглощения комплекса ГИНК с метаванадатом аммония при разных pH. Как видно, наиболее полное образование комплекса и максимальная интенсивность светопоглощения наблюдается при низких pH, причем максимум поглощения соответствует аналитической длине волны 420 нм. Были установлены условия образования комплекса путем проведения реакции комплексообразо-вания в различных интервалах рН. Как видно по полученным спектрам поглощения, при смещении условий проведения реакции в более кислую область интенсивность поглощения увеличивается. При создании более щелочных значений рН среды, начиная от рН 6,86
максимум поглощения смещается в коротковолновую область. В связи с этим можно предположить, что состав комплекса в слабокислой, нейтральной и щелочной среде имеет различный состав.
Рис. 1 - Спектр поглощения комплекса гидразида изоникотиновой кислоты с ме-таванадатом аммония при различных рН: 1 - 2,2; 2 - 4,5; 3 - 6,86; 4 - 7,5
Для пятивалентного ванадия характерно образование связей с органическими и неорганическими лигандами, координированными через кислород. В то же время известно небольшое количество комплексов ванадия с лигандами, координирующимися с ванадием посредством азота и кислорода [17]. В качестве лиганда в данном комплексе выступает ГИНК, а в качестве комплексообразователя - соединения ванадия (V). Для определения состава образующегося комплекса был использован метод изомолярных серий (рис. 2). По рассчитанным мольным долям присутствующих ионов в растворе можно заключить, что при pH среды 2,2, создающейся в условиях проведения аналитической реакции, в растворе преимущественно существуют ионы VO2+ (диоксованадий ^)-катион). На рис. 3 - 5 представлены диаграммы распределения мольных долей присутствующих в растворе ионов в зависимости от рН раствора при разных концентрациях. Как видно из представленных данных увеличение pH приводит к уменьшению содержания в растворе диоксованадий (V) катиона ^02+) и увеличению содержания диоксогидроксованадия (V) ^020Н) и поли-ядерных ионов - гексодекаоксогексаванадат (V) аниона ^б0-|б"2). Это является подтверждением того, что при низких pH происходит более полное образование комплекса. При
_з
повышении концентрации ванадата аммония до 5-10" моль/л и создания 30-ти кратного его избытка при рН 2,2 наблюдается появление, наряду с ионами V02+, еще ионов V020H, а доля полиядерного комплекса в интервале концентраций от 5* 10-5 до 5* 10-3 моль/л практически равна нулю.
Рис. 2 - Определение состава комплекса ГИНК с метаванадатом аммония методом изомолярных серий (А=420 нм)
Рис. 3 - Мольные доли соединений У(У) в зависимости от рН раствора при Оу(У) = 5,00-10'4 моль/л. 1 - У02+; 2 - У020И; 3 - УеО^'2
Рис. 4 - Мольные доли соединений У(У) в зависимости от рН раствора при Оу(У) = 5,00-10'3 моль/л: 1 - У02+; 2 - У020И; 3 - Уе01в'2
Рис. 5 - Мольные доли соединений У(У) в зависимости от рН раствора при Оу(У) = 5,00*10'5 моль/л: 1 - У02+; 2 - У020И; 3 - Уб01б"2
На основании представленных результатов можно предположить, что метаванадат аммония с ГИНК образует хелатный комплекс. Величина ступенчатой константы устойчивости рассчитана по формуле:
к = [У02Ь+ ]
+ [У0+][1_]’ +
где У02Ь+ - общая концентрация образовавшегося комплекса; У02+ - общая концентрация ванадия, не связанного в комплекс; 1_ - общая концентрация лиганда, не связанного в комплекс (ГИНК).
При рН = 2,2 эта величина составляет ^ К=2,95±0,06 и ей соответствует молярный коэффициент поглощения ^ 8 = 2,95±0.06, что свидетельствует о средней устойчивости комплексного соединения.
Устойчивость образующегося комплекса во времени приведена на рисунке 6. Как видно из представленной зависимости оптической плотности от времени, светопоглоще-ние аналитической смеси падает. В течение полутора часов величина оптической плотности уменьшается в шесть раз. Это необходимо учитывать при проведении реакции ком-плексообразования в моче с целью оптимизации условий аналитических определений. Спектрально-аналитические характеристики продукта реакции необходимо детектировать непосредственно после проведения взаимодействия ГИНК и метаванадата аммония. Было установлено, что реакция комплексообразования ГИНК с ванадием (V) может быть использована для определения активности ЫАТ по количеству выведенного изониазида с мочой пациента. Для спектрофотометрического ГИНК необходимо было подобрать оптимальные условия детектирования образующегося комплекса. Для этого проведено основных аналитических характеристик образующегося комплекса.
