CC BY
32
DOI: 10.17650/1726-9784-2021-22-1-52-61
c«d:
Метилирование гена SNRPN у мужчин с бесплодием при отсутствии мутаций в известных генах-кандидатах снижения фертильности
BY 4.0
Д.С. Михайленко1' 2, О.А. Симонова1, И. Аль-Акел3, И.Ю. Соболь3, Т.А. Едоян4, Е.А. Ефремов3, Е.Б. Кузнецова2, М.В. Немцова1, 2
ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова»; Россия, 115522 Москва, ул. Москворечье, 1; 2ФГАОУВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); Россия, 119991 Москва, ул. Трубецкая, 8;
3Научно-исследовательский институт урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина —
филиал ФГБУ«НМИЦ радиологии» Минздрава России; Россия, 105425 Москва, ул. 3-я Парковая, 51, стр. 1;
ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России;
Россия, 117997Москва, ул. Островитянова, 1
Е га Е
Контакты: Дмитрий Сергеевич Михайленко dimserg@mail.ru
Введение. Бесплодие у мужчин представляет собой актуальную проблему современной андрологии и встречается в 45 % бесплодных браков. Часть случаев бесплодия у мужчин обусловлена генетическими причинами: точковыми мутациями при ряде моногенных заболеваний, делециями локуса AZF или сочетанием мутаций CFTR; сниженная фертильность ассоциирована также с полиморфными вариантами генов AR и GSTT1/GSTM1. Вместе с тем публикуют все больше данных о роли эпигенетических механизмов в виде аберрантного метилирования и нарушения импринтинга в патологии сперматогенеза.
Материалы и методы. В настоящей работе нами исследованы 49 образцов ДНК, полученных из образцов спермы неродственных мужчин с бесплодием, с помощью полимеразной цепной реакции, фрагментного анализа и секвенирования.
Результаты. Из первоначальной когорты исключены 5 пациентов: 1 - с длиной повтора 29 (CAG) в экзоне 1 AR, 3 - с нулевыми генотипами по генам GSTT1 и GSTM1, 1 - компаунд гетерозигота delF508/5T по гену CFTR. После этого с помощью метилспецифической полимеразной цепной реакции и бисульфитного секвенирования было определено метилирование импринтированного гена SNRPN. Показано, что аберрантное метилирование SNRPN встречается в 11,4 % случаев мужского бесплодия. Суммарно молекулярно-генетические и эпигенетические нарушения были выявлены у 20 % пациентов.
Заключение. Полученные данные демонстрируют значительную долю (эпи)генетических нарушений в гетерогенной выборке мужчин со сниженной фертильностью.
Ключевые слова: мужское бесплодие, метилирование ДНК, импринтинг, делеции AZF, мутации CFTR, полиморфизмы AR, GSTM1 и GSTT1, секвенирование, ПЦР
Для цитирования: Михайленко Д.С., Симонова О.А., Аль-Акел И. и др. Метилирование гена SNRPN у мужчин с бесплодием при отсутствии мутаций в известных генах-кандидатах снижения фертильности. Андрология и генитальная хирургия 2021;22(1):52-61. DOI: 10.17650/1726-9784-2021-22-1-52-61
Methylation of the SNRPN gene in infertile men without mutations in common candidate genes for reduced fertility
D.S. Mikhaylenko',2, O.A. Simonova1, I.ElAkel3, I.Yu. Sobol3, T.A. Edoyan4, E.A. Efremov3, E.B. Kuznetsova2, M.V. Nemtsova12
N.P. Bochkov Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow 115522, Russia;
2I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Ministry of Health of Russia; 8 Trubetskaya St., Moscow 119991, Russia;
3N.A. Lopatkin Scientific Research Institute of Urology and Interventional Radiology — branch of the National Medical Research Radiological Center, Ministry of Health of Russia; Bld. 1, 513rd Parkovaya St., Moscow 105425, Russia;
4N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovityanova St., Moscow 117997, Russia
Contacts: Dmitry Sergeevich Mikhaylenko dimserg@mail.ru
Introduction. Male infertility is a common problem in andrology and occurs in 45 % of infertile couples. Some cases of male infertility caused by genetic reasons: point mutations at some monogenic diseases, AZF deletions or a CFTR mutation compounds; reduced fertility is also associated with polymorphic variants of the genes AR and GSTT1/GSTM1. At the same time, increasing amount of data are being published about the role of epigenetic mechanisms (aberrant methylation and imprinting alterations) in defective spermatogenesis.
Materials and methods. We have studied 49 sperm samples obtained from unrelated infertile men using polymerase chain reaction, fragment analysis, and sequencing.
Results. Five patients were excluded from the initial cohort: one with a repeat length of 29 (CAG) in the first exon of the AR, three with null genotypes in the GSTT1 and GSTM1, and one with the delF508/5T heterozygous compound in the CFTR. Thereafter, methylation of the imprinted gene SNRPN was determined using methyl-specific polymerase chain reaction and bisulfite sequencing. Aberrant SNRPN methylation was detected in 11.4 % of male infertility samples. In total, molecular genetic and epigenetic alterations were determined in 20 % of patients. Conclusions. Obtained data demonstrate a significant proportion of (epi)genetic disorders in a heterogeneous cohort of men with reduced fertility.
Key words: male infertility, DNA methylation, imprinting, AZF deletions, CFTR mutations, polymorphisms of the AR, GSTM1 and GSTT1, sequencing, PCR
For citation: Mikhaylenko D.S., Simonova O.A., El Akel I. et al. Methylation of the SNRPN gene in infertile men without mutations in common candidate genes for reduced fertility. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2021;22(1):52-61. (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9784-2021-22-1-52-61
1ТОМ 22 / VOL. 22 2 0 2 1
Введение
Бесплодие у мужчин представляет собой актуальную проблему современной андрологии и встречается в той или иной форме в 45 % бесплодных браков [1]. При диагностике мужского бесплодия поэтапно исключают частые причины заболевания: травмы, варикоцеле, аномалии развития, системные заболевания, прием стероидов, инфекции мочеполовой системы, хронические стрессы, иммунологические нарушения и другие патологические изменения. Часть случаев бесплодия у мужчин обусловлена генетическими причинами в виде точковых мутаций, среди которых можно выделить как редкие моногенные заболевания (синдромы Кальмана, Картагенера и др.), так и более частые случаи азооспермии, обусловленные де-лециями локуса AZF (azoospermia factor) или сочетанием мутаций CFTR [2, 3].
