Метаболическая коррекция липидтранспортной системы при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

В институтах, клиниках, лабораториях

© В. А. Косинец, 2012

УДК 616.381-002.3-092.9-08:615.272.4

В. А. Косинец

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ЛИПИДТРАНСПОРТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ РАСПРОСТРАНЕННОМ ГНОЙНОМ ПЕРИТОНИТЕ

Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова (ректор — чл.-кор. РАМН проф. П. В. Глыбочко)

Ключевые слова: распространенный гнойный перитонит, цитофлавин, неотон, липидтранспортная система, фосфолипиды, холестерол.

Введение. Воспалительный процесс оказывает значительное влияние на состояние липидтранспортной системы организма [4]. Известно, что липопротеиновые комплексы являются не только важной составляющей обмена веществ в организме, но и участвуют в механизмах иммунного ответа [4, 8]. Выделение бактериального липополисахарида (ЛПС), контроль за действием которого осуществляют, в том числе, липопро-теины высокой плотности (ЛПВП), приводит к активации провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, фактор некроза опухоли) [18, 20]. Малые дозы ЛПС стимулируют продукцию липо-протеинов очень низкой плотности, в то время как высокие — тормозят их преобразование за счет снижения активности липопротеинлипазы [12, 19].

Как правило, воспалительный процесс сопровождается гипертриглицеридемией и гипер-холестеролемией [13, 17]. Гипертриглицеридемия стимулирует активность индуцибельной циклоок-сигеназы эндотелиальными клетками и продукцию провоспалительных эйкозаноидов, цитокинов и хемокинов [10]. Холестерол является обязательным компонентом биологических мембран, обеспечивая за счет изменения параметра «текучести» регуляцию их функциональной активности [2, 16].

Практически не изучено состояние липидтран-спортной системы при распространенном гнойном перитоните. Известно, что при сепсисе отмечается

значительное снижение уровняобщего холестерола и ЛПВП в сыворотке крови [11, 15]. Установлена обратно пропорциональная корреляционная взаимосвязь между уровнем гипохолестеринемии и числом неблагоприятных исходов [9]. Поскольку липопротеины высокой плотности способны связывать и нейтрализовать бактериальные липо-полисахариды (ЛПС), участвуют в регуляции начальных этапов воспалительного процесса, выработки ряда цитокинов [7], их снижение способно потенцировать активность воспалительного процесса, а гипохолестеролемия — приводить к снижению продукции глюкокортикоидов [4], способных существенно модифицировать состояние иммунной системы.

В связи с этим разработка методов коррекции нарушений липидтранспортной системы при распространенном гнойном перитоните является весьма актуальной. Однако до настоящего времени не изучена возможность использования с данной целью метаболических препаратов. В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка влияния метаболических средств «Цитофлавин» и «Неотон» на состояние липидтранспортной системы крови при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Цитофлавин — раствор для инфузий, содержащий янтарную кислоту, никотинамид, рибоксин и рибофлавин [1]. Неотон — метаболическое средство, действующим веществом которого является креатинфосфат [6].

Цель исследования — изучить влияние метаболических средств «Цитофлавин» и «Неотон» на состояние липидтранспортной системы крови при

экспериментальном распространенном гнойном перитоните.

Материал и методы. Эксперимент выполнен на 55 кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы: 1-я — интактные (n=5); 2-я — 6-часовой распространенный гнойный перитонит без хирургического лечения (n=5); 3-я — контрольная, хирургическое лечение перитонита (n=15); 4- я — хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде препарата «Цитофла-вин» (n=15); 5-я — хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде препарата «Неотон» (n=15).

Перитонит моделировали путем интраабдоми-нального введения аэробно-анаэробной взвеси E.coli (штамм 0111 К58 НИ С 130-53) и B. Fragiiis (штамм 323) из расчета 6 млрд микробных тел на 1 кг массы кролика. Через 6 ч после введения микроорганизмов в 3-, 4-й и 5-й группе животных с целью лечения перитонита и устранения энтеральной недостаточности выполняли лапаротомию, санацию брюшной полости, декомпрессию тонкой кишки. Животным 4-й и 5-й группы в послеоперационном периоде (в течение 5-х суток) ежедневно внутривенно капельно вводили препараты «Цитофлавин» (28,6 мг янтарной кислоты на 1 кг массы тела) и «Неотон» (0,05 г на 1 кг массы тела) соответственно, животным 3-й группы — изотонический раствор натрия хлорида 0,9%. Животных с распространенным гнойным перитонитом выводили из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 ч после заражения, 3-, 4-й и 5-й группы — на 1-, 3-и и 5-е сутки после операции.

