CC BY
71
5. Розуменко, В. Д. Технология метода лазерной термодеструкции внутримозговых опухолей / В. Д. Розуменко [и др.] // Мшпнвазивна нейрохрурпя Украшський нейрохрурпчний журн. -2001. - № 2. - С. 38-40.
6. Розуменко, В. Д. Морфологическое обоснование применения метода лазерной термодеструкции в нейроонкологии / В. Д. Розуменко [и др.] // Украшський нейрох1рурпчний журн. -2003. - № 2. - С. 27-32.
7. Auvari, B. Effects of surface irrigation on the thermal response of tissue during laser irradiation / B. Auvari [et al] // Laser Surg. Med. -1994. - Vol. 14. - P. 386-395.
8. Krishnamurthy, S. Lasers in Neurosurgery / S. Krishnamurthy, S. K. Powers // Lasers in Surgery and Medicine. - 1994. - Vol. 15. -P. 126-167.
9. Rosomoff, H. Reaction of neoplasm and brain to laser / H. Ro-somoff, F. Carroll // Arch. Neurol. - 1966. - Vol. 14. - P. 143-148.
10. Sugiyama, K. Stereotactic interstitial laser-hyperthermia using Nd-YAG laser / K. Sugiyama [et al] // Stereotact. Funct. Neurosurg. -1990. - Vol. 54-55. - P. 501-505.
11. Welsch, A. J. Optical-thermal response of laser-irradiated tissue / A. J. Welsch, M. J. C. van Germet. - N.-Y.: Plenum press, 1995. - P. 4-5.
РЕЗЮМЕ
О. В. Острейко, С. В. Можаев, Д. Е. Мацко, М. А. Шевцов, А. С. Поживил
Гистологические характеристики области мозга, подвергнутой лазерной термодеструкции
В области термодеструкции мозга кроликов, достигнутой инфракрасным лазерным облучением, выявлены 3 четко отграниченные зоны: зона некроза, лимфоцитарной инфильтрации, нейро-дегенеративных изменений. Границей с неизмененным мозгом служит мезенхимально-глиальный рубец. Отсутствуют повреждения в структурах мозга, граничащих с зоной воздействия лазера.
Ключевые слова: лазерная термодеструкция мозга, зоны лазерного воздействия на мозг.
SUMMARY
O. V. Ostreyko, S. V. Mojaev, D. E. Matzko, M. A. Sheutsou, A. S. Pojiuil
Histological characteristics of the brain region exposed to laser thermodestruction
Three distinct zones: the zone of necrosis, the zone of infiltration, and the zone of neurodegenerative changes were revealed in the region of the rabbit brain after thermoablation with infrared irradiation. The mesenchymo-glial scar served as the border with the normal brain tissue. No changes were observed in the brain structures adjoined to the area of laser exposure.
Key words: laser thermoablation, zones of laser effect in the brain tissue.
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 616.858:575
С. Н. Пчелина, А. К. Емельянов, А. С. Дроздова, А. Ф. Якимовский, А. Л. Шварцман
МЕТОД «ДОЗЫ ГЕНА» НА ОСНОВЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДЕЛЕЦИЙ/МУЛЬ-ТИПЛИКАЦИЙ ЭКЗОНОВ ГЕНА РДЯК2 И ГЕНА Б^Д У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ПАР-КИНСОНА
Лаборатория молекулярной генетики человека Петербургского института ядерной физики имени Б. П. Константинова РАН; Отдел молекулярно-гене-тических технологий, кафедра нормальной физиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
Метод количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (Real-Time PCR) в настоящее время широко используется для определения количества копий вируса в организме, при оценке уровня экспрессии генов, для оценки числа копий гена при создании трансгенных животных и для оценки уровня амплификации генов в опухолевых тканях [10, 15, 18].
