МЕТОД НЕИНВАЗИВНОЙ ОЦЕНКИ РАЗВИТИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА У ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 4 - P. 69-72

УДК: 616.72+616-092.9 DOI: 10.24412/1609-2163-2022-4-69-72 EDN WIAWMK |||||

МЕТОД НЕИНВАЗИВНОЙ ОЦЕНКИ РАЗВИТИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА У ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ С.В. СКУПНЕВСКИЙ, Е.Г. ПУХАЕВА, А.К. БАДТИЕВ, Ф.К. РУРУА, Ф.Э. БАТАГОВА, Ж.Г. ФАРНИЕВА

Институт биомедицинских исследований - филиал ФГБУН Федерального научного центра «Владикавказский научный центр Российской академии наук», ул. Пушкинская, д. 47, г. Владикавказ, 362025, Россия

Аннотация. Введение. Высокая заболеваемость (до 1% населения Земли) и полиэтиологический патогенез ревматоидного артрита обусловливает необходимость экспериментального поиска причин и доступных методов терапии и профилактики патологии соединительной ткани, поэтому разработка эффективных неинвазивных способов оценки течения заболевания является актуальной. Цель исследования: обосновать эффективность использования модели «открытое поле» в качестве оценочного критерия развития адъювант-индуцированного ревматоидного артрита у крыс. Материалы и методы исследования. У крыс опытной группы формировали модель ревматоидного артрита однократным введением полного адъюванта Фрейнда, подкожно в правую заднюю конечность в объеме 0,1 мл на 200 г массы тела. Крысам контрольной группы вводили растворители по той же схеме. Животных тестировали в модели «открытое поле» на 3-й и 7-й неделях. По окончании эксперимента (7 недель) животных усыпляли и подвергали рентгенографии. Нормальность распределения проверяли в Excel по критерию Шапиро-Уилка. Сравнение гипотез осуществляли по парному ¡-критерию Стьюдента. Значимыми считали различия при р<0,05. Результаты и их обсуждение. Нарастание дегенеративно-дистрофического суставного синдрома обусловливало скованность движений в пораженных суставах, что к третьей неделе эксперимента (соответствует 2-3-ей стадиям ревматоидного артрита у людей) выразилось в статистически значимом снижении количества пересекаемых секторов животными опытной группы на 43% (относительно контрольной), количества стоек с опорой на стенку на 70%, без опоры на 49%. Изменения в эмоциональной реактивности сравниваемых групп животных к третьей неделе достоверно не различались, становясь более оформленными к седьмой 7-й неделе (3-я неделя - тенденция к снижению уровня тревожности: груминг - на 18%, число болюсов дефекации на 22%, актов дефекации - на 28%; 7-я неделя - увеличение актов груминга на 46,9 %, количества болюсов на 30 %, уменьшение актов дефекации на 22,5%). Результаты рентгенографии зафиксировали соответствие наблюдаемых показателей физиологических исследований развитию структурно-дегенеративных изменений в суставном аппарате опытных животных. Заключение. Процесс формирования адъювант-индуцированного ревматоидного артрита в развернутой стадии у животных сопровождается планомерным снижением двигательной активности - в 2,3 раза горизонтальной и в 3,0 раз вертикальной, нарушением эмоционального статуса (увеличение актов груминга в 1,8 раза), ввиду чего использование классической в нейробиологии неинвазивной модели «открытого поля» в практике оценки ревматоидного артрита является информативным и способствует изучению механизмов заболевания и поиску средств его терапии и профилактики.

Ключевые слова: аутоиммунные патологии, лабораторный эксперимент, модель «открытое поле», ревматоидный артрит, способ диагностики артрита.

METHOD FOR NON-INVASIVE ASSESSMENT OF THE DEVELOPMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS

IN LABORATORY RODENTS

S.V. SKUPNEVSKIY, E.G. PUKhAEVA, A.K. BADTIEV, F.K. RURUA, F.E. BATAGOVA, Zh.G. FARNIEVA

Institute for Biomedical Research - branch of the Federal State Budget Scientific Institution of the Federal Scientific Center "Vladikavkaz Scientific Center of the Russian Academy of Sciences", st. Pushkinskaya, 47, Vladikavkaz, 362025, Russia

