Метод молекулярно-генетической идентификации стерилизованных цитрусовых соков Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

ТЕМА НОМЕРА

УдК 664.857.3; 577.212.2

Метод молекулярно-генетической идентификации стерилизованных цитрусовых соков

Е. Ю. Колпаков,

аспирант; А. В. Самойлов,

канд. биол. наук

ВНИИ технологии консервирования

Апельсиновый сок — один из самых популярных и наиболее потребляемых соков в мире. При производстве апельсинового сока используются четыре группы цитрусовых: Citrus sinesis — сладкий апельсин, Citrus reticulata — мандарин, Citrus aurantium — кислый апельсин, а также гибриды сладкого апельсина и мандарина. «Codex Alimentarius» [1] регламентирует состав цитрусовых соков и указывает на допустимость добавления в сок сладкого апельсина соков других групп до 10% от объема. Однако европейские страны не принимают данный стандарт и не допускают присутствия в соке сладкого апельсина соков других групп цитрусовых [2]. В связи с этим необходимо проводить качественный контроль на присутствие соков других цитрусовых, а при необходимости и количественный.

Высокотемпературная обработка — неотъемлемый этап технологии консервированных фруктовых соков и соковой продукции. Исследования прошедших термическую обработку соков как объектов, где в качестве анализируемого компонента выступает органическая молекула, имеют ограничения, связанные с термоустойчивостью [3]. Распад белковых молекул возникает при превышении температуры 45 °C, что не позволяет применять методы, основанные на им-муноферментном анализе (ИФА) для определения видового происхождения соков [4]. В свою очередь, молекулы ДНК способны сохранять фосфатные связи полинуклеотидной цепи при температуре свыше 95 °C. В процессе стерилизации, при консервировании соков, максимальные значения темпе-

ратур близки к предельным значениям термоустойчивости ДНК и могут вызывать ее частичный распад [5], при этом к цитрусовым сокам применяются наиболее жесткие условия термообработки [6]. Нарушение целостности цепи ДНК приводит к ложноотрицательным результатам ПЦР, что делает невозможной идентификацию исследуемого объекта.

Целью исследования было решение задачи видовой идентификации промышленных образцов фруктовых соков при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), для чего было необходимо: определить устойчивость нуклеиновых кислот к условиям термической обработки; доказать возможность применения ПЦР для идентификации соков, прошедших термообработку; определить возможность выявления фальсификации с применением видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров, связанной со смешиванием соков апельсина и мандарина в промышленных образцах.

Объектом исследования были соки зрелых плодов апельсина и мандарина, полученные путем прямого отжима и подвергнутые термической обработке.

Для изучения термоустойчивости матричной ДНК были подобраны режимы термообработки соков (табл. 1). Образцы 100%-ных соков апельсина и мандарина получили обозначения, соответственно: «А» и «М» и индекс, соответствующий номеру программы стерилизации.

После получения результатов, для определения видового состава, соки были смешаны в различных пропорциях (табл. 2) и подвергнуты термообработке при 118 °С в течение 10 мин при давлении 1,3 кПа.

32 ПИВО и НАПИТКИ

5^ 2015

I

ГГЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

Выделение ДНК проводили методом осаждения на сорбенте при помощи коммерческого набора «Универсальная пробоподготовка» (ООО «Лаборатория Изоген» Россия, Москва). Оценку количества выделенной ДНК проводили на спектрофотометре Varian Cary 100 Scan (Varian, Австралия). Использовали кварцевые кюветы вместимостью 4 см3. Исследуемые растворы ДНК разбавляли в соотношении 1:40 деионизированной водой. Измерение абсорбции проводили при длине волны 260 нм. Расчет концентрации производили по формуле [7]

с (мкг/см3) = (A260/0,020)x40, (1)

где А260 — величина поглощения, измеренная при 260 нм; 0,020 — коэффициент для двуцепочной ДНК; 40 — коэффициент разбавления.

Подбор родоспецифичных прай-меров осуществляли, используя ба-

Таблица1

Номер программы Шифр образца Режим термообработки

1 Al; Ml 95 °С — 2 мин

2 A2; M2 105 °С — 2 мин

3 A3; M3 115 °С — 2 мин

4 A4; M4 125 °С — 2 мин

5 AS; MS Не обработанные

зу данных геномов GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information). Для видовой идентификации использовали случайную короткую олигонуклеотидную последовательность (TGCCCGTCG), проявляющую избирательную специфичность к ДНК апельсина и мандарина [8]. Синтез праймеров осуществлялся ЗАО «Евроген» (Россия, Москва). Расчет температуры отжига праймеров проводили по формуле [9]

T = 4(G + C) + 2(A + T),

(2)

где G, C, A, T — нуклеотиды гуанин, ци-тозин, тимин и аденин, соответственно.

Реакционную смесь для проведения ПЦР готовили с использованием набора реагентов «GenPak PCR Core» (ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия, Москва).

