CC BY
108
УДК 579.254.2
ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА В РАСТЕНИЯХ КУКУРУЗЫ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ IN PLANTA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ LBA4404, НЕСУЩЕГО pBi2E С ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫМ РНК-СУПРЕССОРОМ ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ
©2013 С.И. Михальская1, А.Ю. Матвеева1, Л.Е. Сергеева1, A.B. Кочетов2, E.H. Тищенко1
Институт физиологии растений и генетики HAH Украины, г. Киев, 2Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Поступила 23.05.2013
Получены трансгенные Т1-растения кукурузы (Zea mays L.), содержащие двухцепочечный РНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы. Проанализирован уровень свободного L-пролина в побегах и корнях проростков в условиях сульфатно-хлоридного засоления. Показано, что стресс-устойчивость сопровождается повышением содержания этого осмолита.
Ключевые слова: Zea mays L, солеустойчивостъ, супрессор гена пролиндегидрогеназы, трансгенез.
Метаболическая инженерия предоставила новые возможности для решения проблемы устойчивости культурных растений к осмотическим стрессам. Одно из перспективных её направлений связано с генами, контролирующими метаболизм L-пролина (Pro). Генетические и физиолого-биохимические исследования показали, что L-пролин - полифункциональная аминокислота, которая может принимать участие в сложных интегральных процессах адаптации растений. Развивается также представление о Pro как о сигнальной/регуляторной молекуле в ходе роста, дифференцировки клеток и их программированной гибели [1-6]. Повышение уровня свободного L-пролина - физиологическая реакция многих видов растений в ответ на разные типы абиотических стрессов. Вместе с тем, роль Pro и его участие в процессах адаптации/устойчивости не всегда очевидна, о чём свидетельствуют результаты исследований уровня толерантности трансгенных растений и диких видов растений [2, 7-9].
Эндогенный уровень L-пролина растений в норме и при стрессе координировано регулируется его синтезом, катаболизмом и транспортом [10, 1, 2]. Гены, контролирующие метаболизм Pro, кодируются ядерным геномом, и наиболее детально исследованы у арабидопсиса и табака. Проанализированные на сегодняшний день гены синтеза - P5CS (энзим \'-пиррол ин-5-карбоксилатсинтстаза.
ЕС.2.7.2.11.1.2.1.41) и катаболизма - ProDH (энзим пролиндегидрогеназа, ЕС.1.5.99.8.) ряда растений находятся в центре внимания при разработке молекулярных биотехнологий, направленных на повышение уровня стрессоустойчивости культурных
Михальская Светпана Ивановна, к.б.н., научный сотрудник, e-mail: svetlana_mykhalska(a!mail.ru; Матвеева Апександра Юрьевна, к.б.н., младший научный сотрудник, e-mail: mgi-rais(a!mail.ru; Сергеева Лариса Евгеньевна, к.б.н., старший научный сотрудник; Кочетов Апексей Владимирович, к.б.н., заведущий лабораторией, e-mail: aK(a!bionet.nsc.ru; Тищенко Елена Николаевна, д.б.н., заведующая отделом, e-mail: olty-ко(й! gmail.com
растений. Они представлены единичными копиями с высоким уровнем гомологии, каждая из которых может выполнять различные функции, связанные с ответной реакцией на стресс и/или с пролиферацией, дифференцировкой клеток растений [11, 1, 2]. В связи с чем целесообразен предварительный анализ эффективности их применения для получения биотехнологических продуктов.
Что касается ProDH, то для повышения уровня свободного пролина исследуются возможности частичной супрессии генов, контролирующих катаболизм L-пролина, с использованием векторных конструкций, создаваемых на основе чужеродных генов пролиндегидрогеназы, расположенных в антисмысловой ориентации или в форме обращённо-го повтора. При этом есть основания полагать, что применение siRNA -технологий является более эффективным [5,6, 12, 13].