А
I, мин
Рис. 6 - Устойчивость комплекса ЫН^Оз с ГИНК во времени при проведении реакции в моче (Х=420 нм, рН=2,2)
Вследствие того, что метаванадат аммония и моча являются окрашенными растворами, этот факт может оказать влияние на определение комплекса и внести вклад в вели-
чину его молярного коэффициента поглощения согласно закону аддитивности оптических плотностей. Для оценки этого влияния были изучены спектры поглощения растворов ме-таванадата аммония, смеси метаванадата аммония с мочой и непосредственно образца мочи. Было установлено, что в условиях опыта при X 420 нм, влияние реагента и мочи весьма незначительно, следовательно, его можно полностью исключить, включив эти компоненты в состав раствора сравнения при спектрофотометрическом детектировании.
Возможность определения в ГИНК моче была оценена методом «введено - найдено» (табл. 1). Полученные данные показывают, что при выбранных условиях детектирования комплекса изониазида с метаванадатом аммония компоненты мочи не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрические определения ЛВ.
Таблица 1 - Результаты спектрофотометрического определения изониазида в моче (П=4; Р=0,95)
Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл эг
1,37 1,36±0,02 0,01
2,74 2,75±0,20 0,07
5,48 5,41±0,27 0,05
8,22 8,02±0,25 0,03
10,96 10,83±0,26 0,02
При спектрофотометрическом детектировании также получаются линейные градуировочные зависимости оптической плотности от концентрации для области концентраций 210-6 - 2-10"5 М:
А = 0,0533Сх (мкг/мл)+0,0007 (Я2 = 0.9999).
Предел обнаружения ГИНК при указанных условиях спектрофотометрического определения снижается до 0,28 мкг/мл, что значительно ниже интервала фармакокинетических концентраций этого ЛВ.
Фенотипировать обследуемых можно, пользуясь данными фармакокинетики тест-препарата ГИНК в моче: для быстрых ацетиляторов характерны более низкие значения площади под фармакокинетической кривой, времени полувыведения ЛВ и более высокие значения константы элиминации, объема распределения, чем для медленных ацетиляторов. Оказалось, что наиболее удобным параметром для фенотипирования является количество выводимого изониазида в процентах от вводимой дозы, которое принято называть фракцией дозы. Быстрому фенотипу ацетилирования соответствует меньший процент выведения тест-препарата - изониазида и, наоборот, медленному фенотипу - более высокий процент выведения данного маркера. Кумулятивное количество экскретируемого с мочой ГИНК (фракция дозы), характерное для быстрых и медленных ацетиляторов, с учетом вероятности распределения представлено в таблице 2. По полученным данным можно сделать вывод, что нулевая гипотеза опровергается на 0,1%-ном уровне, что соответствует очень высокой точности распределения результатов по фенотипическим группам.
Данные фармакокинетики изониазида в группе 26 больных хроническим вирусным гепатитом С обрабатывали по программе АСКИД с использованием одночастевой модели со всасыванием 1 порядка и одночастевой модели с внемодельным всасыванием по про-
Таблица 2 - Критерии для определения индивидуальной активности Ы-
ацетилтрансферазы
Тип ацетилирования Активность Ы-ацетилтрансферазы (фракция дозы гИнК, %) Вероятность распределения
Быстрый 3,12±0,25 Р<0,001
Медленный 9,40±1,37
грамме М-ШЭ. Установлено соотношение фенотипов ацетилирования у больных хроническим вирусным гепатитом С до- и после противовирусной терапии. Выявлено, что медленный тип ацетилирования является преобладающим у больных хроническим вирусным гепатитом С до проведения противовирусной терапии (86 %) в отличие от аналогичного показателя у здоровых лиц (54 %). По данным литературы [18] у больных острым вирусным гепатитом В хронизация процесса наблюдалась именно у пациентов с медленным фенотипом ацетилирования. Полученные нами данные подтверждают, что у медленных ацетиляторов наблюдается больший риск формирования хронического процесса вирусного гепатита С. Необходимо также отметить, что среди больных с тяжелой формой заболевания преобладали медленные ацетиляторы. В процессе же противовирусной терапии (рибавирин в дозе 1000 мг/сут и интерферон альфа по 3 млн МЕ три раза в неделю, наблюдение в течение 3-х месяцев после начала лечения) происходит недостоверное увеличение активности Ы-ацетилтрансферазы у медленных ацетиляторов. Таким образом, определение фенотипа аце-тилирования может быть использовано для прогнозирования тяжести течения вирусного гепатита С и определения тактики диспансерного наблюдения.
Экспериментальная часть
Фенотип ацетилирования оценивали по параметрам экскреции изониазида (гидразид изо-никотиновой кислоты, ГИНК) с мочой. Реактивом для определения изониазида в моче служил коммерческий метаванадат аммония. Изониазид вводился перорально в дозе 0,45 г. Спектрофотометрические измерения проведены на спектрофотометре СФ-26. Фенотип ацетилирования определялся в группе больных хроническим вирусным гепатитом С.