Abstract. Introduction. The high incidence (up to 1% of the world's population) and the polyetiological pathogenesis of rheumatoid arthritis determine importance of development of effective methods for assessing the course of the disease. The aim: to substantiate the effectiveness of using the "open field" model as an evaluation criterion for the development of adjuvant-induced rheumatoid arthritis in rats. Materials and methods. In rats of the experimental group, a model of rheumatoid arthritis was formed by a single injection of complete Freund's adjuvant, subcutaneously into the right hind limb in a volume of 0.1 ml per 200 g of body weight. Rats of the control group were injected with solvents according to the same scheme. Animals were tested in the open field model at 3 and 7 weeks. At the end of the experiment (7 weeks), the animals were euthanized and X-ray performed. The normality of the distribution was checked in Excel using the Shapiro-Wilk test. Hypotheses were compared using paired Student's t-test. Differences were considered significant at P<0.05. Results and discussion. The increase in degenerative-dystrophic articular syndrome caused stiffness of movements in the affected joints, which by the third week of the experiment (corresponding to stages 2-3 of rheumatoid arthritis in humans) resulted in a statistically significant decrease in the number of crossed sectors by the animals of the experimental group by 43% (relative to the control group), the rear frequency with support on the wall by 70%, without support by 49%. Changes in the emotional reactivity of the compared animals by the 3rd week did not differ significantly, becoming more expressed by 7th week (3rd week - a tendency to reduce the level of anxiety: grooming - by 18%, the number of defecation boluses by 22%, defecation acts - by 28%; 7th week - an increase in acts of grooming by 46.9%, the number of boluses by 30%, a decrease in acts of defecation by 22.5%). The results of radiography find out the compliance of the observed indicators of physiological studies with the development of structural-degenerative changes in the articular apparatus of experimental animals. Conclusions. The formation of adjuvant-induced rheumatoid arthritis in the advanced stage in animals is accompanied by a systematic decrease in motor activity - 2.3 times horizontal and 3.0 times vertical, a violation of the emotional status

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 4 - P. 69-72

(an increase in acts of grooming by 1.8 times), which allows to use the classical non-invasive model "open field" in the practice of assessing RA for study of the mechanisms search for methods for therapy and prevention of disease.

Key words: arthritis diagnostic method, autoimmune pathologies, laboratory experiment, open field model, rheumatoid arthritis..

Введение. Относительно высокая распространенность ревматоидного артрита - РА (460 случаев на 100 000 населения [4]), неясная этиология заболевания, характеризующегося развитием хронического эрозивного артрита, системными нарушениями внутренних органов, и, как следствие, ранней инва-лидизацией и сокращением продолжительности жизни пациентов [1], определяют актуальность всестороннего изучения данной патологии. Для углубления знаний о патогенезе и при поиске новых средств лечения и профилактики РА широко используется лабораторный эксперимент [3,7]. При этом классической моделью является адъювант-индуцированный РА, формируемый за счет введения животным водно-масляной суспензии термически инактивированных микобактерий туберкулеза (ПАФ) [6]. Noh ASM и соавт. отмечают, что уже к 20 дню с момента введения ПАФ у животных развиваются признаки полиартрита, а для изучения картины заболевания применялись методы клинико-лабораторной диагностики и часть животных выводилась для проведения гистологических исследований суставов. Поэтому развитие чувствительных неинвазивных диагностических методов, позволяющих в ходе эксперимента отслеживать развитие патологии у животных в практике лабораторных исследований, востребовано.

Цель исследования - научно обосновать эффективность модели «открытое поле» для оценки развития адъювант-индуциро-ванного ревматоидного артрита у крыс.

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на самцах крыс линии Wistar с исходной массой 370-400 г, разделенных на контрольную и опытную группы (по 7 особей в каждой). Крысам контрольной группы вводили растворители по той же схеме и в тех же объемах, что и в опытной группе. Крысам опытной группы вводили ПАФ, п/к в правую заднюю конечность в объеме 0,1 мл на 200 г массы тела. На 3-й и 7-й неделях животных тестировали в стандартной модели «открытое поле» (ООО «НПК Открытая наука») в течение 3 мин с видеорегистрацией двигательных актов. По окончании эксперимента (7 недель) животных усыпляли в СО^-затравочном боксе и подвергали рентгенографии на стационарном ветеринарном аппарате (Ecoray Ultra 300V). Статистическую обработку проводили в программе Excel, рассчитывая сумму показателей (2), среднее значение и стандартную ошибку среднего (M±m). Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро-Уилка, рассчитывая W и р (уровень значимости принимали а=0,05). Сравнение гипотез осуществляли по парному t-критерию Стью-дента. Значимыми считали различия при Р <0,05. При

работе с грызунами придерживались правил и этических норм, описанных в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 года) и с разрешения этического комитета при Институте биомедицинских исследований ВНЦ РАН.