Целью данной работы был анализ содержания L-пролина в проростках кукурузы, трансформированной in planta с использованием обезоруженного агробактериального штамма ZÄ44404, содержащего плазмиду с двухцепочечным (дц)РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы, в условиях стресса, вызванного сульфатно-хлоридным засолением.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служила инбредная линия кукурузы 250 (селекции Института физиологии растений и генетики HAH Украины), трансформированная in planta с использованием обезоруженного агробактериального штамма ZÄ44404, несущего бинарный вектор pBi2E с дцРНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы, полученным на основе гена арабидопсиса ProDH 1 (рис. 1).
Присутствие трансгена в геноме кукурузы анализировали ПЦР-методом так, как описано ранее [14].
1662
RB
LB
NOSpro nptll NOSterm 35Spro ProDH-exl intl ProDH-exl NOSterm
Рис. 1. Блок-схема Т-ДНК области pBi2E. NOSpro и 35Spro - соответственно промоторы гена нопалинсинтазы и 35S вируса мозаики цветной капусты; ProDH-exl и intl - фрагменты первого экзона и интрона гена ProDHl арабидопсиса, соответственно; NOSterm - сигнал полиаденилирования гена нопалинсинтазы; nptll - ген неоми-цинфосфотрансферазы Е. coli, RB, LB - повторы, ограничивающие Т-область
Уровень свободного L-пролина (Рго) определяли методом Чинарда с модификациями [15]. Для сравнительного анализа использовали 14-, 18- и 21-суточные проростки. Пробы отбирали и фиксировали в одно и то же время суток. Стрессовые условия создавали добавлением в среду культивирования летальные дозы солей морской воды (2,0% и 2,5%). Стрессовому воздействию подвергали 7-суточные проростки, выращенные в нормальных условиях (1 вариант), и зерновки, проращиваемые и культивируемые в стрессовых условиях в течение 28 дней (2 вариант). Содержания Рго определяли в корнях и побегах 18-суточных трансгенных проростков, полученных при проращивании зерновок (по 8 штук), взятых из 6-ти разных початков. Контролем служили побеги или корни нетрансгенных вариантов в нормальных/стрессовых условиях. При статистической обработке использовали критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для углубления представления о роли генов ProDH в процессах адаптации и жизнедеятельности кукурузы исследовали содержание свободного L-пролина в проростках кукурузы, трансформированной in planta с применением LBA4404, несущего
плазмиду с дцРНК-супрессором гена пролиндегид-рогеназы, в условиях засоления, приводившего к гибели контрольных (нетрансгенных) вариантов. Параллельно, такой подход позволяет проанализировать эффективность частичной супрессии генов ProDH кукурузы с использованием siRNA-технологий.
На рис. 2 представлены результаты содержания свободного Pro в побегах проростков, адаптированных к засолению (общий возраст проростков 14 суток, вариант 1). Видно, что уровень этой аминокислоты у ряда индивидуальных трансгенных вариантов варьировал, однако по абсолютной величине, за исключением трёх случаев, существенно превышал содержание Pro в проростках контрольных побегов. По-видимому, в вариантах V, VI и XI трансген был нефункциональным или уровень его транскрипции был незначительным. Полученные данные дают основание предполагать, что эта аминокислота выступает в качестве протектора при адаптации к ионному стрессу. Отметим, что повышение уровня свободного пролина у трансгенных растений кукурузы, содержащих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, на фоне хло-ридного засоления ранее показано Моисеевой Е.М. исоавт. [15].
