CC BY
22
С.С. ОСОЧУК, Н.Ю. КОНЕВАЛОВА
ИЗМЕНЕНИЯ ЛИПИДНОЙ КОМПОЗИЦИИ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПЕРИТОНИТЕ
УО «Витебский государственный медицинский университет», Республика Беларусь
Эндоплазматический ретикулум печени крыс обеспечивает формирование и экспорт в кровь липидно-белковых комплексов и таким образом участвует в функционировании липидтранспортной системы. В литературе отсутствуют сведения об изменении липидного спектра эндоплазматического ретикулума печени при генерализованных воспалительных процессах. В настоящей работе исследовали изменения фосфолипидного спектра и состава жирных кислот лизофосфатидов, фосфати-дилхолинов и фосфатидилэтаноламинов мнкросом печени белых беспородных крыс при экспериментальном перитоните. Обнаружены признаки увеличения поставки фосфолипидов митохондриям печени, возможно, для обеспечения их функциональной активности. Отмечено увеличение включения насыщенных жирных кислот в фосфолипиды, что способно активировать Аб-десатуразы и продукцию эндогенных полиненасыщенных жирных кислот, а так же активацию цитохрома Р450 и усиление детоксикации ксенобиотиков. Выявлены признаки увеличения экспорта диго-мо-г-линоленовой кислоты и снижения поставки арахидоновой кислоты, что может быть одним из факторов контроля воспалительного процесса посредством продукции простаноидов, продуцирующихся из дигомо-г-линоленовой кислоты, обладающих меньшей активностью, чем простаноиды синтезирующиеся из арахидоновой кислоты.
Одним из наиболее серьезных осложнений абдоминальной хирургии, в 70 -100% случаев ведущим к летальному исходу [2], является перитонит, изучение этиологии и патогенеза которого является актуальным до настоящего времени. Известно, что крысы высокоустойчивы к развитию воспалительного процесса. Исследование метаболизма крыс при воспалительном процессе позволит найти способы увеличения резистентности к воспалению. Микро-сомальный аппарат клеток печени играет важную роль в процессе биосинтеза экспортируемых в кровь соединений, в том числе, необходимых для формирования липопро-теиновых комплексов и поставки перифе-
рическим клеткам холестерола, фосфолипидов [7]. С мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР) ассоциирована система цитохрома Р450, играющего важную роль в детоксикации ксенобиотиков [7]. При генерализованных воспалительных процессах осуществляется модификация структуры липидтранспортной системы и поставки холестерола надпочечникам [3]. Однако практически отсутствуют сведения об изменениях строения ЭПР при генерализованных воспалительных процессах. Целью настоящей работы является исследование фосфолипидного состава и жирно-кислотного спектра лизофосфатидов (ЛФ), фосфатидилхолинов (ФХ) и фосфатидилэ-
таноламинов (ФЭА) микросом клеток печени белых беспородных крыс при экспериментальном перитоните.
Материалы и методы
Перитонит моделировали однократным внутрибрюшинным введением 4 млрд. микробных тел E.Coli (штамм 0-26) пятнадцати белым беспородным крысам-самцам средней массой тела 180 - 200 гр. Контро-лем служили 12 интактных крыс. Животных декапитировали через 4 часа после инъекции E.Coli. Печень перфузировали охлажденным физиологическим раствором и сохраняли до обработки в жидком азоте. Микросомы печени выделяли низкоскоростным центрифугированием, описанным в работе Baker S. и соавторов [4]. Липиды экстрагировали смесью хлороформа и метанола (соотношение 2:1 по объему). Фос-фолипиды разделяли двумерной тонкослойной хроматографией [1], собирали в огнеупорные пробирки и минерализовали в хлорной кислоте при температуре 220 -240°С. Процентное содержание оценивали по неорганическому фосфату [5]. Для определения спектра жирных кислот ЛФ, ФХ и ФЭА липидный экстракт разделяли двумерной тонкослойной хроматографией [1]. Фракции ЛФ, ФХ и ФЭА собирали в виа-лы, метилировали 0,75N серной кислотой
в метаноле при температуре 650С в течение 24 часов. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном. Экстракт упаривали досуха в токе азота, немедленно растворяли в ацетоне и анализировали на газовом хроматографе Цвет 500М (колонка длиной 2 м, набита реоплекс 400, скорость потока газа-носителя (He) - 30 мл/мин, детектирование пламенно-ионизационным детектором по стандартам метиловых эфи-ров жирных кислот (Sigma)). Соотношения детектированных жирных кислот рассчитывали по площади пиков и выражали в процентах. Результаты обрабатывались статистически с помощью компьютерной программы Excel.
