CC BY
117
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© ЗАМАЙ Г.С., КОЛОВСКАЯ О.С., ГЛАЗЫРИН Ю.Е., КРАТ А.В., ЗАМАЙ А.С., МАЛЫШЕВА Е.А., САВИЦКАЯ А.Г., САЛМИНА А.Б., ОСЕДКО А.В., КОТЛОВСКИЙ Ю.В., ПОПОВ Д.В., МОДЕСТОВ А.А., ЗАМАЙ Т.Н.
УДК 577.29
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИОМАРКЕРОВ С ПОМОЩЬЮ АПТАМЕРОВ НА ПРИМЕРЕ
ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО И АДЕНОКАРЦИНОМЫ
Г.С. Замай, О.С. Коловская, Ю.Е. Глазырин, А.В. Крат, А.С. Замай, Е.А.
Малышева, А.Г. Савицкая, А.Б. Салмина, А.В. Оседко, Ю.В. Котловский, Д.В. Попов, А.А. Модестов, Т.Н. Замай
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения РФ, ректор - д.м.н., проф.
И.П. Артюхов, кафедра биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, зав. каф. - д.м.н., проф. А.Б. Салмина; Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им.
А.И. Крыжановского, гл. врач - к.м.н. А.А. Модестов.
Резюме. Разработана технология поиска и идентификации биомаркеров с помощью аптамеров, подобранных к опухолевым тканям. В качестве объекта исследования были выбраны ткани плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы. Показано, что с помощью полученных аптамеров возможно осуществлять поиск как внеклеточных, так и внутриклеточных белков-кандидатов в биомаркеры.
Ключевые слова: биомаркеры, рак легкого, аптамеры.
Онкологические заболевания занимают второе место по смертности после
сердечно-сосудистых заболеваний. Рак легкого является наиболее распространенным злокачественным новообразованием и составляет четвертую часть всех смертей от рака [9,10].
Рак легкого может развиваться из покровного эпителия слизистой оболочки бронхов, бронхиальных слизистых желез бронхиол и легочных альвеол [4]. Более 80% случаев рака легкого по гистологическому типу принадлежит к немелкоклеточному раку легкого (НМРЛ), эта группа включает в себя различные по своим молекулярно-биологическим особенностям и клиническому течению формы заболевания [2].
Наиболее распространенными гистологическими типам НМРЛ являются плоскоклеточный рак легкого и аденокарцинома (железистый рак легкого).
Плоскоклеточный рак легкого четко зависим от экзогенного фактора (курения), он составляет 40-50% всех случаев бронхогенного рака [1]. Плоскоклеточным раком легкого заболевают 44% мужчин и 25% женщин [12]. Аденокарцинома в меньшей степени зависит от курения [1,6], и чаще встречается у женщин. Аденокарцинома включает 28% случаев заболеваемости мужчин и 42% случаев заболеваемости женщин [12].
К одному из методов диагностики рака легкого относится оценка уровней различных белковых биомаркеров в крови. Однако до настоящего времени не найдено маркера, имеющего 100% чувствительность и специфичность [3]. При этом иногда у людей, не страдающих онкологическими заболеваниями, можно обнаружить такое количество биомаркеров, которое выявляется при онкозаболеваниях. Поэтому актуальной является проблема поиска новых биомаркеров. Для открытия и клинической проверки новых белковых маркеров используют методы масс-спектрометрии, иммуноферментные, иммуногистохимические и др. методы [9].
В качестве инструмента для поиска новых белковых маркеров могут использоваться аптамеры, синтетические однонитевые молекулы РНК или ДНК, имеющие высокое сродство к заданной мишени и высокую специфичность [2]. С помощью аптамеров, специфически связывающихся с
различными вне- и внутриклеточными белками раковых клеток можно находить потенциальные белковые биомаркеры рака, а затем идентифицировать их с помощью методов масс-спектрометрии.
Аптамеры, специфичные для опухолей различных типов обычно подбираются к рекомбинантным опухолевым белкам или к целым раковым клеткам, специально выращивающимся в клеточной культуре. К настоящему моменту аптамеры уже были подобраны к целым раковым клеткам некоторых гистологических типов рака легкого [7,11,13]. Однако аптамеры, подобранные к целым раковым клеткам являются специфичными только к поверхностным белкам раковых клеток и не могут связываться с внутриклеточными белками, тогда как именно внутриклеточные белки могут являться потенциальными белковыми маркерами рака легкого.