Методика определения фенотипа ацетилирования. Изониазид однократно перорально вводится пациенту в дозе 0,45 г, эквивалентной разовой дозе приема препарата. Мочу собирают каждые два часа в течение 6 часов после приема тест-маркера. В почасовых пробах мочи определяют содержание ГИНК спектрофотометрическим методом. По полученным данным строят кинетические кривые, определяют фракцию дозы ГИНК и оценивают фенотип ацетилирования пациента. Для определения концентрации ГИНК отбирают 0,3 мл мочи, добавляют 7,7 мл дистиллированной воды и 2 мл 2,2 %-ного раствора метаванадата аммония в 10%-ной серной кислоте. Количество выведенного ГИНК определяют по градуировочному графику.
Выводы
Предложен неинвазивный метод определения фенотипа ацетилирования при использовании в качестве аналитического реагента метаванадата аммония для контроля содержания тест-препарата изониазида в моче человека.
Изучена реакции комплексообразования изониазида с метаванадатом аммония в зависимости от кислотности среды, наличия компонентов реакционной смеси, времени за-
вершения реакции дереватизации, а также проведена оптимизация спектральноаналитических характеристик образующегося комплекса и установлен его состав.
Разработанные подходы по фенотипированию можно использовать для оптимизации комбинированной противовирусной терапии гепатита С.
Литература
1. Холодов Л.Е., Яковлев В.П. Клиническая фармакокинетика. М.: Медицина, 1885. 464 с.
2. Куценко С.А. Основы токсикологии. Санкт-Петербург: Фолиант, 2004. 720 с.
3. Середенин С.Б., Дурнев А.Д. Фармакологическая защита генома. М: ВИНИТИ, 1992. 386 с.
4. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Гисмятов Р.Г., Шитова Н.С., Зыкова И.Е. // Вопросы биол., мед. и фармацевт. химии. 2003. №3. С. 34 - 39.
5. ЕвгеньевМ.И., Гармонов С.Ю., Шитова Н.С., Погорельцев В.И. // Вестник Казанского технологического университета. 2004. № 1-2. С. 74 - 81.
6. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: Учеб. для фармац. институтов и фармац. факультетов мед. институтов. М.: Высшая школа, 1985. 768 с.
7. axemen C.B.V. // Talanta. 2002. V. 56. P. 289 - 299.
8. ЕвгеньевМ.И., Евгеньева И.И. // Вестник ТО РЭА. 2002. № 3 - 4. С. 91 - 99.
9. Сергеев В.И., Галенко-Ярошевский П.А., Шимановский Н.Л. Очерки биохимической фармакологии. М: РЦ Фармедонф, 1996. 384 с.
10. Nyeki A., Biollaz J., Kesselring U.W., Decosterd L.A. // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 2001. V. 755. № 1 - 2. Р. 73 - 84.
11. Hein D.W., Doll M.A., Fretland A.J., Leff M.A., Webb S.J., Xiao G.H., Devanaboyina U.-S., Nangju N.A., Feng Y. // Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 2000. V. 9. № 1. Р. 29-42.
12. Sugamori K.S., Wong S., Gaedigk A., Yu V., Abramovici H, Rozmahel R., Grant D.M. // Mol. Pharmacol. 2003. V. 64. Р. 170 - 179.
13. Hearse D.J., Weber W.W. // Biochem J. 1973. V. 132. P. 519 - 526.
14. Niewinski P., Orzechowska-Juzwenko K. // Pol. Merkuriusz. Lek. 1997. V. 2. № 9. P. 231 - 235.
15. Furet Y., Bechtel Y., Le Guellec C., Bechtel P.R., Autret-Leca E., Paintaud G. // Therapie. 2002. V. 57. № 5. P. 427 - 431.
16. Джорджеску П., Пэунеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. Бухарест: Медицинское издательство, 1963. 500 c.
17. Хирц Ж. Аналитические методы исследования метаболизма лекарственных веществ. М.: Медицина, 1975. 270 с.
18. Усманова Л. П., Касимова Н. Б., Кузнецова Т. А. // Терапевт. арх. 1996. Т.68, №11. С. 19-20.
© С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. инженерной экологии КГТУ; Н. С. Шитова - канд. хим. наук, ст. преп. ОПП ЦМД КГТУ; А. В. Яковлева - асп. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; В. И. Погорельцев - канд. мед. наук, доцент, главный врач поликлиники КНЦ РАН; Р. А. Юсупов - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; М. В. Макарова - канд. мед. наук, зам. глав. врача Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Минздрава РТ.
