Мембранотропные эффекты каротиноидов бактерий Deinococcus radiodurans, выявляемые методом индукции флуоресценции хлорофилла в листьях лебеды садовой Atriplex hortensis Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 581.132.1

МЕМБРАНОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ КАРОТИНОИДОВ БАКТЕРИИ DEINOCOCCUS RADIODURANS, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ МЕТОДОМ ИНДУКЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА B ЛИСТЬЯХ ЛЕБЕДЫ САДОВОЙ ATRIPLEX HORTENSIS

© 2011 г. В.С. Лысенко 1, В.И. Чистяков1, М.А. Сазыкина1, О.Г. Ткаченко 2, М.В. Севостьянова 2, О.Г. Чугуева 2

1Научно-исследовательский институт биологии Южного федерального университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов н/Д, 344090, niib@sfedu.ru

2Педагогический институт Южного федерального университета, пер. Днепровский, 116, г. Ростов н/Д, 344065, rspu@pi.sfedu.ru

1Scientific Research Institute of Biology of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090, niib@sfedu.ru

2Pedagogical Institute of Southern Federal University, Dneprovskiy Lane, 116, Rostov-on-Don, 344065, rspu@pi. sfedu.ru

Изучено воздействие препарата каротиноидов бактерий БеЧтососси.' гайюйигат на кинетику флуоресценции листьев лебеды садовой АМр1ех ИоНеп.'1.ч. Выявлен мембранотропный эффект препарата, сопровождающийся блокированием нециклического транспорта электронов электронтранспортной цепи тилакоидов А. hortensis. Предполагается, что блокирующий механизм опосредован электрон-акцепторными свойствами каротиноидов, переключающими поток электронов на альтернативный путь.

Ключевые слова: Бетососсш га(Ио<1игат, каротиноиды, антиоксиданты, фотосинтез, флуоресценция хлорофилла.

Effects of carotenoids from Deinococcus radiodurans bacteria were studied on chlorophyll fluorescence kinetics induced in saltbush Atriplex hortensis leaves. Membranotropic effect of carotenoidpreparation was shown to be accompanied by the inhibition of thylacoid cyclic electron transport in А. hortensis. The blocking mechanism was assumed as related to the electron-acceptor propertied of carotenoids, which are capable to switch the electron flow to the alternative way.

Keywords: Deinococcus radiodurans, carotenoids, antioxydants, photosynthesis, chlorophyll fluorescence.

Нефотосинтезирующие, имеющие красную пигментацию бактерии Бетососсиь' гаёюёигат известны как организмы, устойчивые к экстремально высоким уровням ионизирующих излучений [1], оксидантов и обезвоживанию [2]. Показано, что непигментирован-ный штамм Б. гаёюёигат, не способный синтезировать каротиноиды, теряет устойчивость к у-излучению и другим видам стресса, развивающимся по свобод-норадикальному или оксидативному типу [3]. В этой связи значительный интерес представляет экзогенная антиоксидантная активность каротиноидов Б. гаёю-ёигат в приложении к эукариотическим растительным и животным организмам. Обнаружение такой активности могло бы создать основу для создания защитных антиоксидантных препаратов. Однако до настоящего времени не ясен вопрос о возможности проникновения экзогенных каротиноидов в клетки и клеточные мембраны, наличия у них мембранотроп-ных эффектов.

Удобным и информативным объектом изучения мембранотропной активности экзогенных соединений могут служить зеленые ткани растений, содержащие фотосинтетические структуры - хлоропласты и тила-коиды. Электронтранспортная цепь тилакоидов (ЭТЦТ), перенося электрон от воды к НАДФ+, обеспечивает поддержание протонного градиента, необходимого для работы мембранной АТФазы (фосфори-лирования). Перенос электрона по цепи поддерживается за счет энергии квантов света, поглощенной све-тособирающими комплексами и переданной в ЭТЦТ на молекулы активных центров фотосистем (ФС) I и II. Возбужденный активный центр ФС II (хлорофилл а - Р680) передает электрон к первичным акцепторам -

феофитину и QA с дальнейшим использованием энергии электрона на фотохимические нужды. В случае, если работа ЭТЦТ по каким-либо причинам блокируется, то альтернативным процессом, конкурирующим с передачей электрона от Р680 к феофитину, является возврат электрона с возбужденного уровня на основной. В этом случае молекула хлорофилла реакционного центра испускает квант красного света, т.е. наблюдается флуоресценция хлорофилла [4].