600
500
400
i
ü 300
1—
S 200
s
о
'ь. О. 100
о
I
7 14 дм дн Контроль
Варианты
Рис. 2. Содержание свободного Ь-пролина в побегах адаптировавшихся к сульфатно-хлоридному засолению (2,0% солей морской воды) 14-суточных проростков кукурузы (1 - XI). Контроль: 7 сут в нормальных условиях и через 7 сут в условиях стресса
Зерновки трансгенных растений кукурузы характеризовались также способностью к прорастанию в условиях постоянного действия стрессового фактора (вариант 2). Их проращивали сначала на фоне 2,0% засоления (летальная доза стрессора), затем 7-суточные проростки переносили в более жёсткие условия стресса (2,5% солей морской во-
ды) и культивировали ещё 2 недели. Рис. 3 отображает содержание свободного пролина в 21-суточных проростках. Видно, что в условиях стресса уровень Pro существенно превышал показатель контроля. Это свидетельствует в пользу того, что этот осмолит является одним из факторов, принимающих участие в поддержании жизнедеятельно-
1663
Рис. 3. Содержание свободного Ь-пролина в побегах 21-суточных проростков, культивируемых в условиях возрастающего сульфатно-хлоридного засоления (последовательно 2,0% и 2.5% солей морской воды). К - побеги нетрансгенных 7-суточных проростков в условиях стресса (2,0% солей морской воды)
Рис. 4. Содержание свободного Ь-пролина в корнях и побегах 18-суточных трансгенных проростков, которые культивировались в условиях постоянного действия сульфатно-хлоридного засоления (2,5% солей морской воды). К - побеги трансгенных проростков в отсутствие стресса
сти кукурузы в стрессовых условиях. Очевидно, что уровень свободного пролина является результатом координированного функционирования системы синтеза - катаболизма.
Сравнительное изучение содержания свободного Pro в побегах и в корнях 18-суточных трансгенных проростков показало, что уровень его накопления в корнях превышал этот показатель в побегах, как в норме, так и в условиях стресса (рис. 4). Наблюдаемые различия в нормальных условиях культивирования трансгенных проростков свидетельствуют о тканеспецифичности аккумуляции этой аминокислоты. Следует отметить, что в контрольных вариантах (дикий тип) уже на 14-й день опыта содержание пролина составляло в побегах (138,66 ± 30,41 мг%/г с.м.), корнях (146,63 ± 19,86 мг%/г с.м.) и достоверно не различалось. Далее продолжалась прогрессирующая гибель контроля. Высокие показатели уровня пролина в данном случае, очевидно, являлись отражением деградации пролин-содержащих компартментов клеток. Эти результаты согласуются с литературными данными [16, 17]. При летальных дозах сульфатно-хлоридного засоления у трансформантов по сравнению с контролем (трансгенные проростки) про-
исходило существенное увеличение содержания свободного пролина. Больший уровень аккумуляции этой аминокислоты в корнях, возможно, являлся отражением депонирования токсичных ионов.
Таким образом, солеустойчивость трансформантов, содержащих двухцепочечный РНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы кукурузы, сопровождался аккумуляцией свободного L-пролина.
Работа поддержана грантом совместных научных проектов НАН Украины (16-05-2012) - СО 'РАН (№11)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kavi Kishor Р.В., Sangani S., Amnitha R.N. et al. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implication in plant growth and abiotic stress tolerance // Current Sci. 2005. V. 88. N 3. P. 424438.
2. Szabados L, Savoare A. Proline: a multifunctional amino acid // Trends in plant science. 2009. V.15. N2. P. 89- 97.
3. MaggioA, Miyazaki S., Veronese P. et al. Does proline accumulation play an active role in stress-induced growth reduction? // The Plant Journal. 2002. V. 3. N 16. P. 699-712.
4. Cecchini NM, Monteoliva MI, Alvarez ME. Proline dehydrogenase is a positive regulator of cell death in different kingdoms // Plant Signal Behav. 2011. V. 6. N 8. P. 11951197.
1664
5. Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С. и др. Повышение содержания пролина и осмотического давле- ния клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т. 40. № 2. С. 282-285.
6. Ибрагимова С.С., Колодяжная Я.С., Герасимова С.В., Кочетов А.В. Частичная супрессия гена пролиндегидрогеназы увеличивает устойчивость растений к различным видам абиотических стрессов // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 99-107.
7. Mani S., Van de Cotte В, Van Montagu M, Verbniggen N. Altered levels of proline dehydrogenase cause hypersensitivity to proline and its analogs in Arabidopsis // Plant Physiology. 2002. V. 128. P. 73-83.
8. Kaplan F, Kopka J, Sung DY et al. Transcript and metabolite profiling during cold acclimation of Arabidopsis reveals an intricate relationship of cold-regulated gene expression with modifications in metabolite content // Plant J. 2007. V. 50. P. 967-981.