Микроделеции Y-хромосомы, затрагивающие область AZF, могут включать субрегионы AZFa, b и/или c и приводить к утрате генов, участвующих в регуляции сперматогенеза. Одновременные делеции субрегионов AZFa, b или нескольких субрегионов становятся причиной азооспермии, частичные делеции субрегиона AZFc могут привести к олигозооспермии [4]. Ген CFTR кодирует трансмембранный регулятор проводимости, который участвует в транспорте ионов хлора через плазматическую мембрану и формировании секрета эпителиальных клеток. Компаунд-гетерозиготы по тяжелой и мягкой мутациям CFTR имеют измененную концентрацию ионов хлора и электролитов, повышенную вязкость секрета в мелких протоках желез внешней секреции, что ассоциировано с агенезией семявыно-сящих протоков (congenital bilateral absence of the vas deferens, CBAVD) [5].
Наряду с точковыми мутациями ряд авторов выделяют в качестве возможных причин бесплодия у мужчин неблагоприятные аллели полиморфизмов гена андрогенового рецептора (ЛК) и генов семейства глу-татионтрансфераз. Андрогены играют важную роль в сперматогенезе, реализуя свое действие через андро-геновый рецептор. В экзоне 1 гена ЛЯ расположен полиморфный CAG-повтор, соответствующий полиглу-таминовому тракту вариабельной длины. Длина повтора обратно пропорциональна способности рецептора активировать транскрипцию генов-мишеней, что может иметь значение в патогенезе бесплодия у носителей длинных аллелей [6]. Гены GSTM1 и GSTT1 кодируют глутатионтрансферазы — ферменты, которые участвуют в детоксикации ксенобиотиков и защите макромолекул от перекисного окисления. Гомозиготы по аллелям с делециями этих генов (нулевые генотипы) характеризуются повышенным риском развития ряда мультифакториальных заболеваний, в том числе мужского бесплодия [7, 8]. Наличие неблагоприятных аллелей указанных полиморфизмов само по себе не является причиной бесплодия, однако увеличивает риск идиопатического мужского бесплодия относительно среднепопуляционного уровня.
Часть патологических генетических изменений у человека выражается не в структурных нарушениях последовательности нуклеотидов ДНК, а в эпигенетической патологии — аберрантном метилировании ре-гуляторных районов генома. Метилирование заключается в обратимом присоединении метильной группы к цитозину в 5'-положении пиримидинового кольца, причем метилированию подвергаются только цитози-ны в составе CpG-динуклеотидов. Метилирование
Е га Е
Е га Е
играет важную роль в поддержании стабильности генома и регуляции генной экспрессии. Аберрантное метилирование имеет место при различных патологических процессах, в частности при аномалиях развития и канцерогенезе [9]. С метилированием ДНК связан также импринтинг — способ регуляции экспрессии гена в зависимости от его родительского происхождения. Большинство генов человека имеют биаллельную экспрессию, или выбор экспрес-сирующегося аллеля в клетке происходит стохастически. Однако некоторые гены собраны в кластеры, где они экс-прессируются либо только с материнского, либо с отцовского аллеля, при этом репрессия оставшегося аллеля осуществляется с помощью гиперметилирования. Нарушение метилирования в регуляторных центрах имприн-тинга лежит в основе патогенеза таких заболеваний, как синдромы Видемана—Беквита, Прадера—Вилли, Ангельмана и ряда других [10].
Метаанализ 24 оригинальных работ показал, что достоверное изменение частоты метилирования в сперматозоидах при бесплодии наблюдали в генах BRDT, CFTC-6, CREM, DAZL, FAM50B, GNAS, GTL2, H19, IGF2, KCNQ1OT1, LIT1, MEG3, MEST, PEG3, RHOX, SNRPNи ZAC. Однако наиболее воспроизводимые результаты, подтвержденные в 3 и более независимых исследованиях (р <0,001), свидетельствовали об изменениях в частоте метилирования 3 импринти-рованных генов. Деметилирование было характерно для гена Н19, гиперметилирование — для генов SNRPN и MEST [11]. Позднёе исследование 74 пациентов с бес -плодием и 50 участников контрольной группы позволило авторам предложить эпигенетическую панель, которая дала возможность корректно классифицировать около 70 % обследуемых мужчин. Она включала CpG-динуклёотиды 1, 6—9, 12 и 15—16 в промоторе H19, а также 2, 5-6, 8-10, 13 и 16 - SNRPN [12]. Аберрантное метилирование SNRPN при бесплодии представляет особый интерес, поскольку, в отличие от гена MEST, это нарушение отмечено и при других патологиях у человека (в частности, оставшиеся как результат однородительской дисомии только гиперметилированные материнские аллели являются причиной синдрома Прадера—Вилли), демонстрирует высокую частоту нарушений и представлено аберрантным метилированием отцовского аллеля, которое удобнее выявлять на фоне избытка неметилиро-ванных аллелей в образце спермы [11, 13].
Целью настоящей работы является комплексная оценка частоты генетических и эпигенетических нарушений генов-кандидатов мужского бесплодия в гетерогенной выборке российских пациентов.
Материалы и методы
Характеристика пациентов. Выборку составили 49 неродственных мужчин с бесплодием, средний возраст — 34,2 ± 4,9 года. По данным спермограммы у 14 пациентов была нормозооспермия, в большей
части выборки (33 пациента) наблюдали олигозооспер-мию различной степени выраженности, а также 2 случая азооспермии. От каждого пациента получали образец периферической крови из вены в вакуумную пробирку с консервантом ЭДТА и образец спермы в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Работа одобрена локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.
