CC BY
54
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
Комплексная структура ниши ГСК была особенно хорошо продемонстрирована в декабрьской публикации группы знаменитого Irving L. Weissman. C. K. F. Chan с соавт. разработали трансплантационный тест, позволивший воссоздать нишу ГСК in vivo в неестественном для нее месте — под почечной капсулой. Авторы выделяли клетки из костной ткани 14,5-дневных эмбрионов, еще не заселенной ГСК, и трансплантировали их взрослым мышам под капсулу почки, в результате чего происходила васкуляризация трансплантата и его превращение в гетеротопическую нишу для ГСК реципиента. Колонизация гетеротопической ниши клетками реципиентного животного проходила в следующем порядке. На 16-й день после трансплантации появлялись эритроидные клетки и формировалась сосудистая сеть; на 24-й день выявлялись c-Kit+ кроветворные клетки-предшественники; ГСК заселяли трансплантат не раньше 32-го дня.
Было обнаружено, что только С0105+/ТИу1~ клетки образуют костный мозг, заселенный ГСК. CD105+/Thy1 + клетки дают начало только костной ткани, без костного мозга, а клетки, негативные по обоим маркерам, не формируют ни кости, ни костного мозга. Таким образом, ни остеобласты, ни их предшественники сами по себе не способны обеспечить формирование функциональной ниши ГСК.
Как выяснилось, CD105+/Thy1~ клетки-предшественники образуют кость по механизму энхондраль-ного остеогенеза, т. е. через стадию хряща, a CD105+/ Thy1 + клетки утратили хондрогенный потенциал и могут дифференцироваться только в остеобласты. Генетическое ингибирование факторов, играющих центральную роль в энхондральном остеогенезе (Osterix) и васкуляризации (VEGF), нарушает формирование в трансплантате костного мозга, пригодного для заселения ГСК. Более того, трансплантация CD105+/Thy1~ клеток из фетальных костей, формирующихся путем внутримембранного остеогенеза (без этапа замещения хрящевой ткани костной — например, кости свода черепа), также приводит к образованию кости без костного мозга. В дальнейшем предстоит выяснить, каково истинное значение энхондрального остеогенеза в формировании костномозгового микроокружения ГСК и почему ГСК, как показали С. Lo Celso с соавт., всё же заселяют кости свода черепа. Очевидно, что комбинации методических подходов, предложенных исследовательскими группами R.A. Feldman, L. Li, D.T. Scadden и I.L. Weissman, с технологиями направленного мутагенеза помогут ответить на эти и многие другие вопросы касательно тонкой структуры гемопоэтической «ниши».
ЛИТЕРАТУРА:
1. Kiel M.J., Morrison S.J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat. Rev. Immunol. 2008; 8t4): 290—301.
2. Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W. et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 2003; 425(6960]: 841-846.
3. Zhang J., Niu C., Ye L., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 2003; 425C6960): 836—841.
4. Kiel M.J., Yilmaz O.H., Iwashita T. et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 2005; 121(71: 1109—1121.
5. Лелявский А.А. Уникальная микроархитектоника ниши нейральных стволовых клеток млекопитающих. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2008; 4 [3].
6. Sipkins D.A., Wei X., Wu J.W. et al. In vivo imaging of specialized
bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature 2005; 435(70441: 969-973.
7. Kawaguchi J., Kii I., Sugiyama Y., Takeshita S., Kudo A. The transition of cadherin expression in osteoblast differentiation from mesenchymal cells: consistent expression of cadherin-11 in osteoblast lineage. J. Bone Miner. Res. 2001; 16C2]: 260-269.
8. Baek W.Y., Lee M.A., Jung J.W. et al. Positive Regulation of Adult Bone Formation by Osteoblast-Specific Transcription Factor Osterix. J. Bone Miner. Res. 2008 Dec 29. PMID: 19113927
9. Kiel M.J., Radice G.L., Morrison S.J. Lack of evidence that hematopoietic stem cells depend on N-cadherin-mediated adhesion to osteoblasts for their maintenance. Cell Stem Cell 2007; 1 [21: 204—217.
10. Kiel M.J., Acar M., Radice G.L., Morrison S.J. Hematopoietic stem cells do not depend on N-Cadherin to regulate their maintenance. Cell Stem Cell 2008 Dec 30.
Подготовил А А. Лелявский
По материалам: Xie Y„ Yin T„ Wiegraebe W. et al. Detection of functional haematopoietic stem cell niche using real-time Imaging, Nature 2009; 457(7225): 97-101, Lo Celso C„ Fleming HE., Wu J.W. et al. Live-animal tracking of individual
haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature 2009:457