9. Sharnta S. Villamor J. G., P. E. Verslues. Essential role of tissue-specific proline synthesis and catabolism in growth and redox balance at low water potential // Plant Physiology. 2011. V. 157. P. 292-304.
10. Peng Z., Lu O., Verna D.P. Reciprocal regulation of delta 1-pirroline-5-carboxylate syntetase and proline dehydrogenase genes controls proline levels during and after osmotic stress in plants//Mol. Gen. Genet. 1996. N3. P. 334-341.
11. Miller G., Stein H., Honig A. et al. Responsive modes of Medicago sativa proline dehydrogenase genes dining salt stress and recovery dictate proline accumulation // Planta. 2005. V. 222/N1. P. 70-79.
12. Титов C.E. Изучение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирую-
щих антисмысловой супрессор гена пролинденидроге-назы: Автореф. дисс. ...канд. биол. наук. Новосибирск, 2008. 16 с.
13. Tateishi Г., Nakagama Т., Esaka М. Osmotolerance and growth stimulation of transgenic tobacco cells accumulating free proline by dehydrogenase expression with double-stranded RNA interference technique // Physiologia Planta-rum. 2005. 125. P.1399-3054.
14. Михальская СЛ., Адаменко H.IL, Моргун Б.В. и др. Компетентность к Agrobacterium-ouocpejspBamiovL трансформации сегментов побега элитных инбредных линий кукурузы //Бютехнолопя. 2012. Т. 5. № 3. С. 98-103.
15. Сергеева Л.Е., КомисаренкоА.Г.,Бронникова Л.II. и др. Содержание свободного пролина в тканях подсолнечника при реализации морфогенетического потенциала in vitro II Бютехнолопя. 2013. Т. 6. № 1. С. 113-118.
16. Моисеева Е.М., Агапонов Д.А., Вешков В.А. и др. Повышение содержания пролина в растениях кукурузы, эксп-рессирующих фрагмент гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации // Физиология растений. 2012. Т. 59. №3. С. 457-460.
17. Михальская СЛ., Адаменко ПЛ., Моргун Б.В. и др. Компетентность к Agrobacterium - опосредованной трансформации сегментов побега элитных инбредных линий кукурузы // Бютехнолопя. 2012. Т. 5. № 3. С. 98103.
18. Battaglia М, Solorzanlo R.M., Hernandez P. et al. Proline-rich cell wall proteins accumulate in growing regions and phloem tissue in response to water deficit in common bean seedlings//Planta. 2007. V. 225. P. 1121-1133.
19. Goo J.N., ParkAR., Park W.J., Park O.K. Selection of Arabidopsis genes encoding and secreted plasma membrane proteins//Plant Mol. Biol. 1999. V. 41. P. 415-423.
INVESTIGATION OF THE FREE PROLINE CONTENTS IN CORN PLANTS TRANSFOR-MATED IN PLANTA USING ¿/¿44404, HARBORING pBi2E WITH DOUBLE-STRANDED RNA-SUPPRESSOR PROLINE DEHYDROGENASE
©2013 S.I. Mykhalska1, A.Y. Matveeva1, L.E. Sergeeva1, A.V. Kochetov2, E.N. Tishchenko1
1 Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv 2 Institute of Cytology and Genetics, Russian Academy of Science, Novosibirsk
The transgenic com Tl-plants (Zea mays L.) with double-stranded RNA-suppressor proline dehydrogenase were obtained. The levels of free L-proline in shoots and roots under sulfate-chloride salinity were estimated. There was shown that com salt tolerance was conferred by elevated level of this osmolyte.
Key words: Zea mays L, salt tolerance, proline dehydrogenase gene suppression, transgene plant.
Svetlana Mykhalska, Candidate of Biology, researcher, e-mail: svetlana_mykhalska(S!mail.ru; Aleksandra Matveeva, Candidate of Biology, junior researcher, e-mail: mgirais(S)mail.ru; Larisa Setgeeva, Candidate of Biology, senior researcher; Alexey Kochetov, Candidate of Biology, associate professor, laboratory chief, e-mail: aK(S)bionet.nsc.ru; Elena Tishchenko, Doctor of Biology, department chief, e-mail: oltyko(S)gmail.com
1665