Выделение ДНК. Геномную ДНК из крови выделяли с помощью набора ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ Роспотреб-надзора, Россия). Образцы спермы объемом 100 мкл предварительно отмывали в фосфатно-солевом буфере, центрифугировали при 10 тыс. g 5 мин, затем добавляли 100 мкл реагента Муколизин (ЦНИИЭ Роспотребнад-зора, Россия), перемешивали, инкубировали при комнатной температуре 20 мин, затем центрифугировали при 10 тыс. g 5 мин. Полученный осадок использовали для выделения ДНК набором ДНК-сорб-В.
Бисульфитная конверсия. Обработку геномной ДНК бисульфитом натрия и последующие отмывки проводили с применением набора EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit (50) (Qiagen, Германия).
Определение делеций AZF. Делеции области AZF выявляли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим электрофорезом в поли-акриламидном геле (ПААГ) и окраской нитратом серебра. Амплифицировали по 3 STS-маркера в субрегионах AZFa, b и 4 — в AZFc (всего 12 локусов с учетом контрольных участков, разделенных по 4 мультиплексным ПЦР) в соответствии с разработанной нами ранее методикой [14].
Анализ мутаций CFTR. В настоящей работе определяли 8 частых мутаций гена CFTR (F508del, CFTRdel2,3 (21kb), I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT и 5Т) методом мультиплексной ПЦР и электрофореза в ПААГ, как это было предложено нами ранее [14].
Генотипирование по CAG-повтору AR. Участок экзона 1 гена AR, содержащий CAG-повтор, амплифицировали с участием прямого и обратного праймеров, последний из которых был конъюгирован с флуорофором FAM (см. таблицу). Затем определяли длину ПЦР-продукта методом фрагментного анализа на капиллярном секвена-торе 3500xl. Полученные значения в п. н. сравнивали с положительными контрольными образцами ДНК мужчин с ранее секвенированными CAG-повторами известной длины. Программа амплификации — 95 °С 1 мин 45 с, затем 35 циклов 95 °С 40 с, 60 °С 30 с, 72 °С 20 с, финальная элонгация 72 °С 1 мин. Состав реакционной смеси ПЦР: 50-100 нг геномной ДНК, 2,5 мМ MgCL,, 1,5 мМ каждого dNTP, по 2 пмоль конъюгированного с FAM прямого и обратного праймеров, 1 ед. термостабильной Taq-поли-меразы, 5 мкл буфера для ПЦР 5х («ИнтерЛабСервис», Россия), объем смеси составлял 25 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе Vèriti 2.0 (Thermo Fisher Scientific, США).
Последовательности праймеров, используемые для исследования генов AR, GSTM1, GSTT1 и SNRPN Primer sequences used to study the AR, GSTM1, GSTT1, and SNRPN genes
Название гена Праймер Primer Последовательность, 5'-3' The sequence, 5'-3' Length of the PCR product, b. p.
AR Прямой Forward gtgcgcgaagtgatccagaa 229—295
Обратный Reverse FAM-gctgtgaaggttgctgttcctcat
Прямой Forward gaactccctgaaaagctaaagc
GSTMl 219
Обратный Reverse cttgggctcaaatatacggtgg
Прямой Forward ttccttactggtcctcacatctc
GSTTl 459
Обратный Reverse tcaccggatcatggccagca
Прямой Forward cactgccaacacctctgtcttg
CYPlBl 129
Обратный Reverse aagaatcgagctggatcaaagttc
metF cggtcgtagaggtaggttggcgc 131
SNRPN metR ctcctcaaacaaatacgtcaaacatctccga
unmetF gtgtggttgtagaggtaggttggtgt 164
unmetR caactaaccttacccactccatcaca
Примечание. ПЦР — полимеразная цепная реакция. Note. PCR — polymerase chain reaction.
Анализ полиморфизма GSTM1 и GSTT1. Инсерционно-делеционный полиморфизм генов GSTM1 и GSTT1 определяли с помощью мультиплексной ПЦР и электрофореза в ПААГ. В качестве внутреннего контроля амплифицировали фрагмент гена СУР1В1. Праймеры для ПЦР указаны в таблице, состав реакционной смеси и температурные параметры реакции аналогичны тем, которые применяли для амплификации САй-повтора АЛ.
Метилспецифическая ПЦР. Статус метилирования исследуемого района гена SNЛPN определяли методом метилспецифической ПЦР (МС-ПЦР). Праймеры для метилированного (metF и metR) и неметилирован-ного (unmetF и unmetR) аллелей указаны в таблице. Программа амплификации — 96 °С 5 мин, затем 35 циклов 95 °С 40 с, 65 °С 1 мин, 72 °С 1 мин. Состав реакционной смеси ПЦР: 0,5 мкл раствора ДНК после бисуль-фитной конверсии, 1,5 мМ MgQ2, 1,7 мМ каждого dNTP, по 2,5 пмоль прямого и обратного праймеров, 1 ед. термостабильной Taq-полимеразы, 2,5 мкл буфера для ПЦР 10х («СибЭнзим», Россия), объем смеси составлял 25 мкл.
Секвенирование по Сэнгеру. Статус метилирования отдельных Срй-динуклеотидов подтверждали методом
секвенирования по Сэнгеру. Предварительно 7 мкл ПЦР-продукта обрабатывали 1 е. а. щелочной фосфа-тазы («СибЭнзим», Россия) и 4 е. а. экзонуклеазы I из E. coli (Fermentas, Литва) для удаления непрореаги-ровавших праймеров и dNTPs. Далее половину реакционной смеси использовали в реакции получения меченых фрагментов с помощью набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, затем проводили очистку с применением реактивов BigDye XTerminator Purification Kit. Детекцию меченых фрагментов ДНК осуществляли на капиллярном секвенаторе 3500x1 (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколам производителя. Полученные хроматограммы анализировали в программе Chromas 2.6.6 (Technelysium, Австралия).
