CC BY
8МЕТИЛИРОВАНИЕ ГЕНОВ МИКРОРНК ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ПОЧКИ;
СВЯЗЬ С ПРОГРЕССИЕЙ РАКА
Хоконова Валерия Валерьевна
студент -стажер, ФГБНУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии,
г. Москва
Бурденный Алексей Михайлович
кандидат биол. наук, старший научный сотрудник, ФГБНУ Научно-исследовательский институт общей
патологии и патофизиологии, г. Москва Пронина Ирина Валерьевна
кандидат биол. наук, научный сотрудник ФГБНУ Медико-генетический научный центр, г. Москва
Логинов Виталий Игоревич
кандидат биол. наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ Научно-исследовательский институт общей
патологии и патофизиологии, г. Москва
MIRNA GENE METHYLATION OF RCC SAMPLES AND CANCER PROGRESSION Khokonova Valeria, student, The Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow Burdennyy Aleksey, Candidate of Biological Science, senior researcher, The Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow
Pronina Irina, Candidate of Biological Science, researcher, Research Centre of Medical Genetics, Moscow
Loginov Vitaliy, Candidate of Biological Science, leading researcher, The Institute of General Pathology and Pathophysiology,
Moscow
АННОТАЦИЯ
В данной работе методом метил-специфичной ПЦР исследовано метилирование 10 генов микроРНК (miR-9-1/-3, miR-124a-1/-2/-3, miR-34b/c, miR-137, miR-129-2, miR-203, miR-191) в образцах опухолей и гистологически нормальной ткани почки пациентов с скПКР. Метилирование CpG-островков miR-129-2, miR-191, miR-137, miR-124а-1/2/3 исследовано в первичных опухолях почки впервые. Показано, что при скПКР частоты метилирования miR-9-1/-3, miR-34b/c, miR-124a-1/-2/-3, miR-129-2 и miR-137 в опухолях достигают 39-69%, что значимо выше, чем в образцах гистологически нормальной ткани (p<0,05 по Фишеру).
Ключевые слова: микроРНК; метилирование ДНК; CpG-островки; светлоклеточный рак почки (скПКР). ABSTRACT
Methylation of 10 genes miRNA (miR-9-1/-3, miR-124a-1/-2/-3, miR-34b/c, miR-137, miR-129-2, miR-203, miR-191) was investigated in tumor and histologically normal kidney tissue of patients with RCC using methyl-specific PCR. Methylation of CpG-islands of miR-129-2, miR-191, miR-137, miR-124а-1/2/3 was studied in primary tumors of the kidney for the first time. It is shown that methylation frequency of miR-9-1/-3, miR-34b/c, miR-124a-1/-2/-3, miR-129-2 and miR-137 in RCC tumors can reach 39-69%, which is significantly higher (p<0,05 Fischer) than in histologically normal tissue. Key words: miRNA; DNA methylation; CpG-island; renal cell carcinoma (RCC)
Введение.
В мировой структуре злокачественных заболеваний рак почки занимает около 2%. В мире ежегодно заболевает и погибает от почечно-клеточного рака приблизительно 250 тыс. и 100 тыс. человек соответственно. Наибольшая заболеваемость отмечается в развитых странах Европы и Северной Америки [3]. Самым распространенным гистологическим типом рака почки (~80%) является светлоклеточный почечноклеточный рак (скПКР), который характеризуется многочисленными генетическими и эпигенетическими нарушениями в генах микроРНК и бе-лок-кодирующих генах [8], что в совокупности приводит к формированию фенотипа трансформированной клетки [10].
МикроРНК являются классом малых некодирую-щих РНК длиной 19-24 нуклеотида и выполняющих функцию посттранскрипционного регулятора экспрессии бе-локкодирующих генов-мишеней [1,2]. Показана важная роль экспрессии генов микроРНК в процессах злокачественной трансформации, а также в развитии диабетической нефропатии, остром повреждении почек, полики-
стозе почек и пр. [7]. В регуляции экспрессии генов микроРНК важную роль играет метилирование их промотор-ных CpG-островков [16]. Следует отметить, что это событие является более характерным эпигенетическим механизмом подавления экспрессии, чем для белок-кодирую-щих генов [14].
Материалы и методы.