Экстракцию фосфолипидов (ФЛ) осуществляли последовательно смесью хлороформ/метанол (1:2 по объему) и смесью хлороформ/метанол/вода (1:2:0.8 по объему) согласно методике М. Кейтс [3]. Суммарную концентрацию ФЛ митохондрий печени измеряли после минерализации экстракта по реакции с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой [5] по стандарту неорганического фосфата. Индивидуальные ФЛ разделяли методом тонкослойной хроматографии [3]. Идентификацию ФЛ-классов проводили по стандартам после окрашивания в йодной камере. Содержание ФЛ-классов определяли по неорганическому фосфату в реакции с реактивом Васьковского и выражали в процентах от общего количества [21]. Белок определяли биуретовым методом [14].

Статистическую обработку данных проводили с использованием электронных пакетов анализа STATISTICA 6.0 и Excel. Поскольку распределение признаков носило правильный характер, а дисперсии в сравниваемых группах не отличались, были использованы методы описательной статистики, t-критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений р<0,05).

Результаты и обсуждение. Через 6 ч после инициации перитонита в показателях липидно-белкового спектра сыворотки крови происходили изменения, характерные

Е +1

х

о

IS

а

<и с

S о

X

>s

о

X

о

X X

<0 X <б а

I-

U

о а с о <с а

о

X

л

с, <о

I-

х

<и

а

<и

с

«

S

а с

S

m О

а *

о а о m .о о (б а

I*

<и с о о

о m

0 *

с, <0 ю

1

о г d

с,

DC S X (U X

<и

Ч. о

т- о +1 о

00 о"

<Чп

СП со

со ™ ЗЯо

О 1 = II

£

ю

CD^ £

ю

8 см " о

СО CD 'Ясоо

ООО

+1 о" ™ 11°

СП ,-п

toi

s" § ?

II ^

<м о" СЧ||_

ю Q-

о

т". о (М о +1 О

§1?

со О

т-" О +1 О

I4- о" Ю.М

8

5

О t:

СП СО "-

-" +1 -- --

"--" "--" -"

со_ _ _ со

o°g

(М о

со о t V Ч о-

- 00 ю 00

"-- -"- -" +1 -"-

-" -" -"

-

_ а. а. " а.

00 ^

<М о

СП о

CD V

СП ^

<М о

h- о

Ю V

CU Q-

со су

^ Я

Ч-

см о I 1_

СО" Q-

--

о о"

v_ -

t Т- CD

..-£ ^

(Mq. Q-

CD ю

<м ^ о" о Ü о"

3 1 .

а) н

о ф ^

§i X Е

(М "- (М <м со

-" -" о о

+1 со +1 00 о о

С) __ со ^т

". -"

°COCOCD <4 т- Tfco оооо о" о" о" ? II II II

т- СО ^Г "---

сп _

о со

-_

<о ,г

(М Ю ,

-

ъ I

--

"-- _ CU Q- !

со | I '!_ СЧоГ^

^ со

._

о-

ю со

CD о С^ Q-

СО т— (М т—

<М

-" +1 --"- "--" +1 --"-

-" CD -"

-СО _ _

CU о- -" оГ

4

5

а)

S

Е5 j;

I- s

CO 00

(M о --

^ со II '[о

с^'оГ о-

с^" о +1 сэ со

со 1=

S

---

"------

--__

"-Ч-

О) о ^ V ö а-

^ £ о" О

II

(М 1 =

о" о-

00 СП "-ч --

С^ I I

с^" о-

8§Я °§§

Ю

00 о 00

со

о- £-

(М

сп^оо

<м 11

00

о си

- о *

(М о

со"

со

й 2 о

си 11_ 00 оТ

- СП V о

- о

О

+-1 Г- о

Ю_ 11_

о> оТ

Ю го « о

Т- О

+1 О

ЯЯ?

ю о ю II

00 оТ

4

5

н

я ■&

о

о ■&

о о

5

ю со - о

со +1

(ООО О II II

^ £ со о

си оТ

00 ™ О)

^ СП о СО о +1 О

а *

-

Ч. <м ю о

+1 о

£

со" О-

(М

я

е

о о

е

ГО СП Ю £Р

г- _ СО оо

00 о II

си ¿-

я

е

о о

е г

со

СП О.

