CC BY
70
8. Колпащиков Л.А. Олень северный // Фауна позвоночных животных плато Путоран. - М., 2004. -С. 369-377.
9. Подкорытов Ф.М. Содержание микроэлементов (Мп,7п,Си,Мо,Со,\ІІ,РЬ) в почвах, кормовых растениях и в организме оленя в условиях Таймыра: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Дубровицы, 1969. - 24 с.
10. Щелкунова Р.П. Растительность и кормовые ресурсы для оленеводства: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Новосибирск, 1980. - 43с.
11. Щелкунова Р.П. Растительность и кормовые ресурсы оленеводства Таймыра // Аграрная Россия. - М., 2000. - №3. - С.36-38.
---------♦'-----------
УДК 577.359 К.В. Шадрин, В.Г. Пахомова,
А.П. Рупенко, И.И. Моргулис
МЕТАБОЛИЗМ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ В ИЗОЛИРОВАННОЙ ПЕРФУЗИРУЕМОЙ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ
В статье представлены результаты исследований метаболизма азотсодержащих и углеводных соединений в изолированной перфузируемой печени крыс после гипоксии, имитированной введением хлорида кобальта.
Ключевые слова: гипоксия, метаболизм углеводов, метаболизм аминов, перфузия изолированного органа.
K.V. Shadrin, V.G. Pakhomova, A.P. Rupenko, I.I. Morgulis
METABOLISM OF NITROGEN-CONTAINING COMPOUNDS IN THE ISOLATED PERFUSED RAT LIVER
The research results on estimation of nitrogen-containing and carbohydrate compounds metabolism in the isolated perfused rat liver undergoing the hypoxic conditions simulated by cobalt chloride are presented in the article.
Key words: hypoxia, carbohydrate metabolism, nitrogen-containing metabolism, isolated organ perfusion.
Введение. Гипоксия является патологическим процессом, возникающим при недостаточном снабжении тканей организма кислородом или нарушении его утилизации в процессе биологического окисления. Она возникает в биологических системах вследствие широкого спектра причин, включая как нормальные физиологические отклонения (при снижении парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе), так и патологические состояния (дыхательная недостаточность [3, 16], анемия [7, 8], отравление токсичными веществами [10, 13]).
Одним из видов гипоксии, приводящих к воспалению мозга [11], повреждениям почек и печени [10, 12,
13, 15], раку [6, 9], является гистотоксическая гипоксия. Она может быть следствием ишемии, как в случае инсульта [18], или воспаления, при нейро-воспалительных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз [1]. Такой вид гипоксии можно имитировать хлоридом кобальта (C0CI2). Хлорид кобальта является общепризнанным агентом, имитирующим состояние гипоксии как in vivo, так и in vitro [5].
Известно, что хлорид кобальта также оказывает влияние на метаболизм аминокислот: аланина, гистидина и аспарагиновой кислоты [2]. Последняя участвует в процессе синтеза мочевины - главного механизма детоксикации аммиака, который проходит преимущественно в печени. Аммиак является высокотоксичным продуктом, который сформирован эндогенно в процессе катаболизма аминокислот в клетках млекопитающих или в результате уреолитического действия кишечных бактерий. Если концентрация аммиака превышает потенциал синтеза мочевины, проявляются токсические симптомы, такие как печеночная энцефалопатия и гипераммониемия [14, 17]. Поэтому очень важно понимать особенности метаболизма печени, из-за интенсивного изменения окружающей среды часто находящейся в экстремальном состоянии.
Цель исследования. Выявить динамику параметров метаболизма азотсодержащих соединений в изолированной перфузируемой печени крысы в условиях гистотоксической гипоксии, имитируемой введением хлорида кобальта.
Методика исследования. В экспериментах использовали крыс-самцов Wistar массой тела 200-250 г. Операцию выделения печени проводили под общим тиопентал-натриевым наркозом (100 мг/кг массы животного). Стабилизацию гемостаза осуществляли внутривенным введением в бедренную вену гепарина (1000 ед/кг массы). Печень после канюлирования воротной вены инфузировали (под давлением 5-7 см вод. ст.) охлажденным до +10°С раствором Кребса-Хенселейта. После канюлирования грудного отдела полой вены печень изолировали и помещали в камеру установки для перфузии изолированных органов. Перфузию проводили с использованием установки с разомкнутым контуром циркуляции среды.