Принципиальной особенностью ПЦР в режиме реального времени является возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время ее проведения. Для детекции ПЦР-продукта используются флуоресцентно-меченные ДНК-зонды (технологии TaqMan) или флуоресцентные красители (SYBR Green), обеспечивающие уровень флуоресценции, прямо пропорциональный количеству ПЦР-продукта. Все это позволяет повысить чувствительность метода ПЦР и избежать проведения последующего электрофореза ПЦР продуктов. При использовании стандартов, заданной концентрации ДНК, и построении стандартной кривой (циклов ПЦР до того, как прибор детектирует накопление продукта амплификации (значение CT) в зависимости от исходной концентрации ДНК) метод позволяет определять точную концентрацию ДНК/РНК в исследуемом образце. Метод количественной ПЦР в режиме реального времени получил широкое распространение и в настоящее время во многих лабораториях вытеснил методы полуколичественной ПЦР [6]. В частности, этот метод используется для диагностики ряда заболеваний, связанных с деле-циями или дупликациями генов [24]. Нами метод количественной ПЦР в режиме реального времени был применен для идентификации делеций/мультипликаций экзонов гена PARK2 и мультипликаций гена SNCA у пациентов с болезнью Паркинсона (БП).
БП - распространенное нейродегенеративное заболевание, связанное с гибелью дофаминергических нейронов в черной субстанции. Механизм нейродегенерации при БП остается неясным. По этой причине не существу-
ет лабораторных диагностических тестов БП, и доля случаев неправильной постановки диагноза достигает 25 % [9]. Важным подходом для изучения молекулярно-гене-тических основ БП является исследование моногенных форм заболевания.
Сегодня описано, по крайней мере, пять генов, мутации в которых приводят к развитию менделируюших форм заболевания: гены альфа-синуклеина (SNCA) и обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2) ассоциированы с развитием аутосомно-доминантных форм БП и гены паркина (PARK2), DJ1, PINK 1 - c аутосомно-реце-сивной формой заболевания с ранним началом [5]. Ранее нами показано широкое распространение наследственных форм БП, связанных с мутациями в гене LRRK2 [2, 20, 21], а также проведен поиск однонуклеотидных замен в кодирующей области гена PARK2 у пациентов БП с ранним началом [1]. Нужно, однако, отметить, что делеции/ мультипликации отдельных экзонов гена PARK2 составляют не менее половины выявляемых в гене мутаций [8]. В настоящем исследовании нами проведен анализ дозы отдельных экзонов гена PARK2, а также мультипликации гена SNCA у пациентов с БП.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Поиск делеций и мультипликаций экзонов гена PARK2 осуществлялся в группе пациентов с ранним началом заболевания, включавшую 70 пациентов с БП с началом заболевания в возрасте до 50 лет включительно (средний возраст - 56,4±7,9 года; средний возраст начала заболевания - 44,1 ±5,2 года; 40 женщин,
30 мужчин). В исследование по поиску мультипликаций в гене SNCA были включены 58 пациентов с семейной формой БП с аутосомно-доминант-ным типом наследования (средний возраст - 61±10 года; средний возраст начала заболевания -49,59± 10,78 года;
31 женщина, 27 мужчин).
Все пациенты являлись жителями
Санкт-Петербурга и находились на длительном амбулаторном наблюдении в МКДЦ СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. В исследование вошли пациенты с выраженной симптоматикой БП, не имеющие в анамнезе других дегенеративных заболеваний. Диагноз выставлялся при наличии, как минимум, двух из четырех признаков пар-кинсонических нарушений: тремора покоя, ригидности скелетной мускулатуры пластического типа, брадики-нези и постуральных нарушений [4]. Исследование одобрено этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова.
На все экзоны, включающие кодирующую область гена PARK2 (экзоны 2-12), быши синтезированы прайме-ры и флуоресцентные зонды TaqMan. Структура зондов и праймеров на экзоны 2-5 быта описана ранее [16]. Прай-меры и зонды на 6-12 экзоны гена PARK2 быти разработаны нами с использованием программы «PrimerExpress». В качестве референсного гена быт использован одноко-пийный ген ß-глобина (HBB) (табл. 1).
Количественная ПЦР в реальном времени проводилась на приборе ABI Prism 7000. Амплификацию ДНК проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 16,6 ммоль (NH4)2SO4, 20 ммоль Tris-HCl, pH 8,8, при 25 °С, 0,1 % тритон X-100, 2,5 ммоль MgCl2, по 5 пмоль каждого праймера, по 10 пмоль каждого зонда TaqMan, 200 мкмоль dNTP, 5 единиц активности (u) Taq ДНК-поли-меразы и 5-15 нг геномной ДНК. Построение стандартной кривой проводилось с использованием образцов с известной концентрацией ДНК. В качестве стандартов мы использовали ДНК человека в количестве 5, 15, 55 и 220 нг (рис. 1). Для каждого образца измерение концентрации проводилось три раза, результаты усреднялись. Стандартная кривая строилась в каждом эксперименте для соответствующего экзона гена PARK2 и для референс-гена.
