Метаболизм сахарозы на ранних этапах онтогенеза кукурузы (Zea mays L. ), трансформированной in planta обезоруженными штаммами Agrobacterium tumеffaciens Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 579.254.2:581.143.5

МЕТАБОЛИЗМ САХАРОЗЫ НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА КУКУРУЗЫ (Zea mays L.), ТРАНСФОРМИРОВАННОЙ in planta ОБЕЗОРУЖЕННЫМИ ШТАММАМИ Agrobacterium tumcfaciens

1Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев

2Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев

3Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН,

Новосибирск

E-mail: [email protected]

Проведено сравнительное изучение активности энзимов углеводного метаболизма инбредной линии кукурузы Л370, трансформированной in planta с помощью агробактериальных штаммов LBA4404 и GV2260, содержащих соответственно векторные конструкции pBi2E и pCB002. Показаны специфичность функционирования вакуолярной, цитоплазматической инвертазы, а также ин-вертазы клеточных стенок и сахарозосинтазы (СС), а также изменения в содержании сахарозы, моносахаров, крахмала и протеинов в побегах 9-суточных этиолированных проростков и в листьях 20-суточных растений. Больший ингибирующий эффект на активность энзимов гидролиза и расщепления сахарозы оказывал штамм LBA4404 (pBi2E). Вместе с тем, в реакции синтеза дисахарида варьирование в функционировании СС между используемыми штаммами являлось тканеспецифичным и было связано как со снижением, так и с повышением ее активности. Полученные данные свидетельствуют о различном влиянии обезоруженных агробактериальных штаммов на функционирование энзимов, включающих в метаболизм сахарозу, а также на баланс гексоз и сахарозы.

Ключевые слова: кукуруза (Zea mays L.), Agrobacterium-опосредованная трансформация, инвертаза, сахарозосинтаза, углеводы.

Е. Н. Тищенко1 В. Д. Сакало1

A. Ю. Матвеева1

B. М. Курчий1 Б. В. Моргун2 А. В. Кочетов3

А^гоЬа^епит-опосредованн&я генетическая трансформация — перспективное направление молекулярной биотехнологии, основным преимуществом которого является возможность интеграции единичных копий Т-ДНК, содержащих комплекс целевых генов, в транскрипционно-активные области ядерного генома, что повышает вероятность стабильной экспрессии трансгенов в ряду поколений растений, в том числе и кукурузы [1-3]. Успешность технологических решений во многом определяется пониманием генетических и физиологических аспектов процесса взаимодействия в системе агробактерия — растение, а также происходящих в них метаболических изменений в ответ на инфицирование различными обезоруженными штаммами.

Критическим этапом является интродукция Т-ДНК Тьплазмиды в клетки растений

и ее сайтспецифическая интеграция в ядерный геном. Этот процесс инициируется активацией двухкомпонентной регуляторной системы VirA-VirG в ответ на появление фенольных соединений и моносахаров (аль-доз), синтезированных в пораненных или активно растущих растительных клетках. Другими сигналами являются пониженные значения рН (4,8-5,5) и РО3-4 [4-8]. Присутствие фенолов обязательно для шг-индук-ции, в то время как альдозы повышают чувствительность агробактерии к фенолам, значительно увеличивая активность VirA. Эта мембраносвязанная киназа подвергается аутофосфорилированию, переносит фос-форильную группу на остаток аспартата VirG, инициирующего транскрипцию шг-ге-нов. Физическая связь фенолов и рН-сигна-лов с VirA не установлена, тогда как индуци-

руемое сахарами повышение экспрессии vir-генов осуществляется через ChvE — хромосомно-кодируемый протеин, который специфично связывает, в частности, D-глюкозу [5, 6].

Способность VirA-VirG- системы воспринимать разнообразие фенолов и моносахаров определяет широкий круг растений-хозяев агробактерии. С другой стороны, обращают на себя внимание гексозы, которые, согласно современным представлениям, рассматриваются в качестве сигнальных и регуляторных молекул, принимающих участие в процессах развития растений. При этом важная роль в установлении баланса между сахарами как сигнальными/регуляторными молекулами и компонентами метаболических путей принадлежит энзимам метаболизма сахарозы [9, 10]. Ранее нами установлено, что на начальных этапах органогенеза in vitro, индуцированного из клеток незрелых зародышей кукурузы после их трансформации с помощью Agrobacterium tumifaciens, происходит повышение активности энзима синтеза сахарозы — сахарозосинтазы и ее включение в метаболизм инвертазой [11]. В этой связи мы предполагаем, что через гек-созы может осуществляться взаимодействие в путях передачи сигналов, активирующих, с одной стороны, агробактериальную vir-регуляторную систему процессинга и переноса рекомбинантных ДНК, а с другой — процесс роста и дифференцировки клеток в ходе органогенеза in vitro.

Основными энзимами, включающими сахарозу в метаболизм, являются инвертаза (К.Ф.3.2.1.26) и сахарозосинтаза (К.Ф.2.4.1.13) [9-11], гены которых различаются пространственно-временной экспрессией в процессе онтогенеза и уровнями регуляции [12-15]. Существует несколько форм инвертазы, отличающихся оптимумом рН и локализацией в клетке: щелочная цитоплазматическая ин-вертаза (ЦИ), кислая вакуолярная (ВИ) и кислая инвертаза, имеющая ионные связи с клеточной стенкой (ИКС). Каждая из форм инвертазы кодируется небольшим семейством генов и представлена несколькими изоформами [16, 17]. Формы инвертазы характеризуются тканеспецифичностью и направленностью потоков образованных ими гексоз в различные метаболические пути в онтогенезе растений. Другую их функцию связывают с инициацией гексозооснован-ных сигналов на мембране и в цитоплазме, где в зависимости от путей поступления сахарозы в клетку определяющее значение имеют ВИ и ИКС из-за обычно низкой активности ЦИ [9, 11]. Большинство генов, ко-

дирующих СС, представлено небольшим мультигенным семейством, их экспрессия контролируется сахарозой. У кукурузы известны 3 гена (susl, sus2, shl), кодирующих изоформы СС (SUS1, SUS2, SUS-SH1, соответственно), которые находятся преимущественно в цитоплазме, хотя некоторые протеины могут быть мембраносвязанными [18, 19].