Исследование проводилось с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288). Диагноз и гистологическая форма светлоклеточного по-чечноклеточного рака (скПКР) устанавливались на основании гистологического исследования в НИИ КО РОНЦ РАМН, г. Москвы. Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Выборка включала 36 парных (опухоль/прилежащая гистологически нормальная ткань) образцов, а также 17 образцов ткани почки от доноров, без выявленных онкопатологий в анамнезе, которые были получены в патологоанатомическом отделе НИИ Скорой Помощи им.
Склифосовского. Образцы тканей хранили в жидком азоте. ДНК из ткани выделяли с помощью фенол-хлоро-форменной экстракции. Бисульфитную конверсию и ме-тилспецифичную ПЦР (МС-ПЦР) проводили по методу [12]. МС-ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 67мМ Трис-HCl, рН 8.8, 16,7мМ (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20; 1,5мМ MgCl2, 0.25мМ каждого dNTP; 1020 нг ДНК; 25 пмолей каждого праймера; 0,5 ед. Hot Start Taq ДНК полимеразы (СибЭнзим, Новосибирск). Прай-меры и условия ПЦР взяты из работ других авторов [4-6, 17].
В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования использовали конвертированную ДНК клеточной линии фибробластов человека L-68, обработанную мети-лтрансферазой SssI («СибЭнзим», Новосибирск). Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2% ага-розном геле, либо в 10% полиакриламидном геле.
Статистический анализ проводили с применением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0.05. Расчеты проводили в системе для статистического анализа данных STATISTICA 6.1 RUS.
Результаты.
Частоты метилирования 10 генов миРНК при скПКР. Метилирование CpG-островков десяти генов микроРНК (т1^9-1/-3, т1^34Ь/е, т1^124а-1/2/3, т1^137, т1^129-2, т1^191, т1^203) было изучено в 36 случаях скПКР и 17 доноров без онкопатологии в анамнезе методом МС-ПЦР. Данные табл. 1 характеризуют профиль метилирования исследованной группы генов микроРНК при скПКР. Нами впервые показана высокая частота (от 39 до 69% случаев) метилирования для 8 генов микроРНК и снижение частоты метилирования промоторного района гена miR-191 в 5 раз в опухоли, по сравнению с гистологически нормальной прилежащей тканью. Статистически значимые различия (р<0,05 по Фишеру) между частотами метилирования в образцах опухолей скПКР и доноров установлены у 9-ти генов: miR-9-1/-3, т1^34Ь/с, т1^124а-1/-2/-3, 191, т1^137, т1^129-2. Причем, среди этих 9 генов данные по метилированию трех генов (miR-124a-1, т1^137, т1^191) в первичных опухолях почки получены впервые. Можно предполагать, что изменения в метилировании этих генов относятся к ранним событиям в патогенезе скПКР и эти данные можно использовать для ранней диагностики опухолей почки.
Таблица 1
Частота метилирования генов микро-РНК в ДНК выделенной из опухолевой и гистологически нормальной
ткани для светлоклеточного рака почки.
№ Название микроРНК Локализация Р = * Опухоль Норма Донор**
1 miR-191 3p21.31 3,65x10-9 4/36, 11% 18/36, 50%% 17/17, 100%%
2 miR-203 14q32.33 0,4691 15/36, 42%% 11/36, 30%% 8/17, 47%%
3 miR-9-1 1q22 0,0071 14/36, 39%% 3/36, 8%% 3/17, 18%%
4 miR-9-3 15q26.1 4,14x10-5 20/36, 55%% 3/36, 8%% 4/17, 23%%
5 miR-34b/c 11q23.1 1,26x10-8 25/36, 69%% 3/36, 8%% 2/17, 12%%
6 miR-129-2 11p11.2 4,76x10-5 16/36, 44%% 1/36, 2%% 3/17, 18%%
7 miR-124a-1 8p23.1 0,0003 19/36, 53%% 4/36, 11%% 3/17, 18%%
8 miR-124a-2 8q12.3 0,0003 21/36, 58%% 10/36, 28%% 1/17, 6%%
9 miR-124a-3 20q13.33 0,0004 16/36, 44%% 2/36, 5%% 4/17, 23%%
10 miR-137 1p21.3 6,98x10-6 20/36, 55%% 2/36, 5%% 5/17, 29%%
* Р - достоверность различия частоты метилирования гена микроРНК в ДНК опухоли и условно нормальной ткани того же пациента; рассчитана по Фишеру.