Прибор ABI Prism 7000 автоматически для каждого образца с неизвестной концентрацией располагает коли-
Таблица 1
Структура парймеров и зондов TaqMan для оценки делеций/мультипликаций экзонов гена РЛЯК2 и мультипликации гена SNCA методом количественной ПЦР
в реальном времени
Экзон гена РАИК2 Структура праймеров и зондов
6 F: 5'- CACCCCACCTCTGACAAGGA R: 5'- TGCAAGTGATGTTCCGACTATTTG 5'-FAM-ACACCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCA-BHQ1
7 F: 5' - GAGCCCCGTCCTGGTTT R: 5' - CACAGTATAAGTGGAAACAGTCTAAGCA 5'-FAM-CAGTGCAACTCCCGCCACGTGA-RTQ1
8 F: 5'-GACGTTTTTGTGATTAATTCTTCTTTCC R: 5'-CCTGCTCTTCTCCCAGAATCCT 5'-FAM-TCCCAACTCCTTGATTAAAGAGCTCCATCAC-MBHQ1
9 F: 5'- TGAAATTTGCAGTCAGTTGAAAGTT R: 5' - AACACGCCCCCCATCTG 5'-FAM- CCAGCAGTATGGTGCAGAGGAGTGTGTC-RTQ1
10 F: 5'-TGGATGTGTGTTCTTTTGCAGTT R: 5'-ACTGCACTCCCCTTCATGGT 5'-FAM-CCTTCTGCCGGGAATGTAAAGAAGCG-MBHQ1
11 5'-TGTTTCCCCAGGCCTACAGA 5'-GAGGCTGCTTCCCAACGA 5'-FAM-TCGATGAAAGAGCCGCCGAGCA-MBHQ1
12 5'- GCCCGACTCTCTCCATCAGA 5'- GAGCTCCCTGGGACTTGCA 5'-FAM- CCCTTTGGCACACCCTCTCTGTCCA-RTQ1
Ген ИББ (референс-ген для анализа дозы экзонов гена РАЯК2 5'-GAGAAGTCTGCCGTTACTGC-3' 5'-CTTGATACCAACCTGCCCAG-3' 5'-(R6G)AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-(RTQ 1)
Экзон гена 8КСА
3 FOR 5'- TTCCAGTGTGGTGTAAAGAAATTCAT -3' REV 5'- CCTTGGCCTTTGAAAGTCCTT -3' 5'- R6G-AGCCATGGATGTATTC-3'
6 5'-AATGAAGAAGGAGCCCCACAG-3' 5'-CTCAGAAGGCATTTCATAAGC-3' 5'-R6G-AGGAATTCTGGAAGATATGCCTGTGG-BHQ-3'
Ген ИББ (референс ген для анализа дозы гена 8КСА FOR 5'- TGGGCAACCCTAAGGTGAAG -3' REV 5'- GTGAGCCAGGCCATCACTAAA -3' 5'- FAM-CTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGC- 3'
Рис. 1. Построение стандартной кривой при проведении количественной ПЦР в режиме реального времени с зондом TaqMan на экзон 2 гена РЛКК2: а - результат ПЦР с использованием сандартов ДНК человека (5, 15, 55 и 220 нг). ПЦР с каждым стандартом проводилась в трех повторах; б - построение стандартной кривой
чество циклов ПЦР до того, как детектирует продукт амплификации (значение СТ - пересечение кинетической кривой реакции с базовой линией) на график стандартной кривой для соответствующего экзона гена РЛЯК2 и референс-гена и вычисляет концентрацию исследуемого образца (рис. 1). Значение отношения концентрации образца, полученное с использованием зонда для соответствующего экзона, нормированное на показатели, полученные для референс-гена (КРЛКК2/НВВ), интерпретировалась следующим образом: 0,4-0,6 - гетерозиготная делеция, 0,8-1,2 - норма (отсутствие делеции/мультипли-кации соответствующего экзона), 1,5 и более - гетерозиготная мультипликация экзона.