В последнее время повышенное внимание уделяется разработке методов Agrobacterium-опосредованной трансформации не только in vitro, но и in planta [20]. Однако вопросы, связанные с углеводным обменом в процессе трансгенеза растений, исследованы крайне недостаточно. Целью данной работы было сравнительное изучение активности энзимов метаболизма сахарозы и содержания углеводов на ранних стадиях онтогенеза кукурузы, инфицированной in planta обезоруженными штаммами ЪВА4404 и GV2260, содержащими соответственно векторные конструкции pBi2E и pCB002, которые включают разные целевые гены.

Материалы и методы

Agrobacterium-опосредованную трансформацию инбредной линии кукурузы Л370 (селекции Института физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев) проводили in planta частично модифицированным нами методом Чумакова и соавт. [20], где после изоляции пестичных нитей осуществляли инокуляцию штаммами ЪВА4404 (pBi2E) и GV2260 (pCB002) с последующим опылением пыльцой этого же растения. Агробак-териальные штаммы выращивали в жидкой LB-среде (200 об/мин) при 28 °С. Обе векторные конструкции содержали селективный ген неомицинфосфотрансферазы (nptII) E. coli под контролем промотора гена нопа-линсинтазы. В отличие от pCB002, которая включала также репортерный ген в-глюкуро-нидазы E. coli, pBi2E содержит дуплицированный участок гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса (A. thaliana), расположенный как инвертированный повтор под 35S промотором вируса мозаики цветной капусты.

Условия выращивания и селекции. Для получения зрелых зерновок при инфицировании растений варьировали компонентами среды инокуляции и концентрацией агро-бактериальной суспензии клеток. Зрелые зерновки растений стерилизовали 20 мин в 96%-м спирте, 40 мин в 10%-м растворе хлорамина, трижды промывали стерильной дистиллированной водой и проращивали на модифицированной MS-среде с добавлением

селективного агента — канамицина сульфата (Km) в концентрации 50 мг/л при 25 °С с 16-часовым фотопериодом. Селекцию Km-устойчивых растений проводили в течение двух пассажей продолжительностью в 2 недели. Для биохимического анализа использовали nptII-содержащие побеги 9-суточных этиолированных проростков, выращенных в термостате при 25 °С в песке, а также листья 20-суточных растений, выращенных на MS-среде при 25 °С с 16-часовым фотопериодом.

ПЦР-анализ. ДНК выделяли из зрелых зерновок и зеленых листьев Km- устойчивых растений частично модифицированным методом Деллапорта [21]. Наличие гена nptII в геноме кукурузы определяли с использованием праймеров: 5'-CCTGAAT-

GAACTCCAGGAGGAGGCA (F) и 5'-GCTCTA-GATCCAGAGTCCCGCTCAGAAG (R).

Условия амплификации ДНК: преденатура-ция 94 °С, 4 мин; 35 циклов — денатурация 94 °С, 30 с; реассоциация — 53 °С, 30 с; синтез — 72 °С, 30 с; конечная элонгация — 72 °С, 10 мин (амплификатор Mastercycler 5332 Eppendorf Personal). Реакционная смесь содержала 10 нг ДНК. Отсутствие примесей

A. tumefaciens в растительных тканях анализировали, используя праймеры к гену virD1 для штамма GV2260 (pCB002) и virC для штамма LВА4404 (pBi2E), ожидаемые размеры ампликонов которых составляли 432 п. н. и 730 п. н. Условия амплификации ДНК: преденатурация 94 °С, 4 мин; 35 циклов: денатурация — 94 °С, 30 с; реассоциация — 57 °С, 30 с; синтез — 72 °С, 15 с; конечная элонгация — 72 °С, 10 мин для virD1 и денатурация — 94 °С, 30 с; реассоциация — 60 °С, 30 с; синтез — 72 °С, 45 с; конечная элонгация — 72 °С, 10 мин — для virC. Праймеры, используемые для virD1: 5'-ATG TCG CAA GGC AGT AAG CCC A-3' и 5'-GGA GTC TTT CAG CAT GGA GCA A-3'; для vir C: 5-ATC ATT TCA AGT AGC GAC T-3 и 5'-AGC TCA AAC CTG CTT C-3'. Электрофорез проводили в 1,2%-м агарозном геле при напряженности 5 В/см в течение 45 мин в буфере

0,5хТБЕ в присутствии бромистого этидия.

Активность энзимов метаболизма сахарозы. Энзимную фракцию, содержащую СС и инвертазу, выделяли методом, описанным ранее [22]. Растительную ткань (0,5 г) гомогенизировали в буфере А, содержащем

0,05 М Трис-Ж1, рН 7,5, 1мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ и 10 мМ MgC12. После центрифугирования при 20 000 g супернатант фракционировали сульфатом аммония от 0 до 90% насыщения. Осадок растворяли в минимальном объеме буфера А, диализировали 12 ч в том

же буфере, разбавленном в 10 раз. В полученном диализате, содержащем сахарозосинта-зу и растворимую инвертазу, определяли протеины по Лоури. Осадок, оставшийся после центрифугирования клеточного гомо-гената, трижды промывали буфером А, инкубировали 6 ч при 4 °С в буфере, содержащем 1М NaCI, постоянно встряхивая. После солюбилизации протеиновую фракцию диа-лизировали и использовали для определения протеинов и активности инвертазы клеточных стенок.