В ходе исследования впервые были подобраны аптамеры к опухолевым тканям нескольких гистологических типов рака легкого методом SELEX. Ткани измельчались для получения большего количества сайтов связывания для аптамеров, поэтому мишенями для подбора аптамеров являлись целые клетки, некротические клетки, продукты распада опухоли, высвобожденные белки и внутриклеточное содержимое. Полученные аптамеры были проверены на аффинность и специфичность связывания. Была предпринята попытка поиска новых белковых биомаркеров упомянутых гистологических типов рака легкого.
Цель работы - исследование аффинности и специфичности аптамеров, полученных в результате селекции к опухолевым клеткам плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы, поиск белковых биомаркеров с помощью пула наиболее аффинных аптамеров.
Материалы и методы
Аптамеры были подобраны к опухолевым тканям наиболее распространенных гистологических типов рака легкого человека с использованием технологии SELEX путем чередования позитивной и негативной селекции [6].
Позитивная селекция аптамеров проводилась к опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции онкологических больных с одобрения локального этического комитета Красноярского краевого клинического онкологического диспансера им. А.И. Крыжановского. Разрешение этического комитета на проведение исследований на базе «ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрав России» было получено 31.01.2012. Разрешение этического комитета на проведение исследований на базе ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России получено 31.01.2012 г. Негативная селекция проводилась к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей. Ткань измельчали с помощью скальпеля с целью увеличения количества сайтов для связывания аптамеров. Полученные в результате селекции аптамеры были клонированы, секвенированы и синтезированы.
Аффинность и специфичность искусственно синтезированных аптамеров к клеткам аденокарциномы и плоскоклеточного рака легкого определялась с помощью проточного цитометра Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США). Визуализация связывания аптамеров с опухолевыми и здоровыми клетками легкого оценивалась с помощью конфокального микроскопа Olympus Fluoview 10vi (Olympus Optical Co., Япония).
Для оценки аффинности аптамеров использовали клеточные культуры плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы. Для оценки специфичности аптамеров взяты клеточные культуры, выращенные из условно здоровых тканей легкого, прилегавших к опухолевым тканям плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы, забиравшихся при операции у онкологических больных.
Для выявления биомаркеров, специфичных для рака легкого человека, было проведено выделение комплексов аптамеров с белками опухолевых тканей легкого. Подготовка белковых проб - мишеней аптамеров была проведена на основе модифицированной методики поиска биомаркеров дендритных клеток [5].
Потенциальные биомаркеры рака легкого выделялись из опухолевых тканей и плазмы крови пациентов больных плоскоклеточным раком легкого и аденокарциномой с помощью аптамеров, обладающих наибольшей аффинностью к опухолевым клеткам легкого. Для подготовки ткани к выделению биомаркеров опухолевую ткань легкого инкубировали с дрожжевой РНК (1 мг/мл) для того, чтобы замаскировать неспецифические сайты связывания с олигонуклеотидами. Далее ткани инкубировали в 100нМ растворе пула аптамеров с биотиновой меткой на 5' конце в течение 60 мин при комнатной температуре на шейкере, для того чтобы обеспечить связывание аптамеров с тканями, клетками и белками.
К образцам добавляли магнитные частицы, покрытые стрептавидином и инкубировали в течение еще 30 мин, в результате чего биотин аптамеров связался со стрептавидином на магнитных частицах. С помощью магнита магнитные частицы с белками и аптамерами концентрировали на боковой поверхности пробирки, после чего удаляли надосадочную жидкость. К осадку добавляли 0,1% ДОХ-№2 в DPBS-буфере и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После лизиса с помощью магнита вновь концентрировали магнитные частицы с аптамерами и белками на боковой поверхности пробирки, удаляли детергент и промывали DPBS-буфером.
Осадок с магнитными частицами разводили свежеприготовленной 8М мочевиной и инкубировали 60 мин. Магнитные частицы концентрировали с помощью магнита на боковой поверхности пробирки и собирали надосадочную жидкость, содержащую белки - кандидаты в биомаркеры.
В результате проведенных процедур с помощью аптамеров были выделены белки, специфичные для рака легкого человека. Конечные концентрации белков в пробах были определены с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo-Scientific, USA). До масс-спектрометрических анализов пробы хранились при температуре 80 °С.
