351. БИОИНФОРМАТИКА
МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ - ВОЗМОЖНОСТИ СОВРЕМЕННОЙ БИОИНФОРМАТИКИ
С. С. Зайцев, М. А. Хижнякова, В. А. Федорова
Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии» E-mail: feodorovav@mail.ru
Аннотация: В данной работе представлены результаты метагеномного анализа массива «сырых» данных, полученных с использованием секвенирования второго и третьего поколения с целью определения спектра микроорганизмов, содержащихся в биоматериале от больного сельскохозяйственного животного. Аннотация и расшифровка коротких и длинных прочтений с использованием автоматизированного сервера MG-RAST выявило коинфицирование животного двумя патогенами, имеющими различную таксономическую принадлежность.
Ключевые слова: метагеномный анализ, NGS, Oxford Nanopore, Illumina, инфекционные заболевания, диагностика, биоинформатика, сельскохозяйственные животные
Инфекционные заболевания (ИЗ) репродуктивной системы сельскохозяйственных животных (с/х животных) широко распространены во всем мире и являются глобальной проблемой для сельского хозяйства. ИЗ репродуктивной системы с/х животных могут вызывать инфекционные аборты, мертворождение и приводить к бесплодию, нанося колоссальный экономический ущерб промышленному животноводству. Возбудителями данной группы заболеваний является целый ряд микроорганизмов, относящихся как к патогенной, так и к условно-патогенной флоре [1,2].
Наиболее важным аспектом успешного лечения ИЗ и предотвращения распространения возбудителей среди поголовья является своевременная точная диагностика и идентификация патогена. Наряду с классическими микробиологическими подходами и ПЦР диагностикой, все более широкое распространение приобретает метагеномный анализ, основанный на технологиях «секвенирования нового поколения» (от англ. Next Generation_Sequencing, NGS), включающих в себя группу методов для получения информации о полной последовательности молекулы ДНК.
NGS обладает рядом неоспоримых преимуществ. Во-первых, в отличие от таргетной ПЦР диагностики, данный метод позволяет определить весь спектр патогенов в исследуемом клиническом образце, что особенно важно при смешанных инфекциях. Во-вторых, существенно сокращается время анализа по сравнению с бактериологическими
методами, подразумевающими высев биоматериала на дифференциальные питательные среды. Также становится возможным идентифицировать большинство микроорганизмов, некультивируемых на рутинных бактериологических средах [3].
Отличительной особенностью методов NGS от более ранних вариантов секвенирования является высокая пропускная способность, т.е. возможность прочтения различных участков генома одновременно. На сегодняшний день наибольшую популярность приобрели два подхода к получению массива данных: секвенирование повторяющийся коротких фрагментов ДНК длиной до 250 олигонуклеотидных пар (о.п.) (секвенирование второго поколения), реализуемое на различных платформах (Illumina и др.), и секвенирование длинных прочтений молекулы ДНК от 2000 о.п. (секвенирование третьего поколения), представленное такими производителями как Oxford Nanopore. Однако анализ полученных последовательностей методами NGS не представляется возможным без применения современных биоинформатических подходов для обработки данных [4].
Целью данного исследования являлось проведение метагеномного анализа биоматериала крупного рогатого скота (КРС) с использованием данных секвенирования второго и третьего поколения на платформах Illumina HiSeq 2500 и Oxford Nanopore MinlON.
Для выделения ДНК из биоматериала КРС использовали коммерческий набор «DNeasy Blood & Tissue Kits» (Qiagen, Германия). Подготовку библиотек для секвенирования производили согласно протоколам производителей. Для получения длинных прочтений использовали секвенатор Oxford Nanopore MinION с проточной ячейкой FL0-MIN106 (Oxford Nanopore Technologies Ltd, Великобритания). Для получения коротких прочтений секвенирование осуществляли на Illumina HiSeq 2500 (Illumina, Inc., США).
В результате нами был получен массив данных размером 1,28 Гб (содержащий 10 656 638 последовательностей общей длиной 2664 159 500 о.п.) для коротких и 16,2 Гб (1 056 043 последовательностей общей длиной 1 526 561 299 о.п.) для длинных прочтений, соответственно. Дальнейший анализ полученных прочтений (ридов) производили на базе сервера MG-RAST для филогенетического и функционального анализа метагеномов.
Реализуемый на сервере алгоритм присвоения 32-символьного шестнадцатеричного отпечатка MD5 для каждой последовательности позволил произвести сравнение метаданных с аннотациями в онлайн базах данных нуклеотидных и белковых последовательностей [6]. Таксономическую аннотацию коротких и длинных ридов осуществляли за счет алгоритма contigLCA (Lowest Common Ancestor).
Проведенный метагеномный анализ коротких и длинных прочтений позволил идентифицировать ДНК микроорганизмов, содержащихся в биоматериале от КРС. На рисунке 1 продемонстрировано распределение
таксономических единиц в ридах. Как видно из диаграммы, доминирующее количество прочтений, полученных с применением NGS платформ, было отнесено к генетическому материалу представителей семейства Enterobacteriacea, являющихся этиологическим фактором воспалительных ИЗ репродуктивной системы животных [7].