Активность СС в реакции синтеза сахарозы оценивали по количеству образованной сахарозы в инкубационной смеси, содержащей (мкмоль): Трис-На (рН 7,5) — 50, УДФГ —

1, фруктозу — 3, энзимный препарат — 100 мкл. Активность определяли резорциновим методом Рое [23]. Состав инкубационной смеси (мкмоль) в реакции расщепления сахарозы: цитратный буфер, рН 6,4 — 50, УДФ — 2,5 или АДФ — 5,0, сахароза — 20, энзимный препарат — 100 мкл. Активность энзима СС устанавливали по количеству образованной фруктозы арсеномолибдатным методом [24].

Активность инвертазы определяли по количеству образующихся моносахаров. Для ЦИ использовали инкубационную смесь следующего состава: 1/15 КФ-буфер, рН 7,0 — 50 мкл, сахароза — 20 мкмоль, энзимный препарат — 50 мкл. Для ВИ и ИКС инкубационная среда — 1М ацетатный буфер, рН 4,7 — 50 мкл, сахароза — 20 мкмоль, энзимный препарат — 50 мкл. Содержание сахарозы, моносахаров и крахмала определяли методами, описанными нами ранее [22]. В агробактериальном штамме ночной культуры активность СС и инвертазы, оцениваемая теми же методами, отсутствовала.

При статистической обработке полученных результатов использовали критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Зрелые зерновки инбредной линии кукурузы Л370 получили инокуляцией изолированных пестичных нитей in planta при опылении штаммами LВА4404 (pBi2E) и GV2260 (pCB002), векторные конструкции которых содержали селективный ген nptII — детерминанту устойчивости к антибиотику канамицину, однако различные целевые гены. Для анализируемого нами генотипа необходимая и достаточная концентрация этого антибиотика составляла 50 мг/л. На рис.1 представлены результаты определения амп-ликона гена nptII, синтезированного с сум-

марной ДНК кукурузы, выделенной из зрелых зерновок и листьев растений, где его ожидаемый размер составлял 649 п. н.

Результаты ПЦР-анализа свидетельствуют о том, что при произвольной выборке в зерновках и в листьях растений, устойчивых к канамицину, осуществляется перенос Т-ДНК в клетки и, наиболее вероятно, ее интеграция в ядерный геном кукурузы. Однако в некоторых случаях, несмотря на наличие гена nptII (рис.1, дорожка 5, инфицирование GV2260, pCB002), Km-устойчивых растений получено не было. Отсутствие экспрессии гена nptII, по-видимому, обусловлено его эпигенетическим сайленсингом. Согласно результатам ПЦР-анализа, где в качестве маркера использовали гены virDl и virC штаммов GV2260 и LВА4404 соответственно, в клетках зерновок и в листьях растений отсутствовали агробак-териальные примеси (данные не приведены). Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения оптимизированного нами способа Agrobacterium-опосредованной трансформации генеративных тканей кукурузы in planta для интродукции рекомбинантных молекул ДНК.

Другая сторона процесса трансгенеза

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК инбредной линии кукурузы Л370, инфицированной in planta, с использованием праймеров к гену nptII:

1 — ДНК зерновок контрольных (нетрансформи-рованных) растений;

2 и 3 — ДНК зерновок растений, инфицированных штаммами GV2260 (pCB002) и LВА4404 (pBi2E) соответственно;

4 и 5 — ДНК листьев растений, соответственно устойчивых и неустойчивых к селективной концентрации канамицина (GV2260, pCB002);

6 и 7 — ДНК листьев растений, соответственно устойчивых и неустойчивых к селективной концентрации канамицина ^ВА4404, pBi2E);

8 — маркер молекулярных масс — ДНК бактериофага X, гидролизированная Hind III;

9 — негативный контроль — те же условия амплификации без ДНК.

Стрелкой указан ампликон, ожидаемый размер которого составляет 649 п. н.

связана с изучением влияния агробактери-альных штаммов, содержащих различные целевые гены, на углеводный обмен. У кукурузы крахмал и сахароза, образованные в процессе эмбриогенеза, не только используются как источник углерода и энергии в биосинтетических процессах на ранних этапах онтогенеза, но и являются важнейшими запасными веществами зрелых зерновок. Согласно данным литературы [25], на функционирование энзимов метаболизма сахарозы могут оказывать влияние биотические стрессоры. Следует отметить, что ЛдгоЬа^епит tumifaciens — патоген, который может приводить к изменениям в метаболизме инфицированных клеток, вплоть до их программированной гибели. Последнее, в частности, установлено для клеток каллуса кукурузы, трансформированных штаммом LВА4404 (pAL4404) [26]. Ответная реакция клеток кукурузы на агробактериальную инфекцию т рЬаМа может быть отражением изменений в метаболизме сахарозы непосредственно в инокулированных генеративных тканях, в процессе эмбриогенеза, при прорастании зерновок, а также в ходе дальнейшего роста и развития. Поскольку сахароза и гексозы принимают участие в контроле многих физиологических процессов, в том числе прорастания, ското- и фотоморфогенеза, изучали их метаболизм на ранних этапах онтогенеза кукурузы. В табл. 1 и на рис. 2 представлены результаты исследования активности сахарозосинтазы, осуществляющей как расщепление сахарозы, так и ее синтез в побегах 9-суточных этиолированных проростков.