Поскольку мгновенно «запустить» ЭТЦТ невозможно, освещение предварительно адаптированных а темноте растений синим актиничным светом приводит к резкому росту красной флуоресценции хлорофилла в первые секунды после его включения до максимума Fm, после чего интенсивность флуоресценции постепенно снижается до некоторого стационарного уровня Fs. Описанное явление получило название эффект Каутского. В настоящее время хорошо известны механизмы, приводящие к появлению этого эффекта [5, 6]. Кинетика флуоресценции отражает многие параметры функционирования как реакционного центра, так и ЭТЦ в целом [7]. Коэффициент спада флуоресценции Rfd = (Fm-Fs)/Fs характеризует эффективность фотосинтеза. Мембранотропные ингибиторы фотосинтеза, такие как диурон, снижают Rfd, увеличивают Fs и Fm, блокируя передачу электрона по ЭТЦТ от QA к QB [6].

Целью настоящей работы являлось выявление мембранотропной активности каротиноидов Б. гаёю-ёигат, а также изучение характера их влияния на работу ЭТЦТ листьев лебеды садовой АМр1ех ко^етчь' по показателям кинетики флуоресценции хлорофилла.

Объект и методы исследований

Объект исследований. Использовали растения лебеды садовой A. hortensis высотой 15-20 см, несущие по 50-60 листьев. Растения выращивались при температуре 25 °С, относительной влажности почвы 60 %. Уровень фотосинтетически активной радиации - 120 мкмоль фотонов-с1 м-2. Почвогрунт производства «Интеркол» (Россия, Краснодарский край). В эксперименты отбирали световые листья (1 - 2-я пара сверху) 30^40 мм длиной.

Получение экстракта каротиноидов D. radiodu-rans. Радиорезистентные бактерии D. radiodurans ВКПМ 8209 выращивали в 250 мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл среды TGY следующего состава, г/л: триптон - 5,0; глюкоза - 1,0; дрожжевой экстракт - 3,0; вода дистиллированная - 1,0 л. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30 °С и 150 об/мин в течение 48 ч.

Каротиноиды D. radiodurans получали из бактериальной массы в виде раствора в гексане согласно ранее разработанному нами методу [8]. Далее к гек-сановому раствору добавляли 5 % триолеилглицери-на, гексан упаривали в токе сухого азота при комнатной температуре. Полученный экстракт кароти-ноидов в триолеилглицерине растворяли в 50-кратном количестве 0,5%-го раствора твина до концентрации каротиноидов 4 мкг/мл и использовали в микрофлуоресцентных экспериментах для нанесения на срезы листьев.

Обработка препаратом тканей листа и флуоресцентная микроскопия. Обработка интактных листьев растений растворами биологически активных веществ при проведении флуоресцентных исследований связана с известным рядом сложностей. Гидрофобная поверхность эпидермиса обычно не пропускает водные растворы. Проникновению жидкости в лист через устьица препятствуют воздушные полости, прилегающие к устьичным щелям. Чаще всего для обработки тканей зеленых листьев водными растворами предварительно удаляют воздух из зеленых тканей методом вакуумной инфильтрации. Такой метод обеспечивает эффективное проникновение водного раствора в лист, но он связан с грубым механическим давлением в направлении фронтальной плоскости листа и его дегазацией, что может приводить к появлению артефактов. Применяются также флуоресцентные методы исследования тонких срезов листьев. Однако в этом случае срезы помещают между предметным и покровным стеклами, где в малом объеме при освещении препарата очень быстро нарушаются естественные условия газообмена (избыток O2 и нехватка CO2), что сильно влияет на параметры флуоресценции.