Enterobaclenaceae 9.1G4.01G (99.8-3%) MiCtoviridae - Э.4&1 (0.04%) Siphoviridac -1.538 (0.02%) Psythromortadac^ -1,143 (0.01%) t-1,07? (001%) ■ 857(001%) Myovindae ■ 850 (0.01%) unclassified (derived from Viruses) - 673 (0 019 Xantfiomonadaccac - 636 (0.01%) RhcobiaciM - 578 (0.01%) HomiftKl»« - 575 [0 01%) могакеиасеае M7(0 0i%) Vibrionateae ■ 476 (0.01%) Porphyromonadaceae - 4-44 (0.00%)
EnMfobacttriaceatt -162,613 (67.61%) Ciilarriydeeeae - 63,713 (2646%) ЕЬЫЬижие .5.185(215%) Phawxt** - 3 490 (1 45%) 984(0 41%) ■ m (0 35%) Poaceae ■ Ш (0 10%) Xanthomonadaeeae ■ 250(0-11%) Podovifictae . 232 (0 10%) Esirildidae -149 (0.06%) CanrtK -142 (0.06%) Formicttat -137 (0 06%) Aj*llontyc*t»c*** -137 (0 00%) Homing« -126 (0.05%)
a)
б)
Рис. 1. Сравнительный метагеномный анализ полученных «сырых» данных на двух NGS платформах: a) Illumina HiSeq 2500; б) Oxford Nanopore.
Стоит отметить, что проведенный метагеномный анализ длинных прочтений, полученных с применением платформы Oxford Nanopore, позволил также идентифицировать таксономическую принадлежность 26,46% ридов к микроорганизмам семейства Chlamydiacea, что может свидетельствовать о факте наличия коинфекции в исследуемом образце. Как известно, представители данного семейства не культивируются на твердых и жидких питательных средах и могут быть выращены in vitro только в специальных условиях (путем инфицирования куриных эмбрионов или перевиваемых клеточных культур). Важно, что эти патогены играют ключевую роль в возникновении инфекционных абортов у КРС [8]. Оставшаяся часть идентифицированных последовательностей, имеющая низкий процентный состав (менее 2%) от общего числа ридов, была исключена из анализа.
Таким образом, применяемые биоинформатические подходы для метагеномного анализа, выполненного с использованием NGS технологий, являются мощным инструментом, позволяющим с высокой точностью и в кратчайшие сроки выявить наличие коинфекции и определить спектр патогенов в клиническом образце при диагностике ИЗ у с/х животных.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-316-90024.
Библиографический список
1. Yoo H. S. Infectious causes of reproductive disorders in cattle // J Reprod Dev. 2010. V. 56. P. 53-60.
2. Hoffmann H., Stindl S., Ludwig W., at al. Enterobacter hormaechei subsp. oharae subsp. nov., E. hormaechei subsp. hormaechei comb. nov., and E. hormaechei subsp. steigerwaltii subsp. nov., Three New Subspecies of Clinical Importance // J Clin Microbiol. 2005. V. 43. №7. P. 3297-3303.
3. Равин Н.В., Марданов А.В., Скрябин К.Г. Метагеномика как инструмент изучения "некультивируемых" микроорганизмов. Генетика. 2015. Том 51. №5. С. 519.
4. Eisen J.A. Environmental Shotgun Sequencing: Its Potential and Challenges for Studying the Hidden World of Microbes // PLoS Biol. 2007. V. 5. №3. P. 82.
5. Wilke A., Harrison T., Wilkening J., et al. The M5nr: a novel non-redundant database containing protein sequences and annotations from multiple sources and associated tools // BMC Bioinformatics. 2012. V. 13. №141.
6. Wang Z., Duan L., Liu F., et al. First report of Enterobacter hormaechei with respiratory disease in calves // BMC Veterinary Research. 2020. V. 16. №1.
7. Vidal S., Kegler K., Greub G., et al. Neglected zoonotic agents in cattle abortion: tackling the difficult to grow bacteria // BMC Veterinary Research. 2017. V. 13. №373.
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТЫКОВКИ НЕЛАРАБИНА С ВИРУСОМ ИММУНОДИФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 4NKK
2 11 С.Н. Шахаб , М.А. Ханчевский , Е.И. Квасюк
белорусский государственный университет, г. Минск, Беларусь
МГЭИ им. А.Д. Сахарова БГУ, г. Минск, Беларусь
E-mail: maks.khanchevskiy@bk.ru
Аннотация: Молекулярный анализ стыковки - важный инструмент для разработки лекарств и молекулярной структурной биологии. Целью молекулярного стыковочного анализа является прогнозирование предпочтительного места связывания, аффинности и активности молекул лекарства и их белковых мишеней. Квантово-химическим моделированием и молекулярным докингом исследовано взаимодействие неларабина с вирусом иммунодефицита человека 4ККК.
Ключевые слова: неларабин, докинг, вирус иммунодефицита человека 4ККК.
Возникновение резистентности к действию лекарственных препаратов требует их постоянного обновления для обеспечения эффективности процесса лечения различных заболеваний. В результате постоянно проводимых научных исследований по поиску биологически активных соединений и появляются препараты нового поколения. Одним из таких соединений является модифицированный нуклеозид 2-амино-6-етокси-9-(Р-0-арабинофуранозил) пурин (неларабин). Это соединение, обладающее противоопухолевой и противовирусной активностью, наряду с флударабином и кладрибином, пополнило арсенал противолейкозных соединений нового поколения [1-3]. Неларабин относится к антиметаболитам пуринового ряда и является аналогом дезоксигуанозина. По механизму своего действия неларабин можно отнести к про-лекарствам, а его активной формой является продукт дезаминирования -арабинофуранозилгуанин (araG), который, превращаясь в клетках в соответствующий 5'-трифосфат, ингибирует синтез ДНК, оказывая цитотоксическое действие. Преимуществом неларабина, как противоопухолевого препарата, в сравнении с araG, является его большая (в ~10 раз) растворимость [2-4]. К недостаткам следует отнести более сложный синтез соединения. К настоящему времени другие биологические