Расщепление сахарозы СС, в результате которого образуются нуклеозиддифосфатса-хара и фруктоза, проведено нами с двумя субстратами — АДФ и УДФ в концентрациях, соответствующих максимальной скорости реакции. В контроле и в побегах п^П-со-держащих этиолированных проростков расщепление сахарозы осуществлялось интенсивнее с АДФ. Вместе с тем независимо от используемого штамма наблюдалось снижение как удельной, так и общей активности энзима, причем больший уровень ингибирования отмечен при инокуляции генеративных тканей растений кукурузы штаммом LВА4404 (pBi2E). В частности, снижение общей активности для этого штамма происходило соответственно с УДФ и с АДФ на 51% и 61%, а удельной — на 33% и 46%.

Таблица 1. Удельная активность СС в побегах 9-суточных этиолированных проростков кукурузы,

содержащих ген nptII

Вариант Расщепление сахарозы, мкмоль фруктозы на мг протеина в час Синтез сахарозы, мкмоль на мг протеина в час Синтез/ расщепление

УДФ АДФ

Контроль 4,2±0,4* 14,6±1,0* 3,9±0,01* 0,93

LВА4404 (pBi2E) 2,8±0,2** 7,9±0,01** 4,3±0,1* 1,54

GV2260 (pCB002) 3,8±0,5** 10,6±0,6** 4,0±0,2 1,05

Примечание: различия достоверны по сравнению с контролем (*) и между вариантами (**).

%

120

100

80

60

40

20

0

Шконтр оль ■ LBA4404

□ GV2260

а б а б а б

С УДФ С АДФ

Рис. 2. Относительные значения удельной (а) и общей (б) активности СС:

I — в реакции расщепления с субстратами УДФ и АДФ, II — в реакции синтеза сахарозы в побегах 9-суточных этиолированных проростков, полученных после инфицирования in р1аМа генеративных тканей штаммами СУ2260 (рСВ002) и ЬВА4404 (pBi2E), % от контроля

Следовательно, при агробактериальной инфекции уменьшается количество образованных УДФГ и АДФГ, что может приводить к снижению синтеза клеточных биополимеров, для которых они являются субстратами.

Что касается активности СС в реакции синтеза сахарозы, то ответная реакция на инфицирование агробактериальными штаммами не столь однозначно выражена. Так, удельная активность энзима при использовании LВА4404 (pBi2E) хотя и незначительно (на 10%), но достоверно повышалась, а GV2260 фСВ002) — оставалась на уровне контроля, в то время как общая — на 21% и 28%, соответственно, снижалась. При этом отношение значений в реакциях синтез:рас-щепление сахарозы для первого штамма увеличивалось в 1,54 раза, а для второго — достоверно не отличалось от контроля, т. е. под влиянием LВА4404 (pBi2E) синтетическая направленность сахарозосинтазы преобладала над реакцией расщепления. Поскольку известно, что сахароза может быть регуляторным фактором, определяющим уровень олигомеризации и локализации

протеина СС в клетке [18], различное влияние анализируемых штаммов на направленность реакции СС может быть отражением вариабельности функционирующих изоформ энзима.

Другим путем включения сахарозы в метаболизм является ее гидролиз инвертазой с последующим использованием моносахаров в процессах гликолиза и дыхания. В отличие от СС, инвертаза необратимо катализирует реакцию, в результате которой образуются две гексозы; они к тому же могут быть потенциальными сигнальными/регуляторными молекулами. На рис. 3 и в табл.

2 представлены результаты сравнительного изучения активности трех форм инвертазы в побегах 9-суточных этиолированных проростков. В побегах проростков, содержащих nptП, наблюдалось снижение удельной и общей активности ВИ, общей активности ЦИ, причем более интенсивное ингибирование так же, как и для СС (в реакции расщепления), отмечено для штамма LВА4404 (pBi2E). Удельная же активность ЦИ поддерживалась практически на неизменном уровне для обоих анализируемых штаммов. В то же время для ИКС наряду со значительным снижением удельной активности достоверное уменьшение (на 25%) общей активности происходило только при использовании LВА4404 (pBi2E). Следует отметить, что на ранних этапах онтогенеза среди разных форм инвертазы в контроле и под влиянием анализируемых агробактериальных штаммов наиболее активна ВИ, активность ИКС и ЦИ в 2-5 раз ниже.

Наблюдаемые вариации в общей активности энзимов СС и инвертазы в побегах nptП-содержащих этиолированных проростков могут быть отражением изменений в содержании легкорастворимых протеинов и протеинов клеточных стенок (табл. 3). Так, количество легкорастворимых протеинов уменьшалось, тогда как протеинов клеточных стенок — повышалось. Вариабельность общей активности СС, инвертазы

Таблица 2. Удельная активность инвертазы (мкмоль фруктозы на мг протеина в час) в побегах 9-суточных этиолированных проростков кукурузы, содержащих ген

Таблица 3. Содержание углеводов и протеинов в побегах 9-суточных этиолированных проростков

Вариант ВИ ЦИ ИКС

Контроль 25,5±2,2* 4,8±0,01 11,2±0,1*

LВА4404 (рВі2Е) 17,5±2,2* 4,3±0,1 6,7±0,5*

GV2260 (рСВ002) 21,8±0,8* 5,0±0,01 5,8±0,1*

Примечание: * — различия достоверны по сравнению с контролем.