Для решения вышеперечисленных трудностей нами предварительно был разработан новый прием тестирования водных растворов исследуемых веществ в экспериментах по изучению кинетики флуоресценции. Исследовали флуоресценцию хлорофилла, испускаемую с плоскости одинарного разреза листа, обработанного исследуемым раствором в объемной ячейке.

Делали поперечный срез через лист, после чего фрагмент листа помещали вертикально в ячейку с жидкой средой таким образом, чтобы поверхность среза оказывалась покрытой тонким (1^1,5 мм) слоем жидкости, ограниченным сверху покровным стеклом. Объем ячейки составлял 0,3 см3 и превышал объем фрагмента листа в 10^12 раз. Фрагмент листа в ячейке механически фиксировался.

Ячейку помещали перед объективом микроскопа. Использовали эпи-осветитель ОИ-21, оснащенный синим светодиодом мощностью 3 Вт с максимумом 465 нм и синими фильтрами BG28 по классификации Schott-Glass («ESCO products»). Для регистрации флуоресценции применяли черно-белую CCD-видеокамеру VNC-748-H3 («ЭВС», Россия, Санкт-Петербург), имеющую чувствительность до 0,0002 лк на объекте и функции ручного управления. На камере устанавливали объектив Avenir (относительное отверстие - 1,2, фокусное расстояние - 6 мм), а также интерференционные светофильтры фирмы «ESCO products» (США) 690 и 740 нм с полосой пропускания 10 нм - в соответствии с максимумами флуоресценции хлорофилла активных центров ФС I и II.

Видеосъемку предварительно выдержанных 30 мин фрагментов листьев производили с частотой 25 кадров/с в течение 5 мин. Актиничный свет включали через 5 с после старта видеозахвата, который осуществлялся программой VDub 1.8.1. C помощью этой же программы ^avi-файл преобразовывали в последовательность изображений (серия файлов *.bmp). Одно из таких изображений показано на рис. 1. Последовательность открывали в программе ImageJ. Получали численный временной ряд - зависимость средней яркости от номера кадра инструментами Analyse ^ Tools ^ ROI manager ^ More ^ Mul-tiMeasure, т.е. получали фотоиндукционную кривую, которую далее отображали средствами программного пакета OriginPro 8.0. Рассчитывали индекс Rfd. Эксперименты выполнялись в 8-кратной повторности. Для полученных выборочных значений рассчитывали стандартное отклонение и относительную ошибку при уровне значимости р = 0,95.

Рис. 1. Флуоресценция (к = 690 нм) листа A. hortensis на поперечном срезе

Результаты и обсуждение

В связи с тем что каротиноиды не растворимы в воде и применяются для обработки зеленых тканей растений только в смеси с детергентом (твином) и триолеилглицерином, были проведены предварительные исследования влияния этих двух соединений на кинетику флуоресценции. Раствор 0,5%-го твина существенного влияния на кинетику не оказывал (рис. 2). Различия амплитуды интенсивности флуоресценции для растений, обработанных дистилиро-ванной водой и триолеилглицерином, в точках Fs и Fm не выходили за пределы относительной ошибки (8 %). Воздействие твина не приводило к изменениям формы фотоиндукционной кривой (рис. 2).

с

Воздействие экстракта каротиноидов D. radiodu-rans существенно усиливало по сравнению с контролем (твин и триолеилглицерид) флуоресценцию зеленых тканей листа на всех участках кинетической кривой, с одновременным снижением Rfd (рис. 4). Кинетические кривые флуоресценции, полученные в условиях воздействия каротиноидов, очень близки по форме к кривым, зарегистрированным после обработки листьев диуроном (рис. 5).

п900 800 700 600 500 400 300 200 -100 - 0

с

■а

50

100

150

200 250

Время, с

0 50 100 150 200 250

Время, с

Рис. 2. Влияние 0,5%-го раствора твина на кинетику флуоресценции листьев A. hortensis. Типичная кривая.