Результаты и обсуждение
Оценка фосфолипидного состава микросом печени (таблица 1) продемонстрировала достоверное снижение количества по-лиглицерофосфатидов (ПГФ) (p=0,0005), одним из представителей которых является кардиолипин - фосфолипид, характерный в большей степени для митохондрий [1]. Данное изменение может быть обусловлено переходом кардиолипинов в состав митохондрий для обеспечения их функциональной активности. Исследование жирных кислот (ЖК) фосфолипидов (ФЛ) показало, что сумма полиненасыщенных жир-
ЛФ СФ ФХ ФЭА ПГФ
Контроль 4,81±0,34 7,1±0,67 57,17±2,2 25,86±2,39 6,02±0,38
E.Coli 4 часа 4,49±0,38 7,53±0,69 55,89±2,06 28,74±2,35 3,26±0,53**
Таблица 1
Спектр фосфолипидов микросом и активность антиоксидантных
ферментов печени
ных кислот (ПНЖК) всех ФЛ снижалась (p<0,0001). В фосфатидилхолинах (ФХ) (таблица 2) росла сумма насыщенных жирных кислот (НЖК) и отношение сумм НЖК/ПНЖК (р=0,02, 0,04). В ЖК спектре ФХ (таблица 3) сумма НЖК увеличивалась за счет пальмитиновой кислоты (С 16:0) (р=0,002), а снижение суммы ПНЖК обуславливалось падением содержания линоле-новой (С18:2) и арахидоновой (С20:4) кислот (p=0,004, 0,008). Рост содержания пальмитиновой кислоты может обуславливаться активацией пальмитатсинтазного комплекса. Снижение содержания линоленовой и арахидоновой кислот, вероятно, обусловлено активацией ПОЛ, а также использованием как предшественников метаболически активных продуктов (липокисны).
ФХ являются основными ФЛ мембран, поэтому снижение содержания их ПНЖК способно увеличить вязкость мембран ЭПР и, как следствие, должно привести к кон-
формационным изменениям ассоциированных с ними белков и модифицировать их функциональную активность. При росте микровязкости мембран ЭПР ключевой фермент биосинтеза эндогенных ПНЖК А6-десатураза выталкивается на поверхность мембраны, освобождается ее активный центр, и фермент активируется [4]. Обнаруженный дефицит ПНЖК должен привести к активации Д6-десатуразы и продукции ПНЖК. ФХ так же участвуют в регуляции активности цитохрома Р450.
Изменение физико-химических свойств ФХ, способно изменить активность этой важной ферментативной системы. Показано, что L-б-1,2-дипaльмитoилфocфa-тидилхолин и L-б-1,2-дипaльмитoилфocфa-тидилэтанол-амин, введенные в микроокружение цитохрома Р450, увеличивали его активность [7]. ФХ и ФЭА этерифициро-ванные короткоцепочечными ЖК (С8-12) увеличивали активность этого фермента на
УНЖК УМНЖК УПНЖК УНЖК / УПНЖК
Фосфатидилхолины %
Контроль 83,45±2,08 2,38±0,62 13,61±1,59 6,19±0,88
4 часа 89,71±2,49 р1=0,02 2,64±0,66 6,98±1,99 р1=0,01 13,66±4,39 р1=0,04
Фосфатидилэтаноламины %
Контроль 71,84±5,05 0,94±0,24 26,49±5,01 2,8±0,73
4 часа 93,59±1,53 р1=0,002 0,37±0,15 р1=0,02 4,81±1,66 р1=0,002 21,23±7,93 р1=0,016
Лизофосфатиды %
Контроль 53,47±4,96 22,05±1,96 22,03±3,99 2,51±0,7
4 часа 81,36±4,31 р1=0,001 1,63±0,32 рК0,0001 16,07±4,29 5,37±1,78
Таблица 2
Изменения сумм жирных кислот и их отношений в составе фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов лизофосфатидов микросом печени при экспериментальном перитоните
Таблица 3
Спектр жирных кислот фосфатидилхолинов и лизофосфатидов
микросом печени
ЛФ ФХ ФЭА
Контроль Е.СоП 4 часа Контроль Е.СоП 4 часа Контроль Е.СоП 4 часа
14:0 19,7±1,34 12,1±1,36** 1,2±0,19 1,32±0,2 0,82±0,1 4,56±0,8**
15:0 4,0±1,18 2,35±0,59 1,2±0,25 0,93±0,2 0,64±0,14 1,23±0,24
16:0 24,0±2,02 59,09±2,24** 58,4±0,69 64,4±0,5** 44,89±0,34 46,38±1,27
16:1 7,26±0,25 Следы Следы Следы Следы Следы
17:0 2,43±0,57 0,92±0,17** 0,55±0,07 0,65±0,09 0,72±0,1 1,21±0,15
17:1 2,29±0,29 0,54±0,09** 0,27±0,05 0,17±0,03 0,33±0,06 0,37±0,08
18:0 5,72±1,0 7,81± 1,0 22,64±1,83 23,01±1,95 25,48±2,54 41,41±2,72**
18:1 11,1±0,55 0,6±0,05** 2,1±0,3 2,47±0,34 0,6±0,07 Следы**
18:2 2,84±0,62 Следы** 6,01±0,76 1,36±0,17** 6,41±0,8 0,72±0,08**
20:3 19,18±2,93 0,07±0,01** 4,1±0,99 5,56±1,3 4,07±0,9 4,08±1,04
20:4 Следы 16,0±2,46** 3,45±0,69 0,05±0,01** 16,0±2,92 Следы**
50-124%. Вышеизложенное свидетельствует о том, что увеличение включения в ФХ пальмитата (С16:0) может увеличить активность цитохрома Р450.