Для пробоподготовки, необходимой для масс-спектрометрического анализа, в пробирку объемом 200 мкл отбирались пробы в количестве 1 -4 мкг (1-10 мкл в зависимости от концентрации белка). Объем пробы доводили до 25 мкл путем добавления 50 мМ раствора бикарбоната аммония. Для восстановления дисульфидных связей в пробирку добавляли 1,5 мкл 100 мМ раствора дитиотреитола и инкубировали в течение 5 минут при температуре 95°С. Для алкилирования тиоловых групп цистеиновых остатков в пробирку после остывания добавляли 3 мкл 100 мМ раствора иодоацетамида и инкубировали в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого в пробирку добавляли 1 мкл раствора трипсина в концентрации 100 нг/мкл и инкубировали в течение 3 часов при температуре 370С. Затем добавляли еще 1 мкл раствора трипсина и инкубировали в течение 16 часов при той же температуре. Конечное соотношение трипсина к белку рассчитывалось в пропорции не менее 1:20. После трипсинизации белки подвергались очистке с помощью пипеточных наконечников Pierce C18 Tips объемом 10 мкл по протоколу, прилагаемому производителем наконечников (www.thermoscientific.com/pierce). В качестве растворителя-элюента использовали 50% раствор метанола с 0,1% содержанием муравьиной кислоты для экспериментов с ионизацией электроспреем и 95% раствор ацетонитрила с 0,1% содержанием трифтороуксусной кислоты для ионизации MALDI.
Эксперименты по идентификации белков-мишеней аптамеров к опухолевой ткани легкого человека проводили на квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре с ионизацией электроспреем Waters Synapt G2 HDMS (США) и времяпролетном масс-спектрометре с ионизацией MALDI Bruker Autoflex III (Г ермания).
Результаты и обсуждение
В результате клонирования и секвенирования было получено 30 уникальных последовательностей аптамеров, специфичных к опухолевым тканям легкого. Из них были выбраны 10 наиболее стабильных
последовательностей аптамеров с помощью программного обеспечения OligoAnalyser 3.1. Было синтезировано 10 последовательностей, имеющих длину 80 нуклеотидов (вариабельная часть 40 нуклеотидов, два праймера по 20 нуклеотидов с обоих концов цепочки). Дополнительно было синтезировано 3 последовательности длиной 60 нуклеотидов (вариабельная часть 40 нуклеотидов, один праймер 20 нуклеотидов с одной из сторон), вариабельные части которых совпадали с некоторыми из полноразмерных аптамеров.
Всего было синтезировано 13 последовательностей аптамеров.
Аффинность аптамеров к опухолевым клеткам рака легкого и клеткам, выделенным из условно здоровой, прилегающей к опухолевой, ткани легкого, представлена на рис. 1,2.
Результаты проточной цитометрии, представленные на рис.1,2 показали, что разные последовательности аптамеров проявляли разную степень аффинности к опухолевым клеткам легкого. При этом аффинность аптамеров к опухолевым клеткам аденокарциномы (рис.2) была существенно выше, чем к клеткам плоскоклеточного рака легкого (рис.1). И, кроме того, аптамеры обладали способностью связываться с клетками, выделенными из условно здоровой ткани легкого, хотя их связывание с клетками из этих тканей было намного хуже. Причем те клоны, которые лучше всего связывались с клетками аденокарциномы проявляли меньшую степень аффинности к клеткам плоскоклеточного рака легкого, например, последовательности 17_80, 2114_80.
Связывание аптамеров с клетками условно здоровой ткани легкого можно объяснить тем, что в ней могут присутствовать клетки, частично подвергшиеся трансформации. Для проверки такого предположения мы исследовали связывание аптамеров с клетками из опухолевой и здоровой тканей легкого с помощью конфокального микроскопа Olympus Fluoview 10vi. Исследование показало, что практически все клетки плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы связывались с аптамерами, в результате чего
возникала их флуоресценция. Кроме того, видно, что по степени связывания аптамеров с опухолевыми клетками наблюдались некоторые различия между отдельными клонами наблюдались (рис.3, 4). В то же время с клетками, выделенными из условно здоровой ткани легкого, аптамеры практически не связывались (рис.5). Однако среди этих клеток присутствовал некоторое количество типично опухолевых клеток, связывающихся с аптамерами (рис.5).