Проведены 4 серии экспериментов:
• серия 1 - печень интактных животных перфузировали по стандартной схеме без дополнительных воздействий (контроль);
• серия 2 - печень интактных животных перфузировали раствором Кребса-Хенселейта с добавлением в перфузат аспарагиновой кислоты ([Азр]=0,2мМ) и хлористого аммония ([1\1Н4С1]=5мМ);
• серия 3 - печень животных, подвергшихся премедикации хлоридом кобальта ([СоС12*6Н20]=25мМ) за сутки до операции, перфузировали по стандартной схеме раствором Кребса-Хенселейта;
• серия 4 - печень животных, подвергшихся премедикации хлоридом кобальта ([СоСЬ*6Н20]=25мМ) за сутки до операции, перфузировали по схеме Кребса-Хенселейта с добавлением в перфузат аспарагиновой кислоты и хлористого аммония.
Хлорид кобальта вводили животному подкожно.
Всего в эксперименте использовали 24 животных: по 6 животных на каждую серию экспериментов.
Забор проб осуществляли каждые 10 минут первые 30 минут перфузии, далее - каждые 5 минут. Длительность перфузии - 120 минут, при общей длительности эксперимента (вместе с операцией) около 150 минут.
В ходе эксперимента измеряли следующие параметры: скорость выделения желчи, импеданс сосудов органа, потребление кислорода изолированным органом, продукция глюкозы, продукция мочевины.
Результаты исследования. Динамика импеданса сосудов изолированной печени представлена на рисунке 1. Из рисунка можно видеть, что после 70-й минуты в серии 1 импеданс сосудов возрастает, в то время как в сериях 2, 3, 4, т.е. тех, в которых орган подвергался какому-либо воздействию, значение импеданса было постоянным.
Импеданс сосудов
Л
2
I
5
ъ
I
и
0
1 I-
о
-^^•Серия 1 Н^Се рия 2 Серия 3 ^^Серия 4
Рис. 1. Динамика импеданса сосудов в течение перфузии
На рисунке 2 представлена динамика скорости продукции желчи в ходе перфузии. График показывает, что орган живет и метаболизирует, выделяя желчь.
Скорости продукции желчи
Время, ми н
♦ Серия 1 А Серия 2 Ш Серия 3 X Серия 4
Рис. 2. Динамика скорости продукции желчи в течение перфузии
Для органов серии 1 потребление кислорода падает, что согласуется с увеличением импеданса сосудов, а хлорид кобальта и добавление в среду аспарагиновой кислоты стабилизируют потребление кислорода. Сочетание воздействия кобальтом и добавления в среду аспарагиновой кислоты дополнительно ничего не изменяет (рис. 3).
Рис. 3. Динамика потребления кислорода в течение перфузии
Динамика уровня глюкозы в течение перфузии представлена на рисунке 4. Содержание глюкозы в перфузате колеблется. В сериях 3 и 4 (животные подвергались предварительному воздействию кобальтом) колебания ярко выражены (и, если можно так выразиться, «синхронны»). Кроме того, в четвертой серии экспериментов на 95-й минуте наблюдается достаточно сильный выброс глюкозы.
Рис. 4. Динамика уровня глюкозы в течение перфузии
На рисунке 5 представлена динамика уровня мочевины в перфузате, оттекающем от изолированной печени. Как свидетельствуют данные рисунка, в целом уровень мочевины в перфузате, оттекающем от печени крыс, предварительно обработанных хлоридом кобальта, ниже, чем для органов животных, которые хлорида кобальта не получали.
Уровень мочевин ы
Врем я, мин
“Серия 2
"Серия 4
Рис. 5. Динамика уровня мочевины в течение перфузии Выводы
В результате проделанной работы оценены параметры жизнедеятельности и метаболизма (импеданс сосудов, скорость продукции желчи, потребление кислорода, концентрации глюкозы и мочевины в перфузи-онной среде) в изолированной перфузируемой печени крыс, как интактных, так и подвергшихся премедика-ции хлоридом кобальта.
Представленные результаты указывают на то, что, возможно, за сутки, в течение которых на животное воздействовал кобальт, в клетках печени произошли адаптивные метаболические сдвиги и орган приспособился к условиям недостатка кислорода.
При этом, вероятно, кобальт, стимулируя активность транскрипционного фактора чувствительности к гипоксии (И1Р), запускает синтез ферментов гликолиза, что может являться причиной концентрационных осцилляций глюкозы, наблюдаемых в ходе эксперимента. Высокое содержание глюкозы на 95-й минуте перфузии может быть вызвано добавлением аспарагиновой кислоты, входящей в перечень гликогенных аминокислот [19].
Более низкий уровень мочевины в 4-й серии может быть объяснен тем, что хлорид кобальта вызывает повышение активности фермента орнитин декарбоксилазы в печени крыс на 2 порядка [4]. Присутствие хлорида кобальта может приводить к активизации процесса декарбоксилирования орнитина и выведению орнитина из цикла Кребса-Хенселейта, что и выражается в снижении уровня мочевины в перфузате.
