CC BY
52
УДК 577.29
МЕТОД ДИАГНОСТИКИ РАКА ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ ДНК-ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
© 2012 Т.Н. Замай1, Г.С. Замай1, А.С. Замай1, О.С. Коловская1, Е.А. Малышева1, А.Г. Савицкая1, А.В. Крат2, В.К. Бельтюков2, А.А. Модестов2, Д.В. Попов2, Л.Л. Петрова1, Л.В. Труфанова1, О.А. Зубкова1, Е.А. Спивак1
1 Красноярский государственный университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого 2 Красноярский краевой клинический онкологический диспансер имени
А.И. Крыжановского
Поступила в редакцию 03.10.2012
Работа посвящена описанию метода диагностики рака легкого человека с помощью одноцепочеч-ных ДНК-олигонуклеотидов, специфичных к опухолевой ткани легкого человека, полученных методом технологии cell-SELEX. Исследования показали, что короткие однонитевые ДНК способны выявлять в плазме крови онкобольных продукты распада опухолевой ткани и могут быть использованы для диагностики рака легкого человека.
Ключевые слова: диагностика, рак легкого, ДНК-олигонуклеотиды
Среди всех видов онкозаболеваний рак легкого является наиболее распространенной формой злокачественных новообразований. Он затрагивает более миллиона людей по всему миру [1] и составляет около 25% всех смертей от
Замай Татьяна Николаевна, доктор биологических наук, профессор кафедры биологической химии. Email: tzamay@yandex.ru Замай Галина Сергеевна, аспирантка Замай Анна Сергеевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биологической химии. E-mail: annazamay@yandex.ru
Коловская Ольга Сергеевна, научный сотрудник НИИ молекулярной медицины и патобиохимии. E-mail: zamaykin @gmail. com
Малышева Елена Александровна, аспирантка Савицкая Анна Геннадьевна, научный сотрудник НИИ молекулярной медицины и патобиохимии. E-mail: sanna3061@gmail. com Крат Алексей Васильевич, врач-онколог Бельтюков Виктор Константинович, врач-онколог Модестов Андрей Арсеньевич, кандидат медицинских наук, главный врач. E-mail: onkolog24@ikrasmail.ru Попов Дмитрий Владимирович, заместитель главного врача
Петрова Людмила Львовна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биологической химии. E-mail: mi-la0@yandex. ru
Труфанова Людмила Васильевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биологической химии
Зубкова Ольга Александровна, научный сотрудник НИИ молекулярной медицины и патобиохимии. Email: 25.12.90.olya@rambler.ru
Спивак Екатерина Александровна, научный сотрудник НИИ молекулярной медицины и патобиохимии. Email: e.spivak@mail.ru
рака [4]. Относительная пятилетняя выживаемость пациентов при раке легкого очень низка, она составляет 13-15% для развитых стран [6] и 9% для развивающихся [3]. Однако, несмотря на разнообразие существующих методов диагностики, выявляемость больных с 1-П стадиями рака легкого составляет около 27%, а больных с Ш-ГУ стадиями - 66% [2]. При этом 5-летняя выживаемость после лечения Г стадии РЛ соответствует 70%, а IV стадии - только 5% [2]. Таким образом, снижение смертности от рака легкого человека невозможно без ранней диагностики этого заболевания.
За последние годы произошел значительный прогресс в области фармакологии. В медицинскую практику стали внедряться новые диагностические и лекарственные средства, полученные с помощью современных биотехнологий, перечень которых достаточно широк и включает белки (гормоны, цитокины, факторы свертывания крови, моноклональные антитела, ферменты, колониестимулирующие факторы, вакцины и препараты, созданные на базе клеток и тканей), полученные с помощью генно-инженерных и гибридомных технологий. В то же время все чаще начали применяться диагностические и лекарственные препараты на основе аптамеров - искусственных антител, которые по своей природе являются олигонуклеотидами. Чувствительность диагностических систем на основе аптамеров очень высока и зависит от типа мишени. В частности, аптамеры к небольшим молекулам имеют чувствительность на микромолярном уровне, а к белкам проявляют чувствительность на наномолярном и даже на субна-номолярном уровнях.
Экология и внутренние болезни
Цель работы: описание нового метода диагностики рака легкого человека на основе одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов (апта-меров).