со си О Д! о"

т О и Ю СП'=-

со" ^

-

-От-

сио о со

со

--

*§

СП о 00_ II со" оТ

СП -»

00 СП СП II

Ч оТ

-. ^ II

-.

00 11_ со" оТ

я ■&

о о

е

о

а ф

^

для воспалительного процесса, — статистически достоверно снижалось содержание общего белка и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) ф=0,0001 и p<0,0001 соответственно), увеличивалось содержание холестерола (ХС), триглицеридов (ТГ) ф=0,015 и р<0,0001 соответственно) (табл. 1).

В структуре ЛПВП отмечено достоверное увеличение содержания лизофосфатидов (ЛФ) ф=0,022), которое, возможно, было обусловлено ростом активности провоспалительной секреторной фосфолипазы A2. Достоверно (p=0,028) снижалось содержание фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и увеличивалось — полиглицерофосфа-тидов (ПГФ) (p=0,011) (табл. 2).

На 1-е сутки послеоперационного периода, как и в предыдущий срок исследования, уровни содержания белка ф=0,0007) и ЛПВП ф<0,0001) оставались сниженными, количество ТГ было выше, чем у интактных животных ф=0,0003). Обращал внимание рост содержания общего холестерола как по сравнению с нормой ф<0,0001), так и по сравнению с предыдущим сроком исследований ф=0,0006). В составе ЛПВП оставалось повышенным содержание ЛФ ф=0,0003) на фоне достоверного снижения содержания фосфатидилхолина (ФХ) (p=0,01), также сохранялся повышенным уровень ПГФ.

На 3-и сутки после операции содержание общего белка и ЛПВП, как и в предыдущие сроки исследований, оставалось сниженным ф=0,0004 и р=0,0009 соответственно). При этом, сохранялся повышенный уровень ТГ и ХС по сравнению с интактными животными ф=0,001 и р<0,0001 соответственно).

На 5-е сутки после операции изменения липидтранспортной системы указывали на дальнейшую перестройку ее структуры. Как и в предыдущие сроки исследований была отмечена достоверная гипопротеинемия (p=0,0007). Содержание ХС было выше, чем у здоровых животных ф<0,0001). Содержание ТГ не отличалось от предыдущего срока исследований. Содержание ЛПВП было ниже, чем у здоровых животных (p<0,0001), однако увеличивалось по сравнению с 1-ми и 3-ми послеоперационными сутками. Фосфолипидный спектр ЛПВП не отличался от такового на предыдущем сроке исследований.

Применение препарата «Цитофлавин» оказывало схожее с «Неотоном» действие на исследуемые показатели, однако его эффект был более выраженным.

На 1-е сутки после операционного вмешательства цитофлавин способствовал

сохранению количества общего белка на уровне достоверно выше нормы (р=0,009). Количество триацилглицеридов не отличалось от такового у здоровых животных и было достоверно ниже, чем у животных контрольной группы (р=0,008). Уровень ЛПВП был ниже, чем у здоровых животных (р=0,0001), но выше, чем в контрольной группе (р=0,003). Учитывая, что ХС крайне необходим для построения клеточных мембран, является субстратом для продукции кортикостероидов, а также сопряжен с реактивностью иммунной системы, можно заключить, что в 1-е сутки после операционного вмешательства цитофлавин оказывал позитивное действие на течение воспалительного процесса. Такая точка зрения подтверждалась и результатами исследования липидного спектра ЛПВП — отмечено достоверно более низкое содержание ЛФ.

На 3-и сутки после операции наблюдалась положительная динамика исследуемых показателей. Содержание белка было ниже, чем у здоровых животных (р=0,04), но выше, чем в контрольной группе (р=0,009). Отмечался более низкий уровень ХС по сравнению с интактными животными (р=0,0002). Возможно, снижение содержания ХС свидетельствовало о прохождении «пика» острого воспаления, на что указывало достоверно более низкое, чем у контрольных животных, содержание ТГ (р=0,043) и более высокое — ЛПВП (р=0,023). Изменения фосфолипидного спектра также свидетельствовали о снижении активности воспалительного процесса. Отмечено достоверно более низкое, по сравнению с контрольной группой, и не отличающееся от нормальных значений содержание ЛФ (р=0,013).