%

120

100

80

60

40

20

0

□ контроль ■ 1_ВА4404

□ (342260

а б а

б

б

Рис. 3. Относительные значения удельной (а) и общей (б) активности инвертазы:

I — ВИ, II — ЦИ, III — ИКС в побегах 9-суточных этиолированных проростков, полученных после инфицирования генеративных тканей штаммами GV2260 (pCB002) и ЬВА4404 (pBi2E), % от контроля

и содержания протеинов позволяет предположить, что агробактериальная инфекция оказывает влияние не только на функционирование разных форм энзимов, но и на процесс их биосинтеза. В то же время ингибирование удельной активности может свидетельствовать об опосредованном влиянии агробакте-риальной инфекции на свойства исследуемых энзимов.

Изменения в функционировании энзимов метаболизма сахарозы в анализированных нефотосинтетических тканях nptП-содержа-щих проростков сопровождались и различиями в накоплении углеводов (табл. 3).

Под влиянием обоих штаммов происходило уменьшение количества крахмала на 12-20%. В то же время отмечено варьирование в содержании моносахаров и сахарозы. В результате инфицирования штаммом СУ2260 (pCB002) количество гексоз незначительно уменьшалось, а сахарозы — увеличивалось, а для LВА4404 (pBi2E) наблюдалась обратная зависимость. По сравнению с контролем отношение моносахаров к саха-

Углеводы, мкмоль на 1 г сухой ткани Контроль Ь,ВА4404 (рВі2Е) ОУ2260 (рСВ002)

Моносахара 83,5±1,7* 100 90,3±0,9** 108 73,3±1,1** 88

Сахароза 22,5±0,4* 100 22,0±0,5** 93 24,8±0,9** 110

Крахмал 9,9±0,2* 100 8,7±0,3** 88 7,9±0,2** 80

Моносахара/ Сахароза 3,7 4,2 2,9

Протеины, мг на 1 г ткани

Легкораст- воримые 6,35±0,15* 4,65±0,20* 4,50±0,30*

Клеточных стенок 1,00±0,10* 1,25±0,05** 1,65±0,05**

Примечание: * — различия достоверны по сравнению с контролем; ** — различия достоверны между вариантами и контролем.

розе для последнего штамма было большим, а для СУ2260 (pCB002) — меньшим, следовательно, изменялся баланс гексоз, принимающих участие в метаболических процессах. Поскольку под влиянием LВА4404 (pBi2E) для СС характерна биосинтетическая направленность реакции и большее, чем для другого штамма, снижение общей активности кислой и щелочной форм инверта-зы, то превышение количества гексоз, вероятнее всего, связано с меньшей скоростью их включения в дальнейший метаболизм. Отметим, что разница в количестве глюкозы и сахарозы установлена в ответ на инфицирование листьев Brassica гара обезоруженным и онкогенными штаммами разного типа [27].

Инфицирование обезоруженными агро-бактериальными штаммами трЬаМа оказывало различное влияние на метаболизм сахарозы и в ходе фотоморфогенеза, когда синтез этого энергетически обогащенного дисахарида в отличие от этиолированных проростков осуществляется сахарозофосфатсинта-зой в листьях. На рис. 4 представлены относительные значения удельной и общей активности СС и инвертазы изучаемых штаммов (СУ2260 к LВА4404) в листьях 20дневных Кт-устойчивых растений. Что касается СС, то ее удельная активность как в реакции синтеза, так и расщепления сахарозы между обоими штаммами не отличалась, в то время как общая активность Кт-устойчивых растений, инфицированных

а

LВА4404 (pBi2E), была на 24-26% выше. Это можно объяснить повышенным содержанием фракции легкорастворимых протеинов (табл. 4). Более того, в фотосинтетических тканях независимо от штаммов наблюдалась почти двукратная стимуляция активности СС в реакции расщепления по сравнению с этиолированными проростками.

Рис. 4. Соотношение активности энзимов метаболизма сахарозы (ОУ2260, рСВ002 к ЬВА4404, рЫ2Е) в листьях 20-дневных Кт-устойчивых растений кукурузы, инфицированной т planta:

1 — СС (расщепление); 2 — СС (синтез) сахарозы; 3 — ВИ; 4 — ЦИ; 5 — ИКС

Существенные различия отмечены в функционировании ВИ и ЦИ. Их удельная активность соответственно в 2,5 и 3,5 раза, а общая — в 2 и 2,7 раза была выше с использованием СУ2260 (pCB002) по сравнению с LВА4404 (pBi2E). В то же время удельная активность ИКС для первого штамма, хотя и незначительно, повышалась, а общая активность — снижалась.

Следует отметить, что в побегах 9-суточных этиолированных проростков также происходила стимуляция общей и удельной активности ВИ, ЦИ при инфицировании СУ2260 (pCB002), хотя эти изменения были не столь существенны (не более чем в 1,25 раза). Однако абсолютные значения активности кислых форм инвертазы, особенно ва-куолярной, под влиянием обоих штаммов в гетеротрофных тканях были в несколько раз выше, чем в фотосинтетических, а щелочной — уменьшались только при использовании LВА4404 (pBi2E).

В листьях 20-суточных Кт-устойчивых растений наблюдались различия и в содержании углеводов (табл. 4). Независимо от используемого штамма происходило снижение в содержании сахарозы, крахмала и моносахаров, причем большая разница отмечена при использовании СУ2260 (pCB002).

Тем не менее, соотношение моносахаров к сахарозе в Кт-устойчивых растениях в 4 раза превышало контроль, но между анализируемыми вариантами не отличалось, т. е. у них устанавливался одинаковый баланс гексоз и сахарозы. Вместе с тем в этиолированных проростках и в контроле, и в nptП-со-держащих побегах моносахара существенно превышали количество сахарозы.