Аналогичным методом была проведено исследование по оценке мультипликации гена БМСЛ. Для выявления мультикопийности гена БМСЛ были разработаны прай-меры и зод, комплементарные экзону 3 гена БМСЛ. Для подтверждения данных по мультикопийности гена были использованы праймеры и зонды комплементарные экзону 6 (табл. 1). В качестве референс гена также использовали ген НВВ. Реакцию амплификации проводили в одной пробирке при условиях аналогичных амплификации экзонов гена РЛКК2.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Метод «дозы гена» на основе количественной ПЦР в режиме реального времени для выявления гетерозиготного носительства делеций экзонов гена РЛЯК2 был отработан на контрольных образцах с делецией 3 и 4 экзонов гена РЛЯК2 в гетерозиготном состоянии трех пациентов с ацтосомно-рецессивным ювенильным паркинсонизмом (ЛЯ-1Р) (контроль 1, контроль 2), предоставленных нам профессором С. Н. Иллариошкиным (НЦ «Неврология», Москва) [12] (табл. 2). Всего нами выявлено 4 пациента с делециями экзонов в гене РЛЯК2. У трех делеции различных экзонов выявлены в гетерозиготном состоянии. Полученные данные суммированые в табл. 3.
В определенных популяциях генетические дефекты гена РЛЯК2 (гомозиготные и гетерозиготные делеции, компаунд-гетерозиготные мутации, мутации в сайте
Таблица 2
Отношение концентрации образца экзонов гена РЛЯК2 к значениям, полученным для референс-гена у пациентов с БП (ЯРЛЯК2/НББ) (выборочные данные)
ЯРЛЯК2/НББ
ДНК 2 экз. 3 экз. 4 экз. 5 экз. 6 экз. 7 экз. 8 экз. 9 экз. 10 экз. 11 экз. 12 экз.
Контроль 1 1,0±0,06 0,5±0,01 1,2±0,02 1,2±0,01 1,2±0,02 1,1±0,01 0,9±0,03 1,1±0,01 0,9±0,07 0,9±0,03 0,9±0,07
Контроль 2 1,1±0,07 1,1±0,06 0,6±0,02 1,1±0,01 1,0±0,08 1,0±0,02 1,3±0,03 1,0±0,02 1,1±0,02 1,2±0,03 1,3±0,07
РБ17 1,2±0,04 0,5±0,04 1,1±0,04 1,0±0,07 1,1±0,05 1,1±0,01 1,1±0,03 1,0±0,04 1,2±0,03 1,0±0,01 1,0±0,03
РБ25 1,1±0,01 1,1±0,07 1,0±0,04 1,0±0,07 0,9±0,05 0,9±0,02 0,9±0,03 0,7±0,01 0,9±0,01 0,9±0,01 0,9±0,02
РБ30 1,0±0,04 1,1±0,02 0,7±0,04 1,2±0,01 1,0±0,03 0,8±0,02 1,0±0,03 1,2±0,02 1,3±0,02 1,3±0,02 1,2±0,03
РБ37 1,1±0,02 0,9±0,01 1,0±0,01 0,9±0,05 1,0±0,07 1,0±0,04 0,8±0,01 1,0±0,04 0,8±0,01 0,8±0,04 1,0±0,04
РБ39 0,9±0,07 0,9±0,02 0,7±0,05 0,9±0,05 1,1±0,08 0,9±0,08 1,1±0,01 1,3±0,03 0,8±0,01 0,9±0,01 0,9±0,07
РБ62 0,9±0,01 0,9±0,09 1,0±0,05 1,1±0,05 0,8±0,03 1,1±0,07 0,9±0,05 1,1±0,04 0,9±0,02 1,2±0,07 0,9±0,08
РБ73 1,2±0,01 1,1±0,03 0,6±0,01 0,9±0,03 1,1±0,01 1,1±0,01 1,1±0,01 0,5±0,02 1,0±0,05 1,0±0,02 0,9±0,08
РБ101 0,9±0,03 1,1±0,01 0,7±0,01 0,8±0,01 0,8±0,03 0,5±0,04 1,2±0,05 1,1±0,02 1,1±0,08 0,8±0,05 1,4±0,01
Примечание: указано среднее значение ± стандартное отклонение.