Статистический анализ данных. Частоты аллелей и генотипов сравнивали с помощью двустороннего точного критерия Фишера или критерия х2 при а = 0,05. Длину CAG-повтора в исследуемой выборке сравнивали с опубликованными данными о контроле из той же популяции с помощью критерия Манна—Уитни. Анализ проводили с использованием пакетов статистических программ STATISTICA Advanced и GraphPad Prizm 8.0.
E га E
Е га Е
Результаты и обсуждение
Определение делеций AZF и частых мутаций CFTR
Первый этап исследования состоял в том, чтобы исключить из нашей выборки пациентов с известными генетическими нарушениями, которые приводят к бесплодию или ассоциированы с этой патологией по данным ряда независимых работ. Для этого нами проведен поиск делеций в локусе AZF в субрегионах AZFa, AZFb и AZFс (по 3 STS-маркера на области AZFа и AZFb, 4 — на область AZFс). Среди 49 обследованных пациентов нами не обнаружены случаи делеций AZF. При этом локализация гено-типируемых STS-маркеров позволяла выявить все типы делеций этого локуса, в том числе частичные делеции AZFc [15]. С помощью этой комбинации STS-маркеров нами ранее были выявлены различные делеции AZF в гетерогенной выборке мужчин с бесплодием с частотами, соответствующими данным других авторов [14, 16].
В исследуемой когорте пациентов также проведен поиск наиболее частых мутаций CFTВ, включая F508del, CFTRdel2,3 (21кЬ), I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT и 5Т. Обнаружен 1 гетерозиготный носитель F508del, 5 гетерозигот с аллелем 5Т и 1 компаунд-гетерозигота F508del/5T. Частота носи-тельства мутации F508del в нашей работе, равная 4,1 % (2/49), находится в пределах ее нормальных значений для восточноевропейских популяций (2—5 %) и не отличается достоверно от среднего значения в российской популяции для 1000 генотипированных здоровых добровольцев [17]. Пациент с азооспермией и генотипом F508del/5T был исключен из дальнейшей работы.
Генотипы по локусу Г\^8 (Т) п распределились следующим образом: 7Т/7Т, 69,4 % (34/49); 7Т/9Т, 16,3 % (8/49); 5Т/7Т, 8,2 % (4/49); 5Т/9Т, 4,1 % (2/49) и 1 случай 9Т/9Т. Частоты аллелей составили: 81,6 % — 7Т, 12,2 % - 9Т и 6,2 % - 5Т.
Используя точный двусторонний критерий Фишера и критерий х2 мы не выявили достоверных различий частоты аллеля 5Т между нашей когортой и контрольной выборкой мужчин с нормоспермией из российской популяции, опубликованной в исследовании УВ. ^ету^ и соавт. [18]. Возможно, это обусловлено малым количеством пациентов в анализируемой выборке. В ретроспективном исследовании 885 мужчин с бесплодием, выполненным нами ранее, было показано достоверное увеличение частоты аллеля 5Т относительно контроля [14], как и в работах других авторов по европейским популяциям [19, 20].
Определение длины CAG-повтора AR
и генотипирование полиморфизмов GSTM1/GSTT1
Помимо мутаций, являющихся причиной бесплодия (делеции AZF и компаунд-гетерозиготы CFTВ), нами исследованы увеличивающие риск идиопатического бесплодия полиморфные варианты генов ЛЯ, GSTM1, GSTT1.
Пациенты были генотипированы по генам GSTM1 и GSTT1 для выявления нулевых генотипов, т. е. гомозиготных делеций по исследуемым участкам генов (рис. 1а). Нулевые генотипы GSTM1 были выявлены в 40,8 % (20/49), GSTT1 - в 10,2 % (5/49), сочетанные нулевые генотипы — в 6,1 % (3/49) случаев.
В проведенном другими авторами исследовании российских пациентов показано достоверное увеличение частоты нулевых генотипов в группе 160 мужчин с бесплодием относительно 104 образцов популяци-онного контроля, при этом частоты делеционных генотипов у больных и в контроле соотносились как 50 % га 37 % (GSTM1), 28 % уя 13 % (08ТТ1) и 19 % га 5 % (оба гена) [21]. Полученные нами частоты близки к таковым в контрольной группе, набранной из той же популяции цитированными здесь авторами. Тем не менее, поскольку метаанализ 6934 образцов показал ассоциацию нулевых генотипов GSTM1 и GSTT1 как по отдельности, так и вместе с олиго- и азооспермией у мужчин [8], 3 пациента в нашей выборке с со-четанными нулевыми генотипами GSTM1/GSTT1 были исключены из дальнейшей работы.
Длины CAG-повтора в экзоне 1 ЛЯ наблюдали в диапазоне 16—29 CAG-тринуклеотидов, наибольшие частоты были у аллелей 20 и 21 (CAG): 20 и 18 % соответственно. Распределение частот отличалось от нормального при проведении теста Колмогорова—Смирнова. С помощью непараметрического критерия Манна—Уитни сравнили полученное нами распределение абсолютных частот аллелей с ранее опубликованными другими авторами данными о генотипировании 200 мужчин с бесплодием из Европейской части России [22], достоверных различий частот аллелей не выявлено. Исходя из проведенного нами ранее исследования полиморфизма гена ЛВ [23], пороговый уровень для отсечения ассоциированных с идиопатическим бесплодием у мужчин условно длинных аллелей был выбран равным 26 CAG-тринуклео-тидам; в диапазон неблагоприятных аллелей попал только 1 пациент (рис. 1б). В пользу выбора этого порога свидетельствуют также результаты других исследований европейских и североамериканских популяций, в которых аллели длиной более 26 (CAG) чаще встречали у пациентов с азооспермией или гипоандро-генным статусом [24, 25]. Пациент с длиной повтора 29 (CAG) был исключен из дальнейшего исследования.