Таблица 4. Содержание углеводов и протеинов в листьях 20-суточных Кт-устойчивых растений кукурузы

Углеводы, мкмоль на 1 г сухой ткани Контроль ЬВА4404 (рВі2Е) ОУ2260 (рСВ002)

Моносахара 121,4±3,0* 100 112,2±0,4* 92,4 91,6±1,6* 75,4

Сахароза 335,6±12,7* 100 77,6±1,0* 23 63,0±0,1* 19

Крахмал 20,6±1,6* 100 12,8±0,4* 62 8,4±0,3* 41

Моносахара/ Сахароза 0,36 1,45 1,45

Протеины, мг на 1 г ткани

Легкораст- воримые 5,4±0,2* 9,3±0,3** 7,5±0,8**

Клеточных стенок 1,4±0,2 1,2±0,2** 0,8±0,1**

Примечание:* — различия достоверны между контролем; ** — различия достоверны между вариантами и контролем.

Полученные данные свидетельствуют

о различном влиянии обезоруженных агро-бактериальных штаммов на функционирование энзимов синтеза и включения сахарозы в метаболизм на ранних этапах онтогенеза кукурузы.

Согласно данным литературы, избыток гексоз может генерировать вакуолярная ин-вертаза, где преимущественно происходит гидролиз сахарозы в процессе роста и развития. Из-за низкой активности ЦИ образуется ограниченное количество гексоз как сигнальных/регуляторных молекул, и эту функцию приписывают ИКС [14]. Вариабельность баланса сахарозы и продуктов ее гидролиза/расщепления в гетеротрофных и фотосинтетических тканях, где в ответ на инфицирование кукурузы т рЬа^а в целом происходило повышение содержания гексоз, была отражением изменений в активности энзимов метаболизма сахарозы, которые зависели от используемого штамма. В побегах 9-суточных этиолированных про-

ростков кукурузы, содержащих селективый ген прШ, при установлении баланса сахаров расщепление сахарозы шло более интенсивно с образованием АДФГ, а ее гидролиз осуществлялся преимущественно кислыми формами инвертазы — ВИ и ИКС. В листьях Кт-устойчивых 20-суточных растений расщепление сахарозы происходило главным образом за счет СС, поскольку активность всех форм инвертазы, особенно ИКС, была низкой. Синтетическая направленность СС также была низкой, а высокий уровень сахарозы обеспечивается функционированием сахарозофосфатсинтазы — основного энзима ее синтеза в фотосинтезирующих тканях. Агробактериальная инфекция приводила к существенному снижению сахарозы, что позволяет предположить ее влияние и на этот энзим.

Остается открытым вопрос, каким образом инфицирование генеративных тканей кукурузы т рЬа^а после прорастания зерновок, содержащих селективый ген прШ, приводит к изменениям в метаболизме углеводов в процессе ското- и фотоморфогенеза. Вполне вероятно, что это может быть связано с генетическим уровнем регуляции и участием в этом процессе глюкозы как сигнальной и/или регуляторной молекулы. Влияние агробактериальной инфекции на метаболизм в онтогенезе растений может быть вызвано различными причинами. Во-первых, сам процесс трансформации, даже с использованием обезоруженных штаммов, рассматривается как взаимодействие патоген-хозяин. Хотя считается, что А. tumefa-слабо активирует комплекс защитных реакций в растениях, У^-протеины могут супрессировать иммунную систему хозяина, и уже на ранних этапах инфицирования происходит значительное перепрограммирование экспрессии генов в растительных клетках, необходимых не только для Agrobacterium-опосредованной трансформации, но и деления, роста клеток, метаболизма [8, 28, 29]. Во-вторых, изменения метаболизма могут быть связаны с экспрессией целевых генов — как локально в местах обработки растений агробактерией, так и в ходе их дальнейшего развития. В частности, штамм LВА4404 несет конструкцию pBi2E — супрессор гена пролиндегидрогеназы, функционирование которого основано на РНК-интерференции. Ингибирование пролиндегидрогеназы вероятнее всего является частичным, поскольку активность дцРНК-супрессоров зависит от их комплементар-ности мРНК гена-мишени. Это может приво-

дить, как было показано для Nicotiana tabacum, к увеличению уровня в содержании пролина, к повышению осмотического давления клеточного сока и уровня устойчивости к стрессовым воздействиям [30, 31].

Итак, при инфицировании генеративных тканей т рЬа^а обезоруженными штаммами АдгоЬа^епит tumefaciens — СУ2260 (pCB002) и LВА4404 (pBi2E) — на ранних этапах онтогенеза кукурузы наблюдали изменения активности энзимов углеводного метаболизма. Показана тканеспецифич-ность функционирования сахарозосинтазы и инвертазы. В побегах 9-суточных этиолированных проростков оба штамма приводили к ингибированию активности энзимов гидролиза и расщепления сахарозы: кислой и щелочной форм инвертазы (за исключением удельной активности ЦИ), а также СС в реакциях с УДФ и с АДФ. Однако в реакции синтеза сахарозы наблюдается превышение активности СС для LВА4404 (pBi2E) по сравнению с СУ2260 (pCB002) и даже стимуляция ее удельной активности относительно контроля. В целом, аналогичная ответная реакция на инфицирование используемыми агробактериальными штаммами характерна для энзимов метаболизма сахарозы и в листьях 20-суточных растений. Тем не менее, отличительная черта тканей при фотоморфогенезе — значительное увеличение активности ВИ и ЦИ под влиянием СУ2260 (pCB002). Наиболее сильный негативный эффект на активность энзимов гидролиза и расщепления сахарозы на ранних этапах онтогенеза оказывает штамм LВА4404 (pBi2E). Изменение в активности энзимов в онтогенезе кукурузы сопровождались варьированием содержания моносахаров, сахарозы, крахмала, а также протеинов.