** Доноры - образцы ДНК ткани почки от 17скончавшихся человек без онкопатологии по данным анамнеза.
Связь с прогрессией заболевания скПКР. Исследованы возможные корреляции между частотами метилирования генов и размером опухоли (T3/T4 против T1/T2), клинической стадией (III/IV против I/II), степенью диффе-ренцировки (ld против md/hd) и метастазированием (N1-2/М1 против N0/M0) при скПКР. Статистически значимые корреляции представлены на рисунке 1. Так, установлены значимые корреляции (P<0,05, по Фишеру) частоты метилирования генов miR-9-1, miR-129-2, miR-137 со стадией скПКР, miR-129-2 со степенью дифференцировки опухоли, генов miR-9-1, miR-34b/c, miR-137 с увеличением размера опухоли и генов miR-203, miR-9-3, miR-129-2 с наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Значимые корреляции частот метилирования генов miR-124a-1/2/3, miR-129-2, miR-137 с прогрессией скПКР показаны нами впервые.
Обсуждение.
Профили метилирования группы генов микроРНК в опухолях почки, связь с прогрессией рака.
В настоящей работе охарактеризован профиль метилирования 10 генов
микроРНК при скПКР, показано значимое повышение частоты метилирования этих генов в опухолях почки и
максимальные частоты метилирования отмечены у генов miR-34b/c (69%), 1^-124а-2 (58%), 1^-9-3 (55%) и 1^-137 (55%). Причем ранее в литературе не было сообщений, касающихся метилирования генов miR-124a-1, miR-137 и miR-191 в опухолях почки.
Для многих генов-супрессоров опухолевого роста свойственно метилирование промоторных областей в опухолях, что ассоциировано с подавлением экспрессии гена. Высокая частота метилирования наряду с другими тестами была использована в качестве аргумента при отнесении ряда белок-кодирующих генов (например, генов RASSF1A и БЕМД3В) к классу супрессоров опухолей [9, 15]. Таким образом, можно предположить, что восемь генов микроРНК (miR-124a-1/-2/-3, miR-9-1/-3, miR-34b/c, miR-129-2, miR-137), для которых нами показано метилирование с высокой частотой при скПКР, также выполняют функции супрессоров. В то же время нами было показано, частота метилирования гена miR-191 статистически значимо снижалась со 100% в ткани доноров без онкопатоло-гий в анамназе до 11% в опухолевой ткани (р=3,65х10-9) пациентов с скПКР, что указывает на онкогенные свойства исследованной микроРНК.
Для скПКР показано изменение уровней экспрессии ряда генов микроРНК при метастазировании и высказано предположение о возможностях применения этих тестов для прогноза первичных опухолей и предсказания возникновения метастазов [11].
В настоящей работе с использованием представительной выборки образцов (36 случаев скПКР) установ-
лена связь метилирования исследованных генов микроРНК с размером опухоли почки (miR-34b/c, miR-9-1 и miR-137), с клиническими стадиями (miR-9-1 miR-129-2 и miR-137), с потерей дифференцировки (miR-129-2) и появлением метастазов в регионарных лимфоузлах или других органах (miR-203, miR-9-3 и miR-129-2). Ранее в литературе имелись данные о связи метилирования с метастазирова-нием при скПКР только для гена микроРНК miR-9-3 [13].
128-2 Степень диффер-ки
Рисунок 1. Корреляция частоты метилирования генов микроРНК с параметрами прогрессии скПКР - клинической стадией рака, степенью дифференцировки, размером опухоли (Т1+Т2/Т3+Т4) и метастазированием в региональные лимфоузлы и другие органы. Достоверность рассчитана по Фишеру (Р<0,05).