Результаты и их обсуждение. Результатом введения животным ПАФ явилось развитие модельного РА, что сказалось на характере и объеме двигательных актов (табл.).

Таблица

Результаты изучения двигательной активности и эмоционального статуса крыс с модельным РА

Регистрируемый параметр Стат. показатель Контроль | Опыт Контроль | Опыт

3 нед. 7 нед.

Горизонтальная двигательная активность Z (W(7); p) 113 (0,916; 0,500) 65 (0,888; 0,295) 122 (0,913; 0,469) 52 (0,814; 0,067)

M±m 16,14±3,56 9,29±2,02 17,43±2,80 7,43±2,03

P 0,011 0,009

Вертикальная двигательная активность (с опорой) Z (W(7); p) 39 (0,846; 0,127) 12 (0,664; 0,004) 46 (0,787; 0,040) 17 (0,737; 0,015)

M±m 5,57±2,05 1,71±1,08 6,14±1,42 2,43±1,36

P 0,025 0,000

Вертикальная двигательная активность (б./опоры) Z (W(7); p) 26 (0,762 ; 0,025) 14 (0,885; 0,277) 30 (0,963; 0,942) 8 (0,816; 0,070)

M±m 3,71±1,84 2,00±0,76 4,29±1,19 1,14±0,55

P 0,398 0,038

Груминг Z (W(7); p) 22 (0,840; 0,114) 18 (0,775; 0,031) 17 (0,844; 0,122) 25 (0,873; 0,219)

M±m 3,14±0,96 2,57±0,65 2,43±0,57 3,57±1,43

P 0,356 0,291

Число актов дефекации Z (W(7); p) 14 (0,855; 0,153) 10 (0,887; 0,288) 9 (0,869; 0,204) 7 (0,855; 0,153)

M±m 2,00±0,87 1,43±0,43 1,29±0,36 1,00±0,44

P 0,596 0,522

Число болюсов Z (W(7); p) 18 (0,847; 0,129) 14 (0,927; 0,602) 10 (0,782; 0,036) 13 (0,842; 0,117)

M±m 2,57±1,11 2,00±0,69 1,43±0,65 1,86±0,83

P 0,689 0,407

Развитие индуцированного РА у животных сопровождалось неуклонным снижением количественных показателей, характеризующих горизонтальную и вертикальную активность на фоне стабильно сохраняющихся эмоционально-стрессовых реакций. Животные контрольной группы характеризовались незначительным относительным приростом количественных показателей, выявляющих поведение здорового организма на фоне снижения общего уровня тревожности в повторяющихся условиях экспериментальной установки. Так, по мере прогрессирова-ния адъювантного артрита у крыс опытной группы значительным образом снизились показатели горизонтальной двигательной активности. К окончанию третьей недели с момента интоксикации ПАФ, количество пересеченных секторов животными опытной

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ - 2022 - Т. 29, № 4 - С. 69-72 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 4 - P. 69-72

группы статистически значимо снизилось на 43%, количество стоек с упором на стенку уменьшилось на 70%, без упора на 49% (относительно контроля). Все это свидетельствует о развитии дегенеративно-дистрофического суставного синдрома, приводящего к скованности в движениях пораженных суставов, что также может сопровождаться болевыми ощущениями при перемещении крыс по арене «открытого поля». При этом изменения в эмоциональной реактивности сравниваемых групп достоверно не различаются; у животных опытной группы отмечается лишь тенденция к снижению относительного уровня тревожности (груминг на 18%, число болюсов дефекации на 22%, а самих актов дефекации - на 28%). Отмеченные наблюдения могут отражать сосредоточенность животных на болевом синдроме, который, как известно, характерен и для пациентов начиная со второй стадии заболевания. Согласно результатам физикального обследования, а также расчетам, проводимым в пересчете на временную шкалу животных начиная от момента индуцированной патологии, у грызунов к моменту первого тестирования сформированы нарушения, соответствующие 2-3-ей стадиям РА, в результате чего у крыс ограничена двигательная и исследовательская активность, что опосредует ослабление мотивации инстинктивной программы по исследованию нового пространства, потенцирующей минимизацию возможных угроз со стороны такового.