Анализ метилирования гена SNRPN
После исключения 5 пациентов из выборки на основании результатов предыдущих этапов работы метилирование гена SNВPN было исследовано у 44 мужчин, из них у 12 была нормо- и у 32 — олигозооспермия.
Метилирование исследовали методом МС-ПЦР с выборочным подтверждением статуса CpG-динукле-отидов в гиперметилированных аллелях с помощью секвенирования по Сэнгеру продуктов МС-ПЦР,
М / ОК/ ПК/
М NC PC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 501 mt>..
489 404
331 242 190
147 110 111
GSTM1
- - GSTT1
CYP1B1
Исследуемый образец/ Testsample
250 п. н./b. p.
29 (CAG) 300 п. н./b. p.
I
^пг
Контроль/ Control
250 п. н./b. p.
20 (CAG)
300 п. н./b. p. +
a
230
250
27C
29C
5
230
250
270
290
Рис. 1. Генотипирование полиморфизмов GSTM1, GSTT1 и AR: а — электрофорез исследуемых фрагментов GSTM1, GSTT1 и внутреннего контроля CYP1B1 (указаны справа), слева — позиции маркера молекулярной массы рUC19/MspI; ПК и ОК — положительный и отрицательный контроль полимеразной цепной реакции соответственно; образцы с «нулевыми» генотипами GSTM1 и GSTT1 обозначены звездочками; б — определение длины CAG-повтора AR: вверху — тестируемый образец с длиной повтора 29 (CAG), внизу — положительный контроль c длиной повтора 20 (CAG), синим показаны аллели CAG-повтора, стрелками указаны позиции маркера молекулярной массы LIZ500
Fig. 1. Genotyping of GSTM1, GSTT1, andARpolymorphisms: a — electrophoresis of the studied fragments of GSTM1, GSTT1, and internal control CYP1B1 (shown on the right), on the left — positions of the molecular weight marker p UC19/MspI; PC and NC — positive and negative control of the polymerase chain reaction, respectively; samples with «zero» genotypes GSTM1 and GSTT1 are indicated by asterisks; б — determination of the length of the AR CAG repeat: at the top — a test sample with a repeat length of 29 (CAG), at the bottom — a positive control with a repeat length of 20 (CAG), blue shows the alleles of the CAG repeat, arrows indicate the positions of the molecular weight marker LIZ500
или бисульфитного секвенирования (рис. 2). Аберрантное метилирование импринтированного гена SNRPN было выявлено у 5 пациентов с олигозооспермией, суммарно в 11,4 % (5/44) случаев мужского бесплодия. Частота аберрантного метилирования SNRPN в настоящей работе превышает аналогичный показатель в большинстве работ других авторов.
Так, анализ метилирования генов H19, GNAS, SNRPN и MEG8 в образцах спермы бесплодных мужчин с помощью метода таргетного бисульфитного высокопроизводительного секвенирования (RRBS, платформа Illumina) показал наличие 1,7 % метилированных по SNRPN образцов в группе мужчин с олигозооспер-мией против 0,42 % в группе контроля с нормозооспер-мией, хотя указанные различия в дифференциально метилированном районе SNRPN в цитируемой работе были недостоверны [26]. Можно предположить, что примесь геномной ДНК лейкоцитов могла способствовать появлению ложноположительных результатов ПЦР вследствие амплификации метилированных аллелей SNRPN материнского происхождения в настоящей работе. Однако в процитированном выше
исследовании и в нашей работе сперматозоиды отмывали от лейкоцитов и примесей в фосфатно-солевом буфере по аналогичному протоколу. У других авторов при частоте метилирования SNRPN равной 3,38 % в сперматозоидах 106 мужчин с бесплодием не было выявлено ассоциации гиперметилирования с бесплодием и эффективностью применения вспомогательных репродуктивных технологий (в отличие, например, от негативной корреляции метилирования повторяющихся последовательностей с успехом экстракорпорального оплодотворения) [27, 28].
Вместе с тем, по данным ранее проведенного метаа-нализа 301 пациента с мужским бесплодием и 124 контрольных образцов фертильных мужчин, частота метилирования SNRPN в сперматозоидах составила 3,23 % у пациентов с бесплодием и была достоверно выше, чем в контроле (р <0,001) [11]. В более поздних оригинальных исследованиях вновь не были обнаружены достоверные различия в частоте метилирования CpG-динуклеотидов в дифференциально метилируемом районе SNRPN между группами нормоспермии и олиго-спермии [29, 30]. Отчасти противоречивые данные
Е га Е
Рис. 2. Определение гиперметилирования SNRPN: а — метилспецифическая полимеразная цепная реакция (ПЦР) участка гена SNRPN. Обозначено положение неметилированного (unmeth) и метилированного (meth) аллелей, справа — позиции маркера молекулярной массы рUC19/MspI; ПК и ОК — положительный и отрицательный контроль ПЦР соответственно; аберрантное метилирование выявлено в образце № 3; б — метил-специфическое секвенирование исследуемого фрагмента SNRPN. Вверху — неметилированный (unmeth), внизу — метилированный (meth) аллели, дифференциально метилированные цитозины в составе CpG-динуклеотидов показаны звездочками
Fig. 2. Determination of SNRPN hypermethylation: a — methyl-specific polymerase chain reaction (PCR) of the SNRPN gene region. The position of the unmethylated (unmeth) and methylated (meth) alleles is indicated, on the right — the positions of the molecular weight marker pUC19/MspI; PC and NC — positive and negative PCR control, respectively; aberrant methylation was detected in sample No. 3; б — methyl-specific sequencing of the SNRPN fragment under study. At the top — unmethylated (unmeth), at the bottom — methylated (meth) alleles, differentially methylated cytosines in the CpG dinucleotides are shown by asterisks
E
W
E
о частоте метилирования SNВPN в сперме/сперматозоидах, помимо отличий на этапе пробоподготовки, могут быть объяснены различным дизайном праймеров для МС-ПЦР и лишь частично перекрывающимися перечнями протестированных CpG-динуклеотидов в дифференциально метилированных последовательностях этого гена.