Разделение продуктов амплификации проводили электрофоретически в 2%-ном агарозном геле (ООО «Компа-

Таблица2

Шифр образца Состав

С1 Сок апельсина 100%

С2 Сок мандарина 100%

СЗ Сок апельсина 80%/сок мандарина 20%

С4 Сок апельсина 90%/сок мандарина 10%

С5 Сок апельсина 95%/сок мандарина 5%

1 Сб Сок апельсина 97%/сок мандарина 3% |

Таблица 3

Наименование образца Показатель абсорбции при 260 нм Концентрация ДНК в растворе, мкг/см3 Наименование образца Показатель абсорбции при 260 нм Концентрация ДНК в растворе, мкг/см3

Ml 0,0124 24,8 Al 0,0104 20,8

M2 0,0109 21,8 A2 0,008б 17,2

M3 0,009б 19,2 A3 0,00б3 12,б

M4 0,0088 17,б A4 0,0057 11,4

ms 0,0139 27,8 A5 0,0150 30,0

M Cl С2 К- СЗ С4 С5 С6

¿J

mm ÏÏW

ш WO

4QÜ

Jon ttmm

Рис. 1. Результаты амплификации

цитрусовых соков с применением родоспецифичных праймеров: К— отрицательный контроль; М1, М2, М3, М4, М5 — образцы ДНК сока мандарина; А1, А2, А3, А4, А5 — образцы ДНК сока апельсина

Рис. 2. Результаты амплификации с использованием коротких праймеров для видовой идентификации ДНК соков: М — маркер длин фрагментов; С1, С2, С3, С4, С5, С6 — стерилизованные соки и их смеси в соответствии с табл. 2; К— отрицательный контроль

ния Хеликон» Россия, Москва) в ТВЕ-буфере (Fermentas, США) с добавлением бромистого этидия (ООО «Лаборатория Изоген» Россия, Москва). Ам-пликоны визуализировали при помощи трансиллюминатора УВТ-1 (ООО «Био-ком» Россия, Москва) в УФ свете с длиной волны 360 нм и фотографировали.

Была проведена спектрофотометри-ческая оценка концентрации ДНК, выделенной из исследованных образцов. Результаты количественной оценки растворов ДНК представлены в табл. 3.

Целостность исследуемого фрагмента ДНК-матрицы определяли при помощи праймеров, специфичных роду Citrus со следующими последовательностями: Cit_for — 5,-CTT CCA AGC TAA CGA TGC -У; Cit_rew — 5'- CTG TCC TAT CCA TTA GAC AAT G — 3. Для данных праймеров были оптимизированы условия амплификации: Первичная денатурация 1 цикл (95 °С — 3 мин); амплификация 35 циклов (денатурация: 94 °С — 15 с; отжиг праймеров: 60 °С — 45 с; элонгация 72 °С — 30 с); заключительная элонгация 1 цикл (72 °С — 3 мин). Результаты амплификации представлены на рис. 1.

По результатам спектрофотометри-ческих измерений растворов ДНК, в образцах М5 и А5 обнаружена наивысшая концентрация нуклеиновых кислот. При повышении температуры отмечается динамика снижения концентрации выделенной ДНК. Несмотря на снижение концентрации, количество ДНК во всех растворах удовлетворяет требованиям проведения ПЦР.

В результате ПЦР наличие продуктов амплификации отмечалось во всех пробах вне зависимости от условий их термической обработки. Это означает, что полинуклеотидная цепь анализируемого фрагмента сохранила свою структуру даже после нагревания до 125 °С в течение 2 мин. Это позволяет сделать вывод, что применение ПЦР возможно для исследования продуктов, подвергшихся жестким условиям пастеризации и стерилизации.

Для выявления фальсификации, связанной с заменой доли сока апельсина соком мандарина нами разработан протокол проведения исследования: Первичная денатурация 1 цикл (95 °С — 3 мин); амплификация 35 циклов (денатурация: 94 °С — 15 с; отжиг праймеров: 46 °С — 45 с; элонгация 72 °С — 45 с); Заключительная элонгация 1 цикл (72 °С — 3 мин) [8]. Результаты амплификации представлены на рис 2.

0

1 <

§

ш I-

5 • 2015 ПИВО и НАПИТКИ

33

ТЕХНОЛОГИНЕОКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

0

1 <

§

ш I-

ПЦР прошла успешно во всех образцах. В образце 100%-ного апельсинового сока образовался один фрагмент длиной 500 пар нуклеотидов. В образце 100%-ного сока мандарина, а также во всех образцах, содержащих сок мандарина, образовалось по два фрагмента: 500 и 300 пар нуклеоти-дов. Реакция позволяет обнаруживать ДНК мандарина в фальсифицированном апельсиновом соке, даже если доля замены составляет менее 3% от общего объема.

По результатам проведенных исследований можно отметить следующее.

1. Полинуклеотидная цепь исследуемого фрагмента ДНК-матрицы сохраняет свою структуру после термообработки при 125 °С в течение 2 мин.

2. Применение ПЦР эффективно при исследовании продуктов, прошедших высокотемпературную обработку.

3. Чувствительность метода ПЦР позволяет обнаруживать мандариновый сок даже если его содержание в составе апельсинового сока не превышает 3% от общего объема

4. Были синтезированы праймеры, специфичные роду Citrus, и сформулирован протокол амплификации.