Для идентификации белков, с которыми могли связываться аптамеры и которые могли стать кандидатами в биомаркеры плоскоклеточного рака и аденокарциномы, было проведено масс-спектрометрическое исследование белковых проб. Белки были выделены из тканей больных аденокарциномой и плоскоклеточного рака легкого с помощью пула наиболее аффинных и специфичных аптамеров.
На рис. 6,7 представлены типичные масс-спектры белков, выделенных из опухолевой ткани и плазмы крови больных раком легкого.
Предварительный масс-спектрометрический анализ белков, выделенных из опухолевой ткани, показал присутствие в пробах различных гомологов Zinc finger protein; Keratin, type II cytoskeletal; Serine/threonine-protein kinase; Chromodomain-helicase-DNA-binding protein; Actin, cytoplasmic; Coiled-coil domain-containing protein; Leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase.
Образцы белков, выделенные из плазмы крови онкобольных, содержали разные гомологи Zinc finger protein; ATPase family AAA domain-containing protein; Ankyrin repeat protein; Serine/threonine-protein kinase; Keratin, type II cytoskeletal; Chromodomain-helicase-DNA-binding protein; RNA-binding motif protein; Coiled-coil domain-containing protein.
Общими белками для плазмы крови и опухолевых тканей стали 4 типа белков - различные гомологи Zinc finger protein; Keratin, type II cytoskeletal; Serine/threonine-protein kinase; и Coiled-coil domain-containing protein.
Для оценки значимости белков при рассмотрении их в качестве кандидатов в биомаркеры были проанализированы их функции, локализация в клетке и распределение в тканях.
Функция наиболее часто встречающихся аналогов белка Zinc finger protein, характерного для большинства тканей и локализованного в ядре, заключается в регуляции процессов транскрипции. При некоторых видах рака встречаются различные модификации этого белка, которые возможно выявить с использованием масс-спектрометров более высокого разрешения. RAF - serine/threonine protein kinase, также характерная для большинства тканей и локализованная в клеточной мембране и цитозоле, является центральным регулятором клеточного метаболизма, роста и выживаемости клеток, кроме того, представляет собой мишень для гормонов и факторов роста. Мутации этого белка встречаются при 15-30% различных онкологических заболеваний и играют роль в образовании метастазов при раке легкого. Белки, содержащие Coiled-coil domain-containing protein. присутствуют во всех тканях, в том числе, и раковой ткани легкого, локализованы в цитозоле и участвуют в организации цитоскелета, помимо этого, являются негативными регуляторами секреции. Keratin, type II cytoskeletal блокирует интерферон-зависимую интерфазу и стимулирует синтез ДНК, взаимодействует с транскрипционным факторами EIF3 S10 и HPV16 E7. Экспрессируется в эпидермальных, бронхиальных и мезотелиальных клетках и локализован в цитоплазме.
В целом, анализ показал, что с помощью аптамеров к раку легкого человека возможно определение биомаркеров этого заболевания, выявлены вероятные кандидаты в биомаркеры рака легкого человека. Наши предварительные данные, необходимы для подтверждения возможности использования разработанной нами методики идентификации белковых мишеней аптамеров к раку легкого, и показывают необходимость более детальных исследований на приборах более высокого разрешения. Основная функция выявленных белков-мишеней связана с их способностью
регулировать процессы транскрипции, репликации, клеточного цикла и, кроме того, обеспечивать перестройку цитоскелета. Кандидатами в онкомаркеры являются как внутриклеточные, так и внеклеточные белки. Это подтверждает способность полученных аптамеров связываться с белками любой локализации, что повышает вероятность выбора белка, являющегося специфичным биомаркером для конкретного типа рака.
Таким образом, было показано, что с помощью аптамеров, специфичных к опухолевым тканям, можно выделять белки - потенциальные биомеркеры рака из опухолевых тканей и плазмы крови больных.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ФЦП №16.512.11.2090 и КГАУ «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности», дополнительное соглашение № 09/12.