Таким образом, в настоящей работе для шести из 10 генов (miR-34b/c, miR-203, miR-9-3, miR-9-1, miR-129-2 и miR-137) выявлена связь частоты метилирования с какими-либо признаками опухолевой прогрессии скПКР и впервые показана значимая связь с прогрессией рака почки для гена miR-129-2, причем с тремя параметрами (стадия, степень дифференцировки и метастазирование). Итак, наши новые данные о гиперметилировании группы генов микроРНК при скПКР, о связи метилирования этих генов с прогрессией первичных опухолей и метастазированием, а также данные литературы о подавлении их экспрессии и способности к негативной регуляции мишеней, относящихся к классу онкогенов, согласуются с предположением о супрессорной функции исследованных генов микроРНК. Кроме того, полученные в настоящей работе результаты могут найти применение при отборе новых молекулярно-генетических маркеров скПКР.
Работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований - 13-04-00828а.
Список литературы
1. Катохин А.В., Кузнецова Т.Н., Омельянчук Н.А. МиРНК - новые регуляторы активности генов у эукариот // Вестник В0ГиС.-2006. - T. 10. - C. 241272.
2. Макарова Ю.А., Крамеров Д.А. Некодирующие РНК // Биохимия. - 2007. - T. 72. - C. 1427-1448.
3. Онкоурология. Национальное руководство. // Ред. Чиссов В.И., Алексеева Б.Я., Русакова И.Г. М.: Гэотар-Медиа. - 2012. -С. 325
4. Рыков С.В., Ходырев Д.С., Береснева Е.В. и др. Профили метилирования группы генов микроРНК в опухолях легкого, почки и толстой кишки // Медицинская генетика. - 2012. - Т. 11. - № 8. - С. 2631.
5. Ando T., Yoshida T., Enomoto S. et al. DNA methylation of microRNA genes in gastric mucosae of gastric cancer patients: its possible involvement in the formation of epigenetic field defect. // Int. J. Cancer. - 2009. - V. 124. - P. 2367-2374.
6. Balaguer F., Link A., Lozano J.J. et al. Epigenetic
silencing of miR-137 is an early event in colorectal carcinogenesis // Cancer Res. - 2010. - V. 70. - P. 66096618.
7. Bhatt K., Mi Q.S., Dong Z. MicroRNAs in kidneys: biogenesis, regulation, and pathophysiological roles. // Am J Physiol Renal Physiol. - 2011. - V. 300. - P. F602-610.
8. Cairns P. Renal cell carcinoma. // Cancer Biomark. -2010. - V. 9. - №1-6. - P. 461-473.
9. Dreijerink K., Braga E., Kuzmin I. et al. The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumorigenesis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2001. - V. 98. - № 13. - P. 7504-7509.
10. Godfrey K.M., Lillycrop K.A., Burdge G.C. et al. Epigenetic mechanisms and the mismatch concept of the developmental origins of health and disease // Pediatr. Res. - 2007. - V. 61. - P. 5R-10R.
11. Heinzelmann J., Henning B., Sanjmyatav J. et al. Specific miRNA signatures are associated with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma // World J. Urol. - 2011. - V. 29. - № 3. - P. 367-373.
12. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S. et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1996. - V. 93. - № 18. - P. 9821-9826.
13. Hildebrandt M.A., Gu J., Lin J. et al. Hsa-miR-9 met-hylation status is associated with cancer development and metastatic recurrence in patients with clear cell renal cell carcinoma // Oncogene. - 2010. - V. 29. - № 42. - P. 5724-5728.
14. Kunej T., Godnic I., Ferdin J., et al. Epigenetic regulation of microRNAs in cancer: an integrated review of literature // Mutat. Res. - 2011. - V.717. - P.77-84.
15. Loginov V.I., Dmitriev A.A., Senchenko V.N. et al. Tumor Suppressor Function of the SEMA3B Gene in Human Lung and Renal Cancers. // PLoS One. - 2015. -V. 10. - e0123369.
16. Lopez-Serra P., Esteller M. DNA methylation-asso-ciated silencing of tumor-suppressor microRNAs in cancer. // Oncogene. - 2012. - V. 31. - P. 1609-1622.
17. Lujambio A., Calin G.A., Villanueva A. et al. MicroRNA
DNA methylation signature for human cancer metastasis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2008. - V. 105. -P.13556-1356.
МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРАТОВ В РАСТЕНИЯХ ПЕКИНСКОЙ
КАПУСТЫ (BRASSICA PEKINENSIS SKEELS)
Дёмин Вадим Александрович
доктор с.-х. наук, профессор, Российский государственный аграрный университет - МСХА имени
К.А. Тимирязева, г. Москва Родионов Владимир Александрович кандидат с.-х. наук, научный сотрудник, Российский государственный аграрный университет - МСХА
имени К.А. Тимирязева, Институт физиологии растений РАН, г. Москва
MODIFICATION OF THE METHOD OF DEFINITION OF NITRATES IN PLANTS OF THE NAPA CABBAGE (BRASSICA PEKINENSIS SKEELS)
Demin Vadim, Doctor of Science, professor Russian Timiryazev, State Agrarian University, Moscow, Rodionov Vladimir Candidate of Science, research associate, Russian Timiryazev State Agrarian University, Timiryazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, Moscow АННОТАЦИЯ
Показана сравнительно простая методика определения нитратов в пекинской капусте (общепринятая, но с фильтрованием смеси через простой складчатый фильтр). ABSTRACT
Rather simple technique of definition of nitrates in napa cabbage is shown (standard, but with filtering of mix via the simple folded filter).
Ключевые слова: нитраты, методика, ионоселективный электрод, пекинская капуста. Keywords: nitrates, method, ion-selective electrode, napa cabbage.
В Межгосударственном стандарте ГОСТ 29270-95 [2, 218-222] и руководстве по эксплуатации приборов по определению нитратов ионоселективным электродом [1] отмечается особая методика по пробоподготовке для определения нитратов в растительной продукции семейства крестоцветных. Указывается, что в экстрагирующий раствор необходимо добавлять перманганат калия с под-кислением экстракта серной кислотой. Мы разработали более простую методику определения нитратов в пекинской капусте путём распространения на неё общепринятой, для большинства культур, методики, усовершенствовав её фильтрованием. Общепринятая для большинства культур методика заключается в следующем: в 10,0 г мезги, полученной при измельчении растительного материала, добавляли 50 мл экстрагирующего раствора (1% раствора алюмокалиевых квасцов) и перемешивали стеклянной палочкой 3 минуты [3, 182-190; 4, 388-394]. При определении нитратов в капусте этой методикой электрод быстро выходил из строя.
В ходе работы по определению нитратов в пекинской капусте нами сравнивались различные методики пробоподготовки при определении нитратов ионоселективным электродом. Полученные результаты статистически обработали одно- и двухфакторным дисперсионным анализом.
Методика
В качестве объекта исследований были взяты средние пробы из кочанов пекинской капусты гибрида Ника. Средние пробы выбраны с двух вариантов (вариант 1 - без удобрений, вариант 4 - 120^ внесённого под пекинскую капусту в качестве основного удобрения). Из средней
пробы брали по 4 навески массой 10,0 г для каждой методики. Из навески после измельчения в ступке до состояния мезги (гомогенизации) делали вытяжку (экстракт) тремя различными способами:
А В 10,0 г мезги добавляли 50 мл экстрагирующего раствора (1% раствора алюмокалиевых квасцов). Затем перемешивали стеклянной палочкой 3 минуты и фильтровали через простой складчатый бумажный фильтр. Фильтрат использовался в качестве вытяжки для определения нитратов. Это предложенная нами модификация общепринятой методики [3, 182-190; 4, 388-394] (предложено фильтрование).
Б В 10,0 г мезги добавляли 50 мл экстрагирующего раствора, приготовленного следующим образом: 10,0 г алюмокалиевых квасцов + 1,0 г перманганата калия + 0,6 мл концентрированной серной кислоты (пл. 1,84) растворили в мерной колбе на 1 л дистиллированной водой. Затем перемешивали стеклянной палочкой 3 минуты и фильтровали через простой складчатый бумажный фильтр. В фильтрате определялись нитраты ионоселективным электродом. Это существующая методика для крестоцветных [1; 2, 218-222], но мы дополнили её фильтрованием.
В В 10,0 г мезги добавляли 50 мл экстрагирующего раствора (10,0 г алюмокалиевых квасцов + 1,00 г перманганата калия + 0,6 мл концентрированной серной кислоты (пл. 1,84) + дистиллированная вода в мерной колбе на 1 л). Затем перемешивали стеклянной палочкой 3 минуты. Экстракт (без фильтрации) использовался в качестве вытяжки для определения нитратов ионоселективным электродом. Это существующая методика для крестоцветных без изменения [1; 2, 218-222].