Таким образом, в ответ на инфицирование генеративных тканей т рЬакЬа обезоруженными штаммами Agrobacterium tumefaciens — СУ2260 (pCB002) и LВА4404 (pBi2E) — установлены изменения в активности энзимов метаболизма сахарозы на ранних этапах онтогенеза кукурузы.

Показана тканеспецифичность функционирования вакуолярной, цитоплазматической инвертазы, инвертазы клеточных стенок, сахарозосинтазы, а также изменения в балансе сахарозы и гексоз в процессе ското-и фотоморфогенеза.

Установлено различное влияние штаммов Agrobacterium tumеfaciens СУ2260 (pCB002) и LВА4404 (pBi2E) на метаболизм сахарозы и продуктов ее гидролиза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Gelvin S. B. Agrobacterium-Mediated plant Transformation: the Biology behind the «Gene-Jockeying» Tool // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 2003. — V. 67. — P. 16-37.

2. Iyer L. M., Kumpatla S. P., Chandrasekhan M. B., Hall T. C. Transgene silencing in monocots // Plant Mol. Biol. — 2000. — V. 43. — P. 323-346.

3. Shou H., Frame B. R, Whitham S. A., Wang K. Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium — mediated transformation // Mol. Breed. — 2004. — V. 13. — P. 201-208.

4. Gao R., Lynn D. G. Environmental pH sensing: resolving the VirA/VirG two-component system inputs for Agrobacterium pathogenesis // J. Bacteriol. — 2005. — V. 187. — Р. 2182-2189.

5. He F., Nair G. R., Soto C. S. et al. Molecular basis of ChvE function in sugar binding, sugar utilization, and virulence in Agrobacterium tumifaciens // Ibid. — 2009. — V. 191, N 18. — P. 5802-5813.

6. Shimoda N., Toyota-Yamamoto A., Nagamine J. et al. Control of expression of Agrobacterium vir genes by synergistic actions of phenolic signal molecules and monosaccharides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1990. — V. 87. — P. 6684-6688.

7. Yuan Z.-C., Liu P., Saenkham P. et al. Transc-riptome Profiling and Functional Analysis of Agrobacterium tumifaciens Reveals a General Conserved Response to Acidic Conditions (pH 5.5) and a Complex Acid-Mediated Signaling Involved in Agrobacterium-Plant Interactions // J. Bacteriol. — 2008. — V. 190. — P. 494-507.

8. Pitzschke A., Hirt H. New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation // EMBO J. — 2010. — V. 29. — P. 1021-1032.

9. Koch K. Sucrose metabolism: regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development // Cur. Opin. Plant Biol. — 2004. — V. 7. — P. 235-248.

10. Сакало В. Д. Регуляция метаболизма сахарозы у свёклы и других культур. — К.: Логос, 2006. — 248 c.

11. Матвеева А. Ю., Сакало В. Д., Курчий В. М., Тищенко Е. Н. Активность сахарозосинта-зы и инвертазы морфогенного и неморфогенного каллусов, полученных из незрелых зародышей кукурузы (Zea mays L.), инфицированных Agrobacterium tumefa-ciens // В^н. Укр. т-ва генет. селекц. — 2010. — Т. 8, № 1. — С. 18-24.

12. Baud S., Vaultier M.-N., Rochat C. Structure and expression profile of the sucrose syntase multigene family in Arabidopsis // J. Exp. Bot. — 2004. — V. 55, N 396. — P. 397-409.

13. Subbaian C. C., Palaniappan A., Duncan K. et al. Mitochondrial localization and putative signaling function of sucrose synthase in maize // J. Biol. Chem. — 2006. — V. 281, N 4. — P.15625-15635.

14. Cheng W-H., Tallercioe E. W., Chourey P. S. Sugar modulate in unusual mode of control of the cell-wall invertase gene (Incw 1) through its 3' untrahslated region in cell suspension culture of maize // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — V. 96. — P. 10512-10517.

15. Jain M., Chourey P. S., Qin-Bao Li, Pring D. R. Expression of cell wall invertase and several other genes of sugar metabolism in relation to seed development in sorghum (Sorghum bicolor) // J. Plant Physiol. — 2008. — V. 165, N 3. — P. 331-344.

16. Ye Jin, Di-An Ni, Yong-Ling Ruan. Post-translational elevation of cell wall invertase activity by silencing its inhibitor in tomato delays leaf senescence and increases seed weight and fruit hexose level // The Plant Cell. — 2009. — V. 21. — P. 2072-2089.

17. Huang L.-F., Bocock P.N., Davis J. M., KochK. E. Regulation of invertase: a ‘suite’ of transcriptional and post- transcriptional mechanisms // Func. Plant Biol. — 2007. — N 34. — P. 499-504.

18. Duncan K. A., Heber S. C. Sucrose syntase oligomerization and F-actin association are regulated by sucrose concentration and phosphorylation // Plant Cell Physiol. — 2007. — V. 48, N 11. — P.1612-1623.

19. Hardin S. C., Duncan K. A., Heber S. C. Determination of structural requirement and probable regulation effectors for membrane association of maize sucrose synthase 1 // Plant Physiol. — 2006. — V. 141, N 3. — P. 1106-1119.

20. Чумаков М. И., Рожок Н. А., Великов В. А. и др. Трансформация кукурузы путем инокуляции агробактериями пестичных нитей in planta // Генетика. — 2006. — Т. 42, № 8. — С.1083-1088.