Прмечание: Т. - тремор; А. ность.
сплаисинга, инсерции, миссенс-мута-ции) оказываются ответственными за развитие 50 % случаев аутосомно-ре-цессивного ювенильного паркинсонизма (AR-JP) и 10-20 % БП с ранним началом (EO-PD) [22, 25]. Специфический характер мутациИ в гене PARK2 (доминируют компаундное носительство де-лециИ/дупликациИ экзонов в гетерозиготном состоянии [8], описана также частичная трипликация гена PARK2 [17] определяет некоторые особенности методов их мутационного скрининга. Для выявления делециИ/мультипликациИ 11 кодирующих экзонов гена PARK2 (экзоны 2-12) у пациентов с БП с ранним началом мы использовали метод количественноИ ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan, так называ-емыИ метод «дозы гена» (gene dosage). Этот метод обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов, удобен в исполненнии, имеет достаточно невысокую стоимость и может быть применен для массового скрининга. УказанныИ метод менее трудоемок и более удобен для диагностики вышеуказанных мутациИ, чем применявшиИ-ся ранее метод полуколичественноИ мультиплексноИ амплификации [14]. Нужно, однако, помнить, что на финаль-ныИ выход ПЦР-продукта могут значительно влиять состав амплификационноИ смеси, условия амплификации, количество исходного образца и случаИные события на первых циклах ПЦР, а также качество используемых стандартов ДНК. Проведение совместноИ амплификации экзонов гена PARK2 и рефернс-гена в одноИ пробирке значительно повышает точность анализа. В литературе обсуждаются недостатки этого метода [23]. В настоящее время для оценки делециИ/мультипликациИ протяженных фрагментов ДНК широкое распространение также получил метод количественноИ мультиплексноИ лигазноИ про-бозависимоИ реакция (MLPA-анализ) [7, 13].
В настоящем исследовании только у одного пациента были выявлены делеции двух экзонов гена PARK2. Необходимо отметь, что используемыИ нами метод не позволяет на прямую определить хромосомную локализацию выявляемых перестроек. Такая оценка возможна лишь при семеИном анализе при наличии родственников 1 -И степени родства. У пациента PD73 ДНК близких родственников была недоступна. Остальные пациенты с мутациями в гене PARK2 являлись гетерозиготными носителями. Таким образом, мы не можем рассматривать мутации в гене PARK2, выявленные в настоящем исследовании, как причину развития БП.
В настоящем исследовании нами впервые описан случаИ БП, обусловленноИ мультипликациями в гене SNCA. Полученные значения RSNCA/HBB составили 1,4±0,03, 1,6±0,02 для 3 и 6 экзонов соответсвенно, что соответствует дупликации гена. Родословная пробанда с дупликациеИ гена SNCA представлена на рис. 2. Пациент с выявленноИ му-тациеИ (мужчина, 48 лет) имеет акинетико-ригидно-тре-морную форму заболевания. Дебют заболевания - 38 лет. Ответ на терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами
Таблица 3
Мутации в гене PARK2, выявленные у пациентов с БП
Пациент Пол Мутация Возраст /возраст начала (лет) Симптомы Ответ на терапию Наследственность
PD17 Муж. del ex3 65/32 А.Р.Т. ХорошиИ Есть
PD73 Жен. del ex4, ex9 55/50 А.Т. УмеренныИ Нет
PD97 Жен. del ex8 47/44 А.Р.Т. ХорошиИ Нет
PD101 Жен. del ex 7 79/45 Т Не лечен Нет
акинезия (брадикинезия); Р. - мышечная ригид-
Рис. 2. Родословная пациента с дупликацией гена 8КСА. Указан возраст на момент обследования, в скобках - возраст начала заболевания
положительный. Имеются выраженные осложнения от длительного приема данных препаратов в виде дискине-зии. В нашем исследовании пациенты с семейной формой БП составили 1,6 %, что соответствует данным, полученным ранее [11, 19]. Анализ мультипликации гена БМСА у 61 пациента с семейной формой БП в Москве не выявил носителей мутации [3]. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что дупликации и трип-ликации гена БМСА являются редкой причина развития БП (табл. 2).