1 - раствор твина; 2 - дистиллированная вода (контроль). Rfd = 2,02+0,15 (кривая 1), 1,94+ 0,1 (кривая 2)

Совместное воздействие твина и триолеилглице-рида (рис. 3) приводило к небольшому снижению интенсивности флуоресценции в точках Fs и Fm, а также

к некоторому изменению фотоидукционной кривой -исчезал 2-й максимум светимости, появляющийся в контроле на 75-й с.

Ч -| 700

Рис. 4. Влияние обработки смесью каротиноидов на кинетику флуоресценции листьев A. hortensis. Типичные кривые. 1 - обработка смесью каротиноидов (8 мкг/мл); 2 - обработка раствором 0,5%-го твина и 0,2%-го триолеилглицерида. Rfd = 0,08+0,01 (кривая 1); 1,85+ 0,1 (кривая 2)

Щ- -500

С -в-

Я -300

с

-

- 300

- 200 - 100 - 0

Время, с

Рис. 3. Влияние раствора 0,5%-го твина и 0,2%-го триолеилг-

лицерида на кинетику флуоресценции листьев A. hortensis. Типичная кривая. 1 - дистиллированная вода (контроль); 2 - раствор твина и триолеилглицерида. Ш = 1,94+ 0,1 (кривая 1), 1,85+0,1 (кривая 2)

0 50 100 150 200 250

Время, с

Рис. 5. Кинетика флуоресценции хлорофилла растений A. hortensis, модифицированной каротиноидами D. radiodurans и диуроном. Типичная кривая.

1 - обработка смесью каротиноидов; 2 - обработка

0,001%-м раствором диурона. Rfd = 0,08+0,01 (кривая 1), 0,41+0,03 (кривая 2)

Выявленный эффект позволяет сделать вывод о блокировании линейного ЭТЦТ каротиноидами D. radiodurans. Возможной причиной этого может являться функционирование каротиноидов как альтернативных акцепторов электрона в мембранах. Другим

1

700

600

500

2

400

300

1

200

0

2

100

0

- 900

1

- 800

- 700

- 600

2

- 500

- 400

-600

400

1

-200

2

100

0

0

50

100

150

200

250

важным выводом из результатов работы является сам факт проникновения экзогенных каротиноидов в клетки растений. С высокой вероятностью можно также предположить их взаимодействие с тилакоид-ными мембранами, т.е. наличие у экзогенных каротиноидов D. radiodurans мембранотропных свойств.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2011— 2012 гг.)» № 2.1.1/5630).

Литература

1. Micossi E., Mcsweeney S. Deinococcus radiodurans cells irradiation for proteomics experiments // European Synchrotron Radiation Facility. 2005. Experiment report form SC-1589, 01/03/2005. URL: http://193.49.43.2:8080/smis/servlet/User Utils?start (дата обращения: 05.05.2011).

2. Mattimore V., Battista J.R. Radioresistance of Deinococcus radiodurans: Functions necessary to survive ionizing

radiation are also necessary to survive prolonged desiccation // J. Bacteriol. 1997. Vol. 178. P. 633 - 637.

3. Evaluation of the antioxidant effects of carotenoids from Deinococcus radiodurans through targeted mutagenesis, chemiluminescence, and DNA damage analyses / B. Tian [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta. 2007. Vol. 1770. P. 902 - 911.

4. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза // Успехи биол. химии. 2003. T. 43. C. 225 - 266.

5. Govindjee. Sixty-three years since Kautsky chlorophyll a fluorescence // Aust. J. Plant Physiol. 1995. Vol. 22. P. 131-160.

6. Lazar D. The O-K-J-I-P Chlorophyll a Fluorescence Transient: Theory and Experiments. Olomouc, 2004. 62 р.

7. Krause, G.H., Weis E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis. The Basics // Ann Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. Vol. 42. P. 313 - 349.

8. Разделение и масс-спектрометрическая идентификация каротиноидов радиорезистентных бактерий Deinococcus radiodurans / В.С. Лысенко [и др.] // Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7, № 4. С. 278 - 282.

Поступила в редакцию_21 июня 2011 г.