Материалы и методы исследований. Для
селекции искусственных антител к опухолевой ткани легкого человека использовали послеоперационный материал опухолевой ткани легкого человека, предоставленный Красноярским краевым клиническим онкодиспансером. Для селекции использовали послеоперационный материал трех гистологических типов рака легкого (плоскоклеточный ороговевающий, плоскоклеточный железистый и мелкоклеточный), взятый от пациентов в возрасте 50-70 лет. Гистологический тип рака легкого при отборе искусственных антител не учитывался. Работа с биологическим материалом осуществлялась с разрешения Локального этического комитета Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» и Красноярского краевого клинического онкологического диспансера. Получение аптамеров к опухолевой ткани легкого человека проводили методом чередования позитивной и негативной селекции одноцепочечных ДНК-аптамеров из ДНК-библиотек N80 методом систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) [5]. Полученный пул аптамеров клонировали. Отдельные клоны, обладающие наибольшей специфичностью к опухолевой ткани, секвенировали. В результате были получены искусственные антитела (аптамеры) к опухолевой ткани легкого человека с флуоресцентной меткой Alexa-488, которые использовали для определения продуктов распада опухолевой ткани легкого человека в плазме крови. Для этого плазму крови инкубировали в течение 30 мин с маскирующей ДНК (0,1 мг/мл) для закрытия неспецифических сайтов связывания, а затем в течение следующих 30 мин - с аптамерами, связанными с биотином, и магнитными частицами, связанными со стрептавидином. Полученные комплексы концентрировали с помощью магнита на стенке пробирки, а надосадочную жидкость удаляли, затем комплексы, содержащие онкомаркеры, аптамеры и магнитные частицы, дважды отмывали фосфатным буфером с Са2+ и Mg2+ (рН 7,4) и разводили в 15 мкл буфера. После этого к исследуемому образцу добавляли аптамеры, меченые флуоресцентной меткой, и трижды отмывали фосфатным буфером с Са2+ и Mg2+ (рН 7,4). Подготовленный образец исследовали с помощью люминесцентной микроскопии на наличие флуоресцентной метки, свидетельствующей о присутствии в сыворотке крови белков опухолевой ткани.
Результаты и обсуждение. Селекцию ап-тамеров к опухолевой ткани легкого человека осуществляли путем чередования позитивной и
негативной технологии cell-SELEX, поскольку она позволяет выбрать наиболее специфичные для опухолевой ткани аптамеры и исключить олигонуклеотиды, способные связаться со здоровой тканью легкого. Оценку специфичности аптамеров к ткани рака легкого осуществляли с помощью люминесцентной микроскопии. После инкубации аптамеров с опухолевой тканью легкого человека появлялась флуоресценция, свидетельствовавшая о ее связывании с аптамерами, в то время как эти аптамеры не связывались со здоровой тканью, вследствие чего флуоресценции не наблюдалось (рис. 1).
^^ Опухолевая ткань легкого, . проинкубированная с аптамерами.
4*1« г л!1*' мечеными А1еха 488
Ж
ж
т.
^Норовая ткань легкого,
проинкубированная с аптамерами, ■Ичеными Меха 488
....
К-:•
1; 4
©
Рис. 1. Микроскопия опухолевой и здоровой тканей легкого человека: слева - световая микроскопия, справа - люминесцентная микроскопия
Для разделения полученного пула аптаме-ров на отдельные виды осуществляли процесс клонирования, в результате которого получали клоны аптамеров, подходящие для секвенирова-ния. В результате было получено 25 уникальных последовательностей олигонуклеотидов, обладающих высокой степенью аффинности к опухолевой ткани. На основе полученных нуклео-тидных последовательностей аптамеры были искусственно синтезированы. Примеры вторичных структур двух аптамеров представлены на рис. 2.
Рис. 2. Примеры вторичной конформации 17 и 19 клонов аптамеров к опухолевой ткани легкого человека
Наиболее специфичные клоны аптамеров были использованы для выявления в плазме он-кобольных продуктов распада опухолевой ткани. Белки, выделенные из сыворотки крови онко-больных с помощью аптамеров и магнитных частиц, флуоресцировали в зеленом диапазоне. Аналогично проведенные процедуры с кровью здоровых людей не выявляли флуоресцирующих белков в сыворотке (рис. 3).