Ближе к полученной нами частоте метилирования находится значение 7,74 % — частота гиперметилирования импринтированной последовательности SNВPN у курящих мужчин с бесплодием [31]. Увеличение количества метилированных аллелей в образцах спермы до 10 % при олигозооспермии наблюдали также и в другом исследовании аберрантного метилирования импринтированных генов [32].
При анализе ассоциаций метилирования SNВPN с мужским бесплодием следует иметь в виду, каким методом делался анализ метилированного района. МС-ПЦР одного участка может не показывать ассоциаций
с клиническими параметрами, тогда как более глубокое профилирование CpG-динуклеотидов гена SNВPN и прилегающих последовательностей с помощью би-сульфитного секвенирования (пиросеквенирования) позволяет идентифицировать паттерны гиперметили-рованных цитозинов, которые различаются при нормо-и олигозооспермии [12].
К сожалению, малое количество образцов с метилированием SNВPN не позволило провести в нашей работе корреляционный анализ этого показателя со степенью олигоспермии. Тем не менее полученные данные свидетельствуют в пользу того, что аберрантное метилирование импринтированных генов может быть вовлечено в патогенез более 11 % случаев мужского бесплодия без учета тех случаев, которые связаны с вы-сокопенетрантными мутациями и сочетаниями неблагоприятных полиморфизмов в известных генах-кандидатах бесплодия. Для более точной оценки доли эпигенетической патологии в структуре молекулярных
нарушений сперматогенеза необходимо исследовать и другие гены (дифференциально метилированные последовательности генома) как подверженные им-принтингу, так и с биаллельной экспрессией в норме.
Многие исследователи продолжают поиск дифференциально метилированных генов, которые могут быть вовлечены в патогенез олигозооспермии, в частности, показана повышенная частота метилирования генов GAA, UBE2G2 и ALS2CR12 у пациентов с олиго-зооспермией относительно контрольной группы (р <0,0001) [33]. Выполненный в настоящей работе комплексный анализ мутаций и полиморфизмов в совокупности с оценкой частоты аберрантного метилирования SNRPN демонстрирует, что 20,4 % (10/49) случаев в гетерогенной выборке мужчин с бесплодием связаны со структурными генетическими нарушениями и/или эпигенетической патологией.
Заключение
Бесплодие у мужчин может быть обусловлено различными причинами, однако доля генетически обусловленных случаев постепенно увеличивается в этиоло-
гической структуре этого заболевания. Происходит это вследствие углубления знаний о молекулярном патогенезе снижения фертильности у мужчин, возросшего значения высокопроизводительного секвенирования и его роли в выявлении герминальных мутаций при синдромах Картагенера, Кальмана и другой наследственной патологии, а также изучения роли нарушений имприн-тинга и метилирования ДНК в сперматогенезе. В настоящей работе показано, что в 11 % случаев гетерогенной выборки мужчин с бесплодием выявлено аберрантное метилирование импринтированного гена SNRPN в сперме, что может отражать эпигенетические нарушения при сперматогенезе. Целесообразна вали-дация полученных результатов на более масштабной выборке образцов сперматозоидов с оценкой статуса метилирования других импринтированных и неим-принтированных генов. Вместе с тем нами продемонстрировано, что с учетом мутаций и полиморфизмов в уже известных связанных с бесплодием генах, около 20 % случаев снижения фертильности у мужчин характеризуются наличием молекулярно-генетических и эпигенетических нарушений.
Л ИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Чалый М.Е., Ахвледиани Н.Д., Харчилава Р.Р. Мужское бесплодие. Урология 2017;2-S2:4-19. [Chalyi M.E., Akhvlediani N.D., Kharchilava R.R. Male infertility. Urologiya = Urology 2017;2-S2:4-19. (in Russ.)]. DOI:10.18565/urol.2017.2-supplement.4-19. PMID: 28845928.
2. Kleisch S. Diagnosis of male infertility: diagnostic work-up of the infertile man. Eur Urol Suppl 2014;13:73-82. D01:10.1016/j.eursup.2014.08.002.
3. Krausz C., Riera-Escamilla A. Genetics of male infertility. Nat Rev Urol 2018; 15(6):369-84. D01:10.1038/s41585-018-0003-3. PMID: 29622783.
4. Colaco S., Modi D. Genetics
of the human Y chromosome and its association with male infertility. Reprod Biol Endocrinol 2018;16(1):14. DOI:10.1186/s12958-018-0330-5. PMID: 29454353.
5. Souza D.A., Faucz F.R., Pereira-Ferrari L. et al. Congenital bilateral absence
of the vas deferens as an atypical form of cystic fibrosis: reproductive implications and genetic counseling. Andrology 2018;6(1):127-35. D01:10.1111/andr.12450. PMID: 29216686.
6. Xiao F., Lan A., Lin Z. et al. Impact of CAG repeat length in the androgen receptor gene on male infertility -
a meta-analysis. Reprod BioMed Online
2016;33(1):39-49. D01:10.1016/j. rbmo.2016.03.012. PMID: 27157932.
7. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г, Чалый М.Е., Усачёва О.А. Влияние полиморфизма генов глутатионтрансфераз М1 и Т1 на андрогенный статус и качество эякулята после оперативного лечения ва-рикоцеле. Андрология и генитальная хирургия 2013;1:23-6. [Glybochko P.V., Alyaev Y.G., Chalyy M.E., Usacheva OA. Influence of the glutation S-transferases T1 and M1 gene polymorphisms
on androgenic status and semen quality after surgical treatment of varicocele. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2013;14(1):23-6. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/2070-9781-2013-1-23-26.
8. Wu W., Lu J., Tang Q. et al. GSTM1
and GSTT1 null polymorphisms and male infertility risk: an updated meta-analysis encompassing 6934 subjects. Sci Rep 2013;3:2258. D0I:10.1038/srep02258. PMID: 23877133.