Можно заметить, что при воздействии хлоридом кобальта снижается уровень продукции мочевины в печени (как мы полагаем, в результате снижения мощности орнитинового цикла, к которому приводит введение хлорида кобальта), а выброс глюкозы, наблюдаемый на 95-й минуте перфузии, особенно велик. Можно предположить, что в условиях изолированной перфузии хлорид кобальта вызывает относительное изменение мощностей орнитинового цикла и цикла трикарбоновых кислот, что приводит к переключению метаболических путей между обменами аминов и углеводов.
Литература
1. Aboul-Enein F., Lassmann H. Mitochondrial damage and histotoxic hypoxia: a pathway of tissue injury in inflammatory brain disease? // Acta Neuropathol. - 2005. - Vol. 109. - № 1. - P. 49-55.
2. Bar-Or D., Curtis G., Rao N., Bampos N. Characterization of the Co2+ and Ni2+ binding amino-acid residues of the N-terminus of human albumin // Eur J Biochem. - 2001. - Vol. 268. - № 1. - P. 42-48.
3. Benditt J.O. Initiating noninvasive management of respiratory insufficiency in neuromuscular disease // Pediatrics. - 2009. - Vol. 123. - № 4. - P. S236-S238.
4. Furihata C., Yoshida S., Sato Y. Inductions of ornithine decarboxylase and DNA synthesis in rat stomach mucosa by glandular stomach carcinogens // Jpn J Cancer Res. - 1987. - Vol 78. - № 12. - P. 1363-1369.
5. Goel R.K., Bagga P. Cobalt chloride induced histotoxic cerebral hypoxia: A new experimental model to study neuroprotective effect // J Pharm Educ Res. - 2010. - Vol. 1. - № 2. - P. 88-95.
6. Harris A.L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth // Nature Rev Cancer. - 2002. - Vol. 2. - № 1.
- P. 38-47.
7. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia / P.P. Kapitsinou [et al.] // Blood. - 2010. - Vol. 116. - № 16. - P. 3039-3048.
8. Anemia is associated with metabolic distress and brain tissue hypoxia after subarachnoid hemorrhage / P. Kurtz [et al.] // Neurocrit Care. - 2010. - Vol. 13. - № 1. - P. 10-16.
9. Lee K., Roth R.A., LaPres J.J. Hypoxia, drug therapy and toxicity // Pharmacology & Therapeutics. - 2007. -Vol. 113. - № 2. - P. 229-246.
10. Leuschner J., Winkler A., Leushner F. Toxicokinetic aspects of chronic cyanide exposure in the rat // Toxicol Lett. - 1991. - Vol. 57. - № 2. - P. 195-201.
11. Reducing the gray zone: imaging spectrum of hypoperfusion and hypoxic brain injury in adults / M.J. Moore [et al.] // Emerg Radiol. - 2010. - Vol. 17. - № 2. - Р. 123-130.
12. Okolie N.P., Osagie A.U. Liver and kidney lesions and associated enzymechanges induced in rabbits by chronic cyanide exposure // Food Chem Toxicol. - 1999. - Vol. 37. - № 7. - P. 745-750.
13. Effects of prolonged cyanide and thiocyanate feeding in rats / D.J. Philbrick [et al.] // J Toxicol Environ Health.
- 1979. - Vol. 5. - № 4. - P. 579-592.
14. Roberge A., Charbonneau R. Metabolism of ammonia. I. Biochemical aspect of ammonia intoxication // Rev Can Biol. - 1968. - Vol. 27. - № 4. - Р. 321-331.
15. Effect of sub-acuteoralcyanide administration in rats: Protective efficacy of alpha-ketoglutarate and sodium thiosulfate / R.K. Tulsawani [et al.] // Chem Biol Int. - 2005. - Vol. 156. - № 1. - P. 1-12.
16. Prediction of Respiratory Insufficiency in Guillain-Barre Syndrome / C. Walgaard [et al.] // Ann Neurol. -2010. - Vol. 67. - № 6. - P. 781-787.
17. Interorgan ammonia metabolismin liver failure: the basis of current and future therapies / G. Wright [et al.] // Liver International. - 2011. - Vol. 31. - № 2. - P. 163-175.
18. Zhao Z.-Q., Vinten-Johansen J. Postconditioning: Reduction of reperfusion-induced injury // Cardiovasc Res.
- 2006. - Vol. 70. - № 2. - P. 200-211.
19. Северин Е.С. Биохимия. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 784 с.
----------♦--------------