21. Дрейпер Дж., Скотт Р. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. — М.: Мир, 1991. — 408 c.

22. Сакало В. Д., Курчий В. М. Активність са-харозосинтази та інвертази в етіольован-них проростках кукурудзи за дії стресових чинників // Физиол. биохим. культ. раст. — 2009. — Т. 41, № 5. — С. 400-407.

23. Roe J. H. A colorimetric method for the determination of fructose in blood and urine // J. Biol. Chem. — 1934. — V. 107, N 1. — P. 15-22.

24. Somogyi M. Notes on sugar determination // Ibid. — 1952. — V. 195, N 1. — P. 18-23.

25. Sturm A., Tang G.-Q. The sucrose-cleaving enzymes of plants are crucial for development, growth and carbon partitioning // Trend. Plant Sci. — 1999. — V. 11. — P. 707-726.

26. Hansen G. Evidence for Agrobacterium-induced Apoptosis in maize cells // MPMI. — 2000. — V. 13, N 6. — P. 649-657.

27. Simoh S., Quitana N., Kim H. K. et al. Metabolic changes in Agrobacterium tumefaciencens-infected Brassica rapa // J. Plant Physiol. — 2009. — V. 166, N 10. — P. 1005-1014.

28. Veena, Hongmei Jang, Doerge R. W., Gelvin S. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciencens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression // Plant J. — 2003. — V. 35. — P. 219-236.

29. Lee C.-W., Efetova M., Engelmann J. C. et al. Agrobacterium tumefaciencens Promotes Tumor Induction by Modulating Pathogen Defense in Arabidopsis thaliana // The Plant Cell. — 2009. — V. 21. — P. 2948-2962.

30. Колодяжная Я. С., Титов С. Е., Кочетов А. В. и др. Оценка солеустойчивости растений табака Nicotiana tabacum, несущих антисмыс-ловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. — 2006. — № 42. — С. 278-281.

31. Колодяжная Я. С., Титов С. Е., Кочетов А. В. и др. Трансформанты табака, экспрессирующие антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы, проявляют устойчивость к тяжелым металлам // Там же. — 2007. — № 43. — С. 994-998.

МЕТАБОЛІЗМ САХАРОЗИ НА РАННІХ ЕТАПАХ ОНТОГЕНЕЗУ КУКУРУДЗИ (Zea mays L.), ТРАНСФОРМОВАНОЇ in planta ОБЕЗЗБРОЄНИМИ ШТАМАМИ

Agrobacterium tumefaciens

О. М. Тищенко1, В. Д. Сакало1,

О. Ю. Матвєєва1, В. М. Курчій1,

Б. В. Моргун2, О. В. Кочетов3

1Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ

2Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ

3Інститут цитології та генетики Сибірського відділення РАН, Новосибірськ

E-mail: [email protected]

Проведено порівняльний аналіз активності ензимів вуглеводного метаболізму інбредної лінії кукурудзи Л370, трансформованої in plan-ta за допомогою агробактеріальних штамів LВА4404 й GV2260, які містять векторні конструкції відповідно pBi2E та pCB002. Показано специфічність функціонування вакуоляр-ної, цитоплазматичної інвертази, інвертази клітинних стінок і сахарозосинтази (СС), зміни у вмісті сахарози, моноцукрів, крохмалю, протеїнів у пагонах 9-денних етіольованих проростків та в листках 20-денних рослин. Більший інгібуючий ефект на активність ензимів гідролізу і розщеплення сахарози здійснює штам LВА4404 (pBi2E). Поряд із цим у реакції синтезу дисахариду варіювання у функціонуванні СС між використаними штамами є ткани-носпецифічним і пов’язано як зі зниженням, так і з підвищенням її активності. Отримані дані свідчать про різний вплив обеззброєних аг-робактеріальних штамів на функціонування ензимів, які включають у метаболізм сахарозу, та на баланс гексоз і сахарози.

Ключові слова: кукурудза (Zea mays L.), Agrobacterium-опосередкована трансфор-

мація, інвертаза, сахарозосинтаза, вуглеводи.

METABOLISM OF SUCROSE AT THE EARLY STAGES OF ONTOGENESIS OF Zea mays L. TRANSFORMATED in planta BY DISARMED STRAINS Agrobacterium tumefaciens

E. N. Tishchenko1, V. D. Sacalo1,

A. Yu. Matveyeva1, V. M. Kurchiy1,

B. V. Morgun2, A. V. Kochetov3

institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv

2Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv

3Institute of Cytology and Genetics of Russian Academy of Science, Novosibirsk

E-mail: [email protected]

Comparative study of carbohydrate metabolizing enzymes activity of maize inbred line L370 transformed in planta with Agrobacterial strains of LBA4404 and GV2260 harboring vector constructions pBi2E and pCB002 respectively was done. The specificity of functioning of vacuolar, cytoplasmic, cell wall invertases and sucrose synthase (SS) and changes in sucrose, monosaccharides, starch and proteins content at the shoots of 9 day etiolated seedlings and in the leaves of 20 day plants were shown as well. Strain LBA4404 (pBi2E) showed some larger inhibitive effect on hydrolysis and cleavage sucrose. At the same time variation in SS functioning in disaccharide synthesis reaction between two applied strains was tissue-specific and was concerned both with declining and rising SS activity. Received data indicate on different influence of disarmed agrobacterial strains on enzyme functioning that include sucrose metabolism and on the hexoses and sucrose balance as well.

Key words: maize (Zea mays L.), Agrobacterium-mediated transformation, invertase, sucrose synthase, carbohydrate.