9. Эпигенетика. Под. ред. Эллис С.Д., Дженювейн Т., Рейнберг Д., Капаррос М.Л. Пер.с англ. М.: Техносфера, 2010. 496 с. [Epigenetics. Ed. by C.D. Allis, T. Jenuwein,
D. Reinberg, M.L. Caparros. M.: Technosfera, 2010. 496 pp. (in Russ.)]. 10. Наследственные болезни. Национальное руководство. Под ред. Бочкова Н.П. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. 936 с.
[Hereditary diseases. National guideline. Ed. by N.P. Bochkov. M.: GEOTAR-Media, 2013. 936 pp. (in Russ.)].
11. Santi D., De Vincentis S., Magnani E., Spaggiari G. Impairment of sperm DNA methylation in male infertility: a meta-analytic study. Andrology 2017;5(4):695-703. D0I:10.1111/andr.12379. PMID: 28718528.
12. Peng H., Zhao P., Liu J. et al. Novel epigenomic biomarkers of male infertility identified by methylation patterns
of CpG sites within imprinting control regions of H19 and SNRPN genes. OMICS 2018;22(5):354-64. D0I:10.1089/omi.2018.0019. PMID: 29708855.
13. Cheon C.K. Genetics of Prader-Willi syndrome and Prader-Will-Like syndrome. Ann Pediatr Endocrinol Metab 2016;21(3):126-35. DOI:10.6065/ apem.2016.21.3.126. PMID: 27777904.
14. Михайленко Д.С., Соболь И.Ю., Сафронова Н.Ю. и др. Частота выявления делеций AZF, мутаций CFTR
и длинных аллелей CAG-повтора AR при первичной лабораторной диагностике в гетерогенной группе пациентов с мужским бесплодием. Урология 2019;3:101-7. [Mikhaylenko D.S., Sobol I.Y., Safronova N.Y. et al. The incidence of AZF deletions, CFTR mutations and long alleles of the AR CAG repeats during the primary laboratory
E
W
E
Е га Е
diagnostics in a heterogeneous group of infertily men. Urologiya = Urology 2019;3:101-7. (in Russ.)]. D01:10.18565/ urology.2019.3.101-107. PMID: 31356021.
15. Nailwal M., Chauhan J.B. Azoospermia factor C subregion of the Y chromosome. J Hum Reprod Sci 2017;10(4):256-60. D0I:10.4103/jhrs.JHRS_16_17. PMID: 29430151.
16. Аксельрод Э.В., Миронов К.О., Михайленко Д.С. и др. Разработка
и апробация методики на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для определения клинически значимых микроделеций в Y-хромосоме. Клиническая лабораторная диагностика 2018;63(2):124-8. [Akselrod E.V., Mironov K.O., Mikhailenko D.S. et al. The development and approbation of methodology on the basis of multiplex polymerase chain reaction in real-time to determine clinically significant micro-deletion in Y-chromosome. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Klin Lab Diagn 2018;63(2):124-8. (in Russ.)]. DOI: 10.18821/0869-2084-2018-63-2124-128. PMID: 30672679.
17. Абрамов Д.Д., Кадочникова В.В., Якимова Е.Г. и др. Высокая частота носительства в российской популяции мутаций гена CFTR, ассоциированных с муковисцидозом, и мутаций гена PAH, ассоциированных с фенилкето-нурией. Вестник РГМУ 2015;4:32-5. [Abramov D.D., Kadochnikova V.V., Yakimova E.G. et al. High carrier frequency of CFTR gene mutations associated with cystic fibrosis,
and PAH gene mutations associated with phenylketonuria in Russian population. Vestnik RGMU = Bulletin of RSMU 2015;4:32-5. (in Russ.)].
18. Chernykh V.B., Stepanova A.A., Beskorovainaya T.S. et al. The frequency and spectrum of mutations and the IVS8-T polymorphism of the CFTR gene
in Russian infertile men. Russian Journal of Genetics 2010;46(6):750-57. PMID: 20734777.
19. Yang X., Sun Q., Yuan P. et al. Novel mutations and polymorphisms
in the CFTR gene associated with three subtypes of congenital absence of vas deferens. Fertil Steril 2015;104(5):1268-75.e2. D0I:10.1016/j.fertnstert.2015.07.1143. PMID: 26277102.
20. Gelfi C., Perego M., Righetti P.G. et al. Rapid capillary zone electrophoresis
in isoelectric histidine buffer: high resolution of the poly-T tract allelic variants in intron 8 of the CFTR gene. Clin Chem 1998;44(5):906—13. PMID: 9590360.
21. Курашова Н.А., Беляева Е.В., Ершова О.А. и др. Ассоциация полиморфизма генов GSTT1, GSTM1 с бесплодием у мужчин. Урология 2017;6: 38-42. [Kurashova NA., Belyaeva E.V., Ershova O.A. et al. Association of polymorphism of GSTT1 and GSTM1 genes with infertility in men. Urologiya = Urology 2017;6:38-42. (in Russ.)]. DOI:10.18565/urology.2017.6.38-42. PMID: 29376593.
22. Черных В.Б., Руднева С.А., Сорокина Т.М. и др. Влияние CAG-полиморфизма гена андрогено-вого рецептора (AR) на сперматогенез у мужчин с бесплодием. Андрология
и гениальная хирургия 2015;16(4):55—61. [Chernykh V.B., Rudneva S.A., Sorokina T.M. et al. An influence of androgen receptor (AR) gene CAG-polymorphism on spermatogenesis in infertile men. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2015;16(4):55—61. (in Russ.)]. D0I:10.17650/2070-9781-2015-16-4-55-61.