ЛИТЕРАТУРА

1. CODEX STAN 247-2005 General Standard for Fruit Juices and Nectars.

2. Council Directive 93/77/EEC of September 21, 1993 relating to fruit juices and certain similar products.

3. Zachar P. Identification of milk and milk products/Zachar P. et al. // Mljekarstvo. — 2011. — Vol. 3. — P. 199-207.

4. Kumar S. Factors enhancing protein thermostability / Kumar S, Tsai CJ, Nussinov R. // Protein Eng. — 2000. — Mar 13. — Vol. 3. — P. 179-91.

5. Karni, М. Thermal Degradation of DNA/ Moshe Karni, Dolev Zidon, Pazit Polak, Zeev Zalevsky, and Orit Shefi1 // DNA

AND CELL BIOLOGY — 2013. — Vol. 32. — N. 6.

6. ГОСТ р 52186-2003. Консервы. Соки фруктовые восстановленные. Технические условия.

7. Сомма, М. «Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. Сессия 4. Выделение и очистка ДНК». Всемирная организация здравоохранения, Европейское региональное бюро.

8. Колпаков, Е. Ю. Применение коротких олигонуклеотидных последовательностей для выявления фальсификации апельсинового сока/Е. Ю. Колпаков, А. В. Самойлов // XIII международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (г. Казань, 15-17 апреля 2014 г.). Сборник тезисов докладов. — Казань: Изд. «Отечество» 2014. — 125 с.

9. Suggs, S. Using purified genes/Suggs, S. V., Hirose, T., Myake, D. H., Kawashima, M. J., Johnson, K. I., and Wallace, R. B. // ICN-UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. — 1981. — Vol. 23. — P. 683-693. &

Метод молекулярно-генетической идентификации стерилизованных цитрусовых соков

Ключевые слова

ДНК; полимеразная цепная реакция; термоустойчивость; термообработка; молекулярно-генетические методы.

Реферат

При производстве апельсинового сока используются четыре группы цитрусовых: сладкий апельсин, мандарин, кислый апельсин, а также гибриды сладкого апельсина и мандарина, однако европейские страны не допускают присутствия в соке сладкого апельсина соков других групп цитрусовых. В связи с этим необходимо проводить качественный контроль присутствия соков других цитрусовых, а при необходимости и количественный. Для решения задачи видовой идентификации промышленных образцов фруктовых соков было необходимо: определить устойчивость нуклеиновых кислот к условиям термической обработки и определить возможность выявления фальсификации с применением видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров, связанной со смешиванием соков апельсина и мандарина. Объектом исследования служили соки зрелых плодов апельсина и мандарина, полученные путем прямого отжима и подвергнутые термической обработке. Выделение ДНК проводили методом осаждения на сорбенте. Были синтезированы праймеры специфичные роду Citrus и оптимизированы протоколы амплификации. ДНК проявила устойчивость структуры при нагревании образца до 125 °С в течение 2 мин и при условиях 118 °С — 10 мин, 1,3 кПа. Была доказана эффективность полимеразной цепной реакции (ПЦР) при исследовании соков, прошедших высокотемпературную обработку. Установлена максимальная чувствительность метода ПЦР при обнаружении замещения сока апельсина соком мандарина в количестве 3% от общего объема.

Авторы

Колпаков Евгений Юрьевич, аспирант;

Самойлов Артем Владимирович, канд. биол. наук

ВНИИ технологии консервирования,

142703, Московская область, г. Видное, ул. Школьная, д. 78,

molgen@vniitek.ru

Method of Molecular-genetic Identification of Sterilized Citrus Juices

Key words

DNA; polymerase chain reaction; thermostability; heat treatment; molecular-genetic method.

Abstract

During orange juice producing the four groups of species are used. They are sweet orange, mandarin, sour orange, as well as hybrids of sweet orange and mandarin. However, European countries don't approve the presence of juice from the fruit belonging to other citrus groups in juice from sweet orange. In accordance with it the implementation of quality and, if necessary, quantity control for presence of other citrus juice additions. The right way to solve this problem is usage the robust species-sensitive identification of industrial fruit juice industrial samples. It should be done by two ways. The first one is determination the nucleic acids stability to heat treatment conditions. The second one is determination the possibility of adulteration identifying by using the species-specific oligonucleotide primers. As the research objects the thermal treated direct extraction juices made from mature orange and mandarin were taken. DNA extraction was carried out by precipitation on sorbent. The primers specific for Citrus have been defined and synthesized. So amplification protocols have been optimized. Extracted DNA samples shown significant stability after heating up to 125 °C during 2 min. And that stability was maintained at 118 °C and 1.3 kPa. The effectiveness of PCR within investigations of hard heat treated juices has been proved. Experimentally determined PCR sensitiveness was approximately 3% of mandarin juice addition in sweet orange one.

Authors

Kolpakov Evgeniy Yurievich, Post-graduate Student; SamoylovArtem Vladimirovich, Candidate of Biological Science All-Russian Research Institute of Canning Technology, 78 Shkolnaya St., Vidnoye, Moscow region, 142703, Russia, molgen@vniitek.ru

34 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2015