К окончанию эксперимента заболевание перешло в развернутую стадию, что еще более усилило различия между сравниваемыми группами. У крыс с модельным аутоиммунным РА наблюдалась статистически значимая 58% редукция горизонтальной двигательной активности, и на 60 и 73% с опорой и без опоры на арену (соответственно) - вертикальной. Важно подчеркнуть, что стойки без опоры, сопровождаемые более выраженными болевыми ощущениями на фоне остеоартроза, сократились в большей степени. При этом оценка эмоционального статуса крыс контрольной группы в динамике позволила выявить, что повторное помещение животных в условия открытой арены является для них менее стрессогенным (снижение частотности груминга, актов и болюсов дефекации). В опыте тенденция носила прямо противоположный характер: общее количество актов гру-минга возросло на 39% (сравнение опыт 3 и 7 недель) при незначительном колебании актов дефекации. Нарастание эмоционального напряжения опытных крыс на фоне контрольной группы (7 неделя) сопровождалось увеличением актов груминга на 46,9%, количества болюсов на 30%, при уменьшении самих актов дефекации на 22,5%. Изменение эмоционального поведения может быть связано с негативным воздействием процессов аутоиммунитета на центральную нервную систему, способствуя демиелинизации нервных волокон [5], и, как следствие нарушению проводимости сигналов.

Результаты рентгенографии, выполненной по завершении эксперимента, подтверждают выводы

физиологических исследований и свидетельствуют о развитии глубоких структурно-дегенеративных изменений в суставном аппарате опытных животных (рис.).

а б

Рис. Результаты радиографических исследований лабораторных животных (а - контроль; б - опыт)

У животных контрольной группы патологических изменений в костно-мышечной структуре не выявлено. Для животных опытной группы оказалось характерным неравномерное сужение суставных щелей, перестройка костной структуры в межвертельной области, где обнаруживаются участки кистовид-ных просветлений и остеосклероза. Суставные поверхности в коленных суставах уплощены. В ряде случаев контуры для вертлужной впадины не определяются. Выявлен единичный случай резорбции головки и шейки бедренной кости у крысы (рис. 1, б -справа) [2].

Заключение. Развитие модельного адъювант-индуцированного ревматоидного артрита в развернутой стадии у животных сопровождается планомерным снижением двигательной активности - в 2,3 раза горизонтальной и в 3,0 раз вертикальной, а также нарушением эмоционального статуса. Использование классической в нейробиологии модели «открытого поля» может быть с успехом применено в практике моделирования РА в целях изучения механизмов заболевания и поиска средств его лечения и профилактики.

Литература / References

1. Насонов Е.Л., Лила А.М. Ревматоидный артрит: достижения и нерешенные проблемы // Терапевтический архив. 2019. Т. 91, вып. 5. С. 4-7. DOI: 10.26442/00403660.2019.05.000259 / Nasonov EL, Lila AM. Revmatoidnyi artrit: dostizheniya i nereshennye problem. [Rheumatoid arthritis: achievements and unsolved problems]. Tera-pevticheskii arkhiv. 2019;91(5):4-7. Russian

2. Скупневский С.В., Бадтиев А.К., Пухаева Е.Г., Руруа Ф.К., Батагова Ф.Э., Фарниева Ж.Г. Способ неинвазийного тестирования развития модельной патологии опор™ - двигательного аппарата у лабораторных животных: пат. 2771256 Рос. Федерация N 2021119269; патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное уче-реждение науки Федеральный научный центр ВНЦ РАН; заявл. 30.06.2021; опубл. 29.04.2022, Бюл. № 13. 10 с. (RU) / Skupnevskii SV, Badtiev AK, Pukhaeva EG, Rurua FK, Batagova FE, Farnieva ZhG.; inventors. Sposob neinvaziinogo testirovaniya razvitiya model'noi patologii oporno - dvigatel'nogo apparata u laboratornykh zhivotnykh [A method for non-invasive testing of the development of a model pathology of the

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 4 - P. 69-72

musculoskeletal system in laboratory animals]. Russian Federation patent RU 2771256. Russian.