THE DEVELOPMENT OF BIOMARKERS IDENTIFICATION TECHNOLOGY WITH THE HELP OF APTAMERS ON THE EXAMPLE OF SQUAMOUS LUNG CANCER AND ADENOCARCINOMA
Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky
Abstract. It was developed the technology of search and identification of biomarkers using aptamers selected to tumor tissues. As the objects of the study were selected the tissues of squamous lung cancer and adenocarcinoma. It is shown that by using the obtained aptamers it is possible to search both extracellular and intracellular proteins - the candidates to biomarkers.
Key words: biomarkers, lung cancer, aptamers.
Литература
1. Акопов А. Современные подходы к классификации рака легкого
// Врач. - 2011. - Т. 12. - С.7-12.
2. Артамонова Е.В.. Основные достижения в биологии, скрининге, диагностике и лечении немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) // Практическая онкология. - 2011. -Т. 12, №1. - С. 26-35.
3. Сергеева Н.С., Маршутина Н.В. Общие представления осерологическихбиомаркерах и их месте в онкологии // Практическая онкология. - 2011. - Т.12, №4. - С. 147-154.
4. Трахтенберг А.Х, Колбанов К.И. Рак Легкого. Атмосфера // Пульмонология и аллергология. - 2008. - №.4. - С. 3-9.
5. Berezovsky M., Lechmann M., Musheev M. et al. Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery (AptaBID) // J. Am. Chem. Soc. - 2008. - №130. - P.9137-9143.
6. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature. - 1990. -Vol. 346. -P.818-822.
7. Chen H.W., Medley C.D., et al. Molecular Recognition of Small-Cell Lung Cancer Cells Using Aptamers // Chem. Med. Chem. -2008. -№3. - Р.991-1001.
8. Soontornworajit B., Wang Y. Nucleic acid aptamers for clinical diagnosis: cell detection and molecular imaging // Anal. Bioanal. Chem. -2011. - №399. - Р.1591-1599.
9. Sung H. J., Cho J. Y. Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics // BMBRep. - 2008. - Vol. 41. - Р. 615625.
10. Sunil K.A., Shekhar B. Lung Cancer and Its Early Detection Using Biomarker-Based Biosensors // Chem. Rev. - 2011. - Vol.111. - Р. 6783-6809.
11. Takao K., Shun-ichiro O., Masayasu M., Eiry K. Selection of DNA aptamers recognizing small cell lung cancer using living cell-SELEX // Analyst. - 2011. - №136. -Р.1310-1312.
12. Travis W. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart, World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, International Association for the Study of Lung Cancer, International Academy of Pathology (Eds), IARC Press, Oxford University Press, Lyon Oxford. - 2004. - Р.12.
13. Zilong Z., Li X., Xiaoli S., Weihong T. et al. Recognition of subtype non-small cell lung cancer by DNA aptamers selected from living cells // The Royal Society of Chemistry. Analyst - 2009. - №134. -Р. 1808-1814.
Сведения об авторах
Замай Галина Сергеевна - аспирант кафедра биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ; e-mail: zamay_galina@mail.ru.
Коловская Ольга Сергеевна - аспирант кафедры биохимии, Сибирский федеральный университет; e-mail: zamaykin@mail. ru.
Г лазырин Юрий Евгеньевич - научный сотрудник, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии; тел. 8(391)2280769.
Крат Алексей Васильевич - врач торакальный хирург, онколог, Красноярский краевой онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского; тел. +7(913)539-50-54.
Замай Анна Сергеевна - к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ ; e-mail: annazamay@yandex.ru.
Малышева Елена Александровна - аспирант каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ; тел. +7(950)9741353.
Савицкая Анна Геннадьевна - научный сотрудник НИИ Молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ; e-mail: sanna3061 @gmail.com.
Салмина Алла Борисовна - д.м.н., проф., зав. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ; e-mail: allasalmina@mail.ru.
Оседко Алексей Владимирович - аспирант ЦНИЛ КрасГМУ ; e-mail: alizz@yandex.ru.
Котловский Юрий Васильевич - д.м.н., проф., зав. ЦНИЛ; -mail: office@krascnil.ru.
Попов Дмитрий Владимирович - зам. главного врача по организационнометодической работе, Красноярский краевой онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского; e-mail: popov.kkkod@yandex.ru.
Модестов Андрей Арсеньевич - гл. врач, Красноярский краевой онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского; e-mail: andremo@yandex.ru.
Замай Татьяна Николаевна - д.б.н., проф. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ ; e-mail: tzamay@yandex.ru.