23. Михайленко Д.С., Бабенко О.В., Кириллова Е.А. и др. Комплексный молекулярно-генетический анализ микроделеций области AZF, мутаций гена CFTR и длины CAG-повтора гена AR у мужчин с бесплодием. Проблемы репродукции. 2005;11(6):52—5. [Mikhaylenko D.S., Babenko O.V., Kirillova E.A. et al. Complex molecular genetic analysis of the AZF microdeletions, CFTR mutations,
and CAG-repeat length of the AR gene in infertile men. Problemy reproduktsii = Problems of reproduction. 2005;11(6):52—5 (in Russ.)].
24. Canale D., Caglieresi C., Moschini C. et al. Androgen receptor polymorphism (CAG repeats) and androgenicity. Clin Endocrinol (Oxf) 2005;63(3):356—61. D0I:10.nn/j.1365-2265.2005.02354.x. PMID: 16117826.
25. Katagiri Y., Neri Q.V., Takeuchi T. et al. Androgen receptor CAG polymorphism (Xq11-12) status and human spermatogenesis: a prospective analysis of infertile males and their offspring
conceived by intracytoplasmic sperm injection. Int J Mol Med 2006;18(3):405-13. PMID:16865224.
26. He W., Sun Y., Zhang S. et al. Profiling the DNA methylation patterns
of imprinted genes in abnormal semen samples by next-generation bisulfite sequencing. J Assist Reprod Genet 2020;37(9):2211-21. D01:10.1007/s10815-020-01839-x. PMID: 32572674.
27. El Hajj N., Zechner U., Schneider E. et al. Methylation status of imprinted genes and repetitive elements in sperm DNA from infertile males. Sex Dev 2011;5(2):60-9. D01:10.1159/000323806.
PMID: 21293114.
28. Camprubi C., Pladevall M., Grossmann M. et al. Semen samples showing
an increased rate of spermatozoa with imprinting errors have a negligible effect in the outcome of assisted reproduction techniques. Epigenetics 2012;7(10):1115-24. D01:10.4161/epi.21743. PMID: 22885410.
29. Lou H., Le F., Hu M. et al. Aberrant DNA methylation of IGF2-H19 locus in human fetus and in spermatozoa from assisted reproductive technologies. Reprod Sci 2019;26(7):997-1004. DOI:10.1177/1933719118802052. PMID: 30270743.
30. Ni W., Pan C., Pan Q. et al. Methylation levels of IGF2 and KCNQ1 in spermatozoa from infertile men are associated with sperm DNA damage. Andrologia 2019;51(5):e13239.
DOI: 10.1111/and.13239. PMID: 30680773.
31. Dong H., Wang Y., Zou Z. et al. Abnormal methylation of imprinted genes and cigarette smoking: assessment of their association with the risk of male infertility. Reprod Sci 2017;24(1):114-23. DOI:10.1177/1933719116650755. PMID: 27247128.
32. Hammoud S.S., Purwar J., Pflueger C. et al. Alterations in sperm DNA methylation patterns at imprinted loci in two classes ofinfertility. Fertil Steril 2010;94(5):1728-33. DOI:10.1016/j.fertnstert.2009.09.010. PMID: 19880108.
33. Laqqan M., Hammadeh M.E. Alterations in DNA methylation patterns and gene expression in spermatozoa of subfertile males. Andrologia 2018;50(3). D0I:10.1111/and.12934.
PMID: 29230837.
Вклад авторов
Д.С. Михайленко: выполнение основного объема экспериментальных исследований CAG-повтора AR, генов глутатионтрансфераз, МС-ПЦР гена SNRPN, участие в написании всех разделов статьи, формирование дизайна исследования; О.А. Симонова: определение делеций AZF в исследуемой выборке;
И. Аль-Акел: анализ клинических данных о пациентах и участие в написании раздела о результатах и их обсуждении; И.Ю. Соболь: сбор клинического материала и выделение ДНК; Т.А. Едоян : участие в анализе экспериментальных данных;
Е.А. Ефремов: участие в статистическом анализе данных, написании раздела о результатах, заключения к статье и формировании дизайна исследования;
Е.Б. Кузнецова: бисульфитное секвенирование ПЦР-продуктов и выполнение отдельных экспериментальных задач работы; М.В. Немцова: общее руководство исследованием, участие в написании раздела с обсуждением результатов. Authors' contributions
D.S. Mikhaylenko: performing the main volume of experimental studies of the CAG repeat of AR, glutathione transferase genes, MS-PCR of the SNRPN gene, participating in the writing of all sections of the article, forming the design of the study;
0.A. Simonova: determination of AZF deletions in the study sample;
1. El Akel: analysis of clinical data on patients and participation in the writing of section on the results and discussion; I.Yu. Sobol: collection of clinical material and isolation of DNA;
T.A. Edoyan: participation in the analysis of experimental data;
E.A. Efremov: participation in the statistical analysis of data, writing a section on the results, conclusion to the article and forming the design of the study; E.B. Kuznetsova: bisulfite sequencing of PCR products and implementation of individual experimental tasks;
M.V. Nemtsova: general management of the study, participation in the writing of the section with the discussion of the results.
ORCID авторов / ORCID of authors
Д.С. Михайленко / D.S. Mikhaylenko: https://orcid.org /0000-0001-9780-8708 Е.А. Ефремов / E.A. Efremov: https://orcid.org /0000-0001-7193-7413 Е.Б. Кузнецова / E.B. Kuznetsova: https://orcid.org/0000-0002-7857-6320 М.В. Немцова / M.V. Nemtsova: https://orcid.org /0000-0002-2835-5992
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке государственного задания Минобрнауки России на 2020 г. Financing. The work was carried out with partial financial support of the state task of the Ministry of Education and Science of Russia for 2020.
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Работа одобрена локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет). Compliance with patient rights and principles of bioethics. All patients signed informed consent to participate in the study. The work was approved by the Local Ethics Committee of the I.M. Sechenov First MSMU MOH Russia (Sechenov University).
E ra E
Статья поступила: 17.11.2020. Принята к публикации: 11.03.2021. Article submitted: 17.11.2020. Accepted for publication: 11.03.2021.