Таким образом, в ФХ происходят сдвиги, способные увеличить активность А6- де-сатуразы и цитохрома Р450, модифицировать биосинтез эндогенных ПНЖК и обезвреживание ксенобиотиков.
В ЖК ФЭА (таблицы 2, 3), сумма НЖК и отношение сумм НЖК/ПНЖК увеличивались (р=0,002, 0,016), а суммы МНЖК и ПНЖК были ниже, чем у интактных животных (р=0,02, 0,002). В отличие от ФХ, увеличение суммы НЖК обуславливалось возрастанием содержания миристиновой (С14:0) и стеариновой (С18:0) кислот (р=0,009, 0,012), а снижение сумм МНЖК и ПНЖК - уменьшением до следовых количеств содержания олеиновой (С18:1) и ара-хидоновой (С20:4) кислот. Такие изменения также вносят свой вклад в увеличение вязкости мембран ЭПР и могут способствовать увеличению активности цитохрома Р450 [7].
В ЖК ЛФХ (таблицы 2, 3) увеличена сумма НЖК (р=0,001) и уменьшена сумма МНЖК (<0,0001), что обуславливалось воз-
росшим содержанием пальмитиновой кислоты (С16:0) (р=0,0003), снижением содержания миристиновой (С14:0) (р=0,01) и олеиновой (С18:1) кислот (р<0,0001). Содержание дигомо-г-линоленовой кислоты (ДГЛК) (С20:3) падало (р=0,02), а содержание арахидоновой кислоты (20:4) росло. Сравнение ЖК ФХ и ЛФХ показало, что из ФХ ФЛ-А2 изымались главным образом миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С 16:1), олеиновая (С18:1) кислоты, атак же ДГЛК (С20:3). Известно, что ЭПР гепа-тоцитов осуществляет синтез ФЛ на своей цитозольной стороне. Для экспорта ФЛ при помощи флипаз переносятся на внутреннюю поверхность ЭПР, а фосфолипаза-А2 ускоряет этот процесс [9]. Вероятно, экспорт ФЛ, этерифицированных ДГЛК (С20:3), усиливается, а этерифицированных арахидоновой кислотой (С20:4) - замедляется. Учитывая, что крысы являются высоко устойчивыми к воспалительному процессу, а простаноиды, синтезирующиеся из ДГЛК, обладают менее выраженной активностью, чем простаноиды, синтезирующиеся из арахидоновой кислоты [8], можно сделать вывод, что снижение экспорта арахидоновой
кислоты и увеличение экспорта ДГЛК может расцениваться как способ регуляции активности воспалительного процесса у крыс.
Таким образом, можно сделать следующие выводы:
1. Из состава ЭПР, возможно для обеспечения возросшей функциональной активности митохондрий, изымаются ПГФ.
2. Изменения ЖК ФХ и ФЭА способствуют увеличению активности цитохрома Р450 и Д6-десатуразы.
3. Отмечены признаки увеличения экспорта вновь синтезированной ДГЛК, возможно, для ограничения активности воспалительного процесса через простаноиды первого ряда.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кейтс, М. Техника липидологии /М. Кейтс. - Москва.: "Мир," 1975. - 358с.
2. Косинец, А.Н. Профилактика и лечение гнойно-воспалительных осложнений при экстренных операциях на органах брюшной полости (клинико.-экспериментальное исследование): дисс. д-ра мед. наук: 14.00.27 / А.Н. Косинец. - Витебск, 1994. -510 л.
3. Осочук, С.С.Изменения липидтранспор-тной системы при экспериментальном пе-
ритоните у крыс / С.С. Осочук // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2002. - № 8.- С. 169-172.
4. Титов, В.Н. Атеросклероз как патология полиеновых жирных кислот/ В.Н. Титов. -Москва: "АЛТУС", 2002. - 495 с.
5. A universal reagent for fosfolipids analisis / V.E. Vaskowsky [et al.] // J. Chromatogr. -1975. - Vol. 114. - P. 129-141.
6. Baker, S. Low speed preparation of microsomes: a comparative study / S. Baker, L. Coons, E. Hodgson //Chem. Biol. Interact. - 1973. -Vol. 6. - P. 307-316.
7. Chul-Ho, Yun Conformational Change of Cytochrome P450 1A2 Induced by Phospholipids and Detergents / Yun Chul-Ho, Song Maengseok, Kim Hyoungman // JBC. -1997. - Vol. 272, № 32. - P. 19725-19730.
8. Li, Zhou. Sources of eicosanoid precursor fatty acid pools in tissues / Zhou Li Nilsson Eke // Journal of Lipid Research. - 2001. - Vol. 42. -P.1521-1542.
9. Sathyanarayana, N. Gummadi Transbilayer Movement of Dipalmitoylphosphatidylcholine in Proteoliposomes Reconstituted from Detergent Extracts of Endoplasmic Reticulum / N. Gummadi Sathyanarayana, Menon Anant K. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277, № 28. -P. 25337-25343.
Поступила 11.04.2006 г.