Сравнение действия препаратов «Цитофлавин» и «Неотон» показало более высокую защитную активность «Цитофлавина». В пользу данного вывода свидетельствовало более низкое содержание ТГ (р=0,036), а также более высокое содержание ЛПВП (р=0,008) и фосфатидилхоли-на (ФХ) ЛПВП (р=0,042).

На 5-е сутки после операции содержание белка крови не имело достоверных отличий от здоровых животных и было выше, чем в контрольной группе (р=0,0004). Количество ХС было достоверно выше по сравнению с интактными животными (р<0,0001) и, в то же время, ниже, чем в группе контроля (р<0,0001), что, возможно, обусловлено меньшей востребованностью ХС для репарационных процессов. На позитивное действие препарата «Цитофлавин» также указывала нормализация содержания ТГ.

Исследование фосфолипидного спектра ЛПВП на 5-е сутки после операции также подтверждало

эффективность цитофлавина. Отмечено более низкое, чем в контрольной группе, содержание ЛФ (р=0,0006). Как и в предыдущий срок исследований содержание ФХ было ниже, чем у здоровых животных (р=0,008), однако рост содержания ФЭА, по сравнению с интактными животными (р=0,019), можно расценить как признак позитивной динамики восстановления функции печени. Более высокое, чем у здоровых животных и группы контроля, содержание ПГФ (р=0,007 и р=0,017 соответственно) также, возможно, свидетельствовало о возрастающей активности продукции фосфолипидов в печени.

Сравнение препаратов «Цитофлавин» и «Нео-тон» указывает на преимущество «Цитофлавина», поскольку препарат способствовал более интенсивной нормализации содержания ТГ, увеличению содержания ЛПВП (р=0,032), при этом эффективнее снижая уровень ХС (р=0,034) и содержания ЛФ до нормальных величин (р=0,025).

Таким образом, можно заключить, что цитофлавин во все сроки исследований оказал позитивное действие на течение воспалительного процесса, при этом его эффективность была выше, чем у препарата «Неотон».

Выводы. 1. Развитие распространенного гнойного перитонита вызывает негативные изменения липидтранспортной системы крови, в результате которых в сыворотке крови уровень белка снижается на 17,46% (р=0,0001), ЛПВП — на 60,0% (р<0,0001), наблюдается рост содержания триглицеридов на 117% (р<0,0001). В фосфолипидном спектре ЛПВП патологические изменения характеризуются увеличением содержания лизофосфатидов на 22,36% (р=0,022) и компенсаторным ростом уровня полиглицерофос-фатидов на 23,08% (р=0,011).

2. В результате декомпенсации защитных систем организма на 5-е сутки послеоперационного периода наблюдается сохранение отрицательных изменений в сыворотке крови, заключающихся в статистически достоверном, по сравнению с нормой, снижении уровня белка (на 14,57%, р=0,0007) и ЛПВП (на 32,50%, р=0,017), увеличении содержания холестерина (на 238,83%, р<0,0001) и триглицеридов (на 50,39%, р=0,03). Нарушения фосфолипидного спектра ЛПВП представлены высоким процентным содержанием лизофосфатидов (р=0,0009) и низким уровнем фосфатидилхолина (р=0,0001).

3. Установлено, что препарат «Цитофлавин» обладает способностью влиять на белково-фосфолипидный спектр сыворотки крови при распространенном гнойном перитоните. Приме-

нение препарата на 5-е сутки послеоперационного периода способствовало росту содержания белка и ЛПВП на 12,59% (р=0,0004) и 40,74% (р=0,027) соответственно, снижению уровня холестерина — на 33,81% (р<0,0001). Действие препарата также было направлено на снижение содержания лизофосфатидов (на 18,45%, р=0,0006) и рост полиглицерофосфатидов (на 19,83%, р=0,017) в фосфолипидном спектре ЛПВП.

4. Цитофлавин, содержащий янтарную кислоту, эффективнее, по сравнению с препаратом «Неотон», способствует нормализации состояния липидтранспортной системы крови при экспериментальном распространенном гнойном перитоните за счет более интенсивного снижения на 5-е сутки послеоперационного уровня холестерина (р=0,034), росту ЛПВП (р=0,032), со снижением в их структуре процентного содержания лизофосфатидов (р=0,025).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Афанасьев В. В. Цитофлавин в интенсивной терапии: пособие для врачей.-СПб., 2005.-36 с.