Разработанный быстрый и эффекетивный метод выявления делеций и дупликаций экзонов 2-12 гена РАЯК2 и мультипликаций гена БМСА на основе количественной ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan может быть применен для скрининга мутаций, связанных с изменением копийности этих генов среди пациентов с БП.
Исследование поддержано грантом инновационных научных проектов СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова.
Авторы выражают благодарность коллегам из НИИ Неврологии (Москва) и лично профессору С. Н. Иллариошкину за предоставление контрольных образцов ДНК больных БП с мутациями в гене РАКК2.
ЛИТЕРАТУРА
1. Иванова, О. Н. Молекулярно-генетический анализ ранних форм болезни Паркинсона / О. Н. Иванова, А. Ф. Якимовский, С. Н. Пчелина // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. -2005. - Т. XII. - С. 105-106.
2. Пчелина, С. Н. Клиническое течение LRRK2-ассоциирован-ноИ болезни Паркинсона / С. Н. Пчелина, О. Н. Иванова, А. К. Емельянов, А. Ф. ЯкимовскиИ // Журн. неврол. и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 2011. - Т. 111. - C. 56-62.
3. Семенова, Е. В. Анализ дозы гена a-синуклеина при ауто-сомно-доминантноИ форме болезни Паркинсона / Е. В. Семенова [и др. ] // Генетика. - 2009. - Т. 45. - С. 1-3.
4. Скоромец, А. А. Нервные болезни / А. А. Скоромец, А. П. Ско-ромец, Т. А. Скоромец. - М.: МЕДпресс-информ, 2005. - 544 с.
5. Cookson, M. R Parkinson's disease: insight from pathways / M. R. Co-okson, O. Bandmann // Hum Mol Genet. - 2010. - Vol. 19. - P. R21-R27.
6. Ding, C. Quantitative analysis of nucleic acids the last few years of progress / C. Ding, C. R Cantor // J. Biochem. Mol. Biol. - 2004. -Vol. 37. - P. 1-10.
7. Djarmati, A. Rapid and reliable detection of exon rearrangements in various movement disorders genes by multiplex ligation-dependent probe amplification / A. Djarmati // Mov Disord. - 2007. - Vol. 22. -P. 1708-1714.
8. Hedrich, K. Distribution, type, and origin of Parkin mutations: review and case studies / K. Hedrich [et al] // Mov Disord. - 2004. -Vol. 19. - P. 1146-1157.
9. Hughes, A. J. What features improve the accuracy of clinical diagnosis in Parkinson's disease: a clinicopathologic study / A. J. Hughes [et al] // Neurology. - 2001. - Vol. 57. - P. S34-S38.
10. Hughes, T. Molecular monitoring of BCR-ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia / T. Hughes, S. Bran-ford // Blood Rev. - 2006. - Vol. 20. - P. 29-41.
11. Ibanez, P. Alpha-synuclein gene rearrangements in dominantly inherited parkinsonism: frequency, phenotype, and mechanisms / P. Ibanez [et al] // Arch. Neurol. - 2009. - Vol. 66. - P. 102-108.
12. Illarioshkin, S. N. Mutation Analysis of the parkin Gene in Russian Families with Autosomal Recessive Juvenile Parkinsonism / S. N. Illarioshkin [et al] // Mov Disord. - 2003. - Vol. 18. - P. 914-919.
13. Kim, S. Phase analysis identifies compound heterozygous deletions of the PARK2 gene in patients with early-onset Parkinson disease / S. Kim [et al] // Clin. Genet. - 2011.
14. Lucking, C. B. Association between early-onset parkinson's disease and mutations in the parkin gene / C. B. Lucking [et al] // N. Engl. J. Med. - 2000. - Vol. 342. - P. 1560-1567.
15. Mankame, T. Altered gene expression in human cells treated with the insecticide diazinon: correlation with decreased DNA excision repair capacity / T. Mankame [et al] // Hum. Exp. Toxicol. - 2006. -Vol. 25. - P. 57-65.
16. Maruyama, M. Novel Mutation, Pseudo-Dominant Inheritance, and Possible Familial Affects in Patients with Autosomal Recessive Juvenile Parkinsonism / M. Maruyama [et al] // Ann of Neurol. -2000. - Vol. 48. - P. 245-250.