Рис. 3. Микроскопия плазмы крови больных раком легкого: а - световая микроскопия, б -флуоресцентная микроскопия
Выводы: проведенные исследования подтвердили возможность использования аптамеров к раку легкого человека для выявления продуктов распада опухоли в плазме крови онкобольных,
а, следовательно, и возможность их применения для диагностики рака легкого человека.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (Государственный контракт № 16.512.11.2090) и КГАУ «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Артамонова, Е.В. Основные достижения в биологии, скрининге, диагностике и лечении немелко-клеточного рака легкого (НМРЛ) // Практическая онкология. 2011. №1. С. 26-35.
2. Левченко, Е.В. Скрининг рака легкого // Практическая онкология. 2010. №2. С. 88-95.
3. Шевченко, B.E. Профилирование низкомолекулярного протеома плазмы крови для обнаружения потенциальных маркеров рака легкого / В.Е. Шевченко, Н.Е. Арноцкая, О.П. Трифонова и др. // Масс-спектрометрия. 2007. №4. С. 245-253.
4. Arya, S.K Lung Cancer and Its Early Detection Using Biomarker-Based Biosensors / S.K. Arya, S. Bhansali // Chem. Rev. 2011. 111. Р. 6783-6809.
5. Berezovsky, M. Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery (AptaBID) / M. Berezovsky, M. Lechmann, M. Musheev et al. // J. Am. Chem. Soc. 2008. 130. P. 9137-9143.
б. Fiorentino, F.P. CTCF and BORIS Regulate Rb2/p130 Gene Transcription: A Novel Mechanism and a New Paradigm for Understanding the Biology of Lung Cancer / F.P. Fiorentino, M. Macaluso, F. Miranda // Molecular cancer research. 2011. №9. Р. 225-233.
METHOD OF LUNG CANCER DIAGNOSTICS WITH THE HELP OF ONE-CHAINED DNA-OLIGONUCLEOTIDES
© 2012 T.N. Zamay1, G.S. Zamay1, A.S. Zamay1, O.S. Kolovskaya1, E.A. Malysheva1, AG. Savitskaya1, A.V. Krat2, V.K. Beltyukov2, A.A. Modestov2, D.B. Popov2, L.L. Petrova1, L.V. Trufanova1, O.A. Zubkova1, E.A. Spivak1
1 Krasnoyarsk State University named after professor V.F. Voyno-Yasenetskiy 2 Krasnoyarsk Regional Clinical Oncological Dispensary named after A.I. Kryzhanovskiy
Work is devoted to the description of method of lung cancer diagnostics by means of one-chained DNA-oligonucleotides, specific to a tumoral lung tissue, received by cell-SELEX technology method. Researches showed that short one-strand DNA are capable to reveal in blood plasma of oncologic patients products of tumoral tissue disintegration and can be used for diagnostics of a lung cancer.
Key words: diagnostics, lung cancer, DNA-oligonucleotides
Tatiana Zamay, Doctor of Biology, Professor at the Biochemistry Department. E-mail: tzamay@yandex.ru; Galina Zamay, Post-graduate Student; Anna Zamay, Candidate of Biology, Associate Professor at the Biochemistry Department. E-mail: annazamay@yandex.ru; Olga kolovskaya, Research Fellow of the Scientific Research Institute of Molecular Medicine and Pathological Biochemistry. E-mail: zamaykin@gmail.com; Elena Malysheva, Post-graduate Student; Anna Savitskaya, Research Fellow of the Scientific Research Institute of Molecular Medicine and Pathological Biochemistry. E-mail: sanna3061@gmail.com; Aleksey Krat, Doctor-Oncologist; Biktor Beltyukov, Doctor-Oncologist; Andrey Modestov, Candidate of Medicine, Head Physician. E-mail: onkolog24@ikrasmail.ru; Dmitriy Popov, Deputy Head Physician; Lyudmila Petrova, Candidate of Biology, Associate Professor at the Biochemistry Department. Email: mi-la0@yandex.ru; Lyudmila Trufanova, Candidate of Biology, Associate Professor at the Biochemistry Department; Olga Zubkova, Research Fellow of the Scientific Research Institute of Molecular Medicine and Pathological Biochemistry. E-mail: 25.12.90.olya@rambler.ru; Ekaterina Spibak, Research Fellow of the Scientific Research Institute of Molecular Medicine and Pathological Biochemistry. E-mail: e.spivak@mail.ru