2. Болдырев А. А., Котелевцев С. В., Ланио М. Введение в био-мембранологию: учебное пособие.-М.: МГУ, 1990.-208 с.

3. Кейтс М. Техника липидологии.-М.: Мир, 1975.-C. 76, 138— 140, 310-311.

4. Осочук С. С. Изменения липидтранспортной системы при экспериментальном перитоните у крыс // Бюл. экспер. биол.-2002.-№ 8.-С. 169-171.

5. Покровский А. А. Биохимические методы исследования.-М.: Медицина, 1969.-477 с.

6. Сачек М. Г., Лызиков А. П., Стебунов С. С., Питкевич Э. С. Применение креатинфосфата в хирургии.-Витебск, 1998.-С. 171.

7. Ханевич М. Д., Селиванов Е. А., Староконь П. М. Перитонит: Инфузионно-трансфузионная и детоксикационная терапия.-М.: МедЭкспертПресс, 2004.-205 с.

8. Юпатов Г. И. Иммунная и липидтранспортная системы: клинико-метаболические аспекты: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук.-Витебск, 2003.-41 с.

9. Bonville D. A. The relationships of hypocholesterolemia to cytokine concentrations and mortality in critically ill patients with systemic inflammatory response syndrome // Surg. Infect.-2004.-Vol. 5.-P. 39-49.

10. Byrne C. D. Triglyceride-rich lipoproteins: are links with atherosclerosis mediated by a procoagulant and proinflammatory phenotype? // Atherosclerosis.-1999.-Vol. 145.-P. 1-15.

11. Chiarla C. Hypocholesterolemia in critical illness // Critical Care Medicine.-2009.-Vol. 37.-P. 2681-2682.

12. Feingold K. R. Endotoxin rapidly induces changes in lipid metabolism that produce hypertriglyceridemia: low doses stimulate hepatic triglyceride production while high doses inhibit clearance // J. Lipid Res.-1992.-Vol. 33.-P. 1765-1776.

13. Gallin J. I., Kaye D., O'Leary W. M. Serum lipids in infection // New Engl. J. Med.-1969.-Vol. 281.-P. 1081-1086.

14. Gornall A. C., Bardawill C. J., David M. M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction // J. Biol. Chem.-1949.-Vol. 177. — P. 751-766.

15. Khovidhunkit W. et al. Infection and inflammation-induced proatherogenic changes of lipoproteins // J. Infect. Dis.-2000.-Vol. 181. — P. 462-472.

16. Krämer R. Cholesterol as activator of ADP-ATP exchange in reconstituted liposomes and in mitochondria // Biochim. Biophys. Acta.-1982.-Vol. 693.-P. 296-304.

17. Laurila A. Association of Helicobacter pylori infection with elevated serum lipids // Atherosclerosis.-1999.-Vol. 142.-P. 207-210.

18. Morisson D. C., Ryan J. L. Endotoxin and disease mechanisms // Annu. Rev. Med.-1987.-Vol. 38.-P. 417-432.

19. Nonogaki K. Lipoteichoic acid stimulates lipolysis and hepatic triglyceride secretion in rats in vivo // J. Lipid. Res.-1995.-Vol. 36.-P. 1987-1995.

20. Raetz C. R.H. Biochemistry of endotoxins // Annu. Rev. Biochem.-1990.-Vol. 59.-P. 129-170.

21. Vaskovsky V. E., Kostetsky E. J., Vassenolin J. M. A universal reagent for phospholipid analysis // J. Chromatogr.-1975.-Vol. 114.—P. 129-141.

Поступила в редакцию 13.01.2012 г.

V. A. Kosinets

METABOLIC CORRECTION OF THE LIPID-TRANSPORT SYSTEM IN EXPERIMENTAL DIFFUSE PURULENT PERITONITIS

The research was performed in 55 male chinchilla rabbits. For the first time the effect of metabolic preparations «Citofla-vin» and «Neoton» of the protein-lipid spectrum of blood was studied in experimental diffuse purulent peritonitis. The development of diffuse purulent peritonitis caused negative changes in blood lipid-transport system which resulted in a decreased blood protein level and high density lipoproteins (HDL) and growth of triglycerides. In the HDL phospholipid spectrum the pathological changes are characterized by an increased liso-phosphotide content and compensatory growth of the level of poliglycerophosphatides. A comparative analysis has shown that both preparations possess unidirectional action which is more pronounced in «Citoflavin» than in «Neoton».