17. Mata, I. F. Homozygous partial genomic triplication of the parkin gene in early-onset parkinsonism/ I. F. Mata [et al] // Neurosi Lett. - 2005. - Vol. 380. - P. 257-259.
18. Niesters, H. G. Molecular and diagnostic clinical virology in real time // Clin. Microbiol. Infect. - 2004. - Vol. 10. - P. 5-11.
19. Nishioka, K. Clinical heterogeneity of alpha-synuclein gene duplication in Parkinson's disease / K. Nishioka [et al] // Ann. Neurol. -2006. - Vol. 59. - P. 298-309.
20. Pchelina, S. N. G2019S LRRK2 Mutation in Familial and Sporadic Parkinson's Disease in Russia/ S. N. Pchelina [et al] // Mov. Disord. - 2006. - Vol. 21. - P. 2234-2236.
21. Pchelina, S. N. Screening for LRRK2 mutations in patients with Parkinson's disease in Russia: identification of a novel LRRK2 variant/ S. N. Pchelina [et al] // Eur. J. Neurol. - 2008. - Vol. 15. - P. 692-696.
22. Poorkaj, P. Parkin mutation analisis in clinic patients with early-onset Parkinson's disease / P. Poorkaj [et al] // Am. J. Med. Genet. - 2004. - Vol. 129. - P. 44-50.
23. Ruiz-Ponte, C. Duplication and deletion analysis by fluorescent real-time PCR-based genotyping / C. Ruiz-Ponte, A. Carracedo, F. Barros // Clin Chim Acta. - 2006. - Vol. 363. - P. 138-146.
24. Traeger-Synodinos, J. Real-time PCR for prenatal and preim-plantation genetic diagnosis of monogenic diseases / J. Traeger-Syno-dinos // Mol. Aspects Med. - 2006. - Vol. 27. - P. 176-191.
25. Wu, R. Parkin Mutations and Early-Onset Parkinsonism in a Taiwanese Cohor t / R. Wu [et al] // Arcch. Nrurol. - 2005. - Vol. 62. -P. 82-87.
РЕЗЮМЕ
С. Н. Пчелина, А. К. Емельянов, А. С. Дроздова, А. Ф. Якимовский, А. Л. Шварцман
Метод «дозы гена» на основе количественной ПЦР в реальном времени для выявления делеций/мультипликаций экзонов гена PARK2 и гена SNCA у пациентов с болезнью Паркинсона
Изменения числа копий генов или отдельных экзонов гена могут являться причиной развития ряда наследственных патологий. С использованием разработанного метода оценки дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA на основе количественной ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan нами проведен анализ мутаций, связанных с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA у пациентов с болезнью Паркинсона (БП). Делеции отдельных экзонов гена PARK2 выявлены в 5,7 % пациентов с БП (4/70), преимущественно в гетерозиготном состоянии, что затрудняет интерпретацию их клинической значимости. Впервые в России описан случай аутосомно-доминантной БП, обусловленной дупликацией гена SNCA. Разработанный нами метод выявления мутаций с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA может быть использован для массового скрининга данных мутаций среди пациентов с БП.
Ключевые слова: болезнь Паркинсона, PARK2, SNCA, метод «дозы гена».
SUMMARY
S. N. Pchelina, A. K. Emelyanov, A. S. Drosdova, A. F. Yakimovskii, A. L. Shwarzman
Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of the PARK2 and SNCA gene dosage in patients with Parkinson's disease
Copy number variations of genes or exons can lead to development of inherited disorders. Exonic rearrangements of the PARK2 gene and multiplications of the SNCA gene in patients with Parkinson's disease (PD) were studied by means of developed «gene dosage» method based on quantitative real-time PCR with TaqMan probes. Deletions of different exons of the PARK2 gene were found in 6.2 % (4/65) of PD patients. Most of them were in heterozygous state that makes it difficult to estimate their pathogenic relevance. In one family with autosomal dominant PD the duplication of the SNCA gene was described. The suggested method for gene-dosage detection in the PARK2 and SNCA genes can be used for screening for exonic rearrangements in the PARK2 gene and multiplications of the SNCA gene in PD patients.
Key words: Parkinson's disease, PARK2, SNCA, gene dosage.