3. Abdel El-Gaphar O.A.M., Abo-Youssef A.M., Abo-Saif A.A. Effect of Losartan in Complete Freund's Adjuvant -Induced Arthritis in Rats // Iran J Pharm Res. 2018. Vol. 17, N4. P. 1420-1430 / Abdel El-Gaphar OAM, Abo-Youssef AM, Abo-Saif AA. Effect of Losartan in Complete Freund's Adjuvant -Induced Arthritis in Rats. Iran J Pharm Res. 2018;17(4):1420-30.

4. Almutairi K., Nossent J., Preen D., Keen H., Inderjeeth C. The global prevalence of rheumatoid arthritis: a meta-analysis based on a systematic review // Rheumatol Int. 2021. Vol. 41, N5. P. 863-877. DOI: 10.1007/s00296-020-04731-0 / Almutairi K, Nossent J, Preen D, Keen H, Inderjeeth C. The global prevalence of rheumatoid arthritis: a meta-analysis based on a systematic review. Rheumatol Int. 2021;41(5):863-77. DOI: 10.1007/s00296-020-04731-0.

5. Lopez J.A., Denkova M., Ramanathan S., Dale R.C., Brilot F. Pathogenesis of autoimmune demyelination: from multiple sclerosis to neuromyelitis optica spectrum disorders and myelin oligodendrocyte gly-coprotein antibody-associated disease // Clin Transl Immunology. 2021. Vol. 10, N7. P. 1316. DOI: 10.1002/cti2.1316 / Lopez JA, Denkova M, Ra-manathan S, Dale RC, Brilot F. Pathogenesis of autoimmune demye-

lination: from multiple sclerosis to neuromyelitis optica spectrum disorders and myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody-associated disease. Clin Transl Immunology. 2021;10(7):1316. DOI: 10.1002/cti2.1316.

6. Noh A.S.M., Chuan T.D., Khir N.A.M., Zin A.A.M., Ghazali A.K., Long I., Ab Aziz C.B., Ismail C.A.N. Effects of different doses of complete Freund's adjuvant on nociceptive behaviour and inflammatory parameters in polyarthritic rat model mimicking rheumatoid arthritis // PLoS One. 2021. Vol. 16, N12. P. 0260423. DOI: 10.1371/journal.pone.0260423 / Noh ASM, Chuan TD, Khir NAM, Zin AAM, Ghazali AK, Long I, Ab Aziz CB, Ismail CAN. Effects of different doses of complete Freund's adjuvant on nociceptive behaviour and inflammatory parameters in polyarthritic rat model mimicking rheumatoid arthritis. PLoS One. 2021;16(12):0260423. DOI: 10.1371/journal.pone.0260423.

7. Sun S., Du Y., Li S., Gao B., Xia R., Cao W., Zhang C., Zhu E. Anti-inflammatory activity of different isolated sites of Chloranthus serratus in complete Freund's adjuvant-induced arthritic rats // Exp Ther Med. 2021. Vol. 22, N2. P. 848. DOI: 10.3892/etm.2021.10280 / Sun S, Du Y, Li S, Gao B, Xia R, Cao W, Zhang C, Zhu E. Anti-inflammatory activity of different isolated sites of Chloranthus serratus in complete Freund's adjuvant-induced arthritic rats. Exp Ther Med. 2021;22(2):848. DOI: 10.3892/etm.2021.10280.

Библиографическая ссылка:

Скупневский С.В., Пухаева Е.Г., Бадтиев А.К., Руруа Ф.К., Батагова Ф.Э., Фарниева Ж.Г. Метод неинвазивной оценки развития ревматоидного артрита у лабораторных грызунов // Вестник новых медицинских технологий. 2022. №4. С. 69-72. БОТ: 10.24412/1609-2163-2022-4-69-72. ББМ 'ШАШМК.

Bibliographic reference:

Skupnevskiy SV, Pukhaeva EG, Badtiev AK, Rurua FK, Batagova FE, Farnieva ZhG. Metod neinvazivnoy otsenki razvitiya revmatoidnogo artrita u laboratornykh gryzunov [Method for non-invasive assessment of the development of rheumatoid arthritis in laboratory rodents]. Journal of New Medical Technologies. 2022;4:69-72. DOI: 10.24412/1609-2163-2022-4-69-72. EDN WIAWMK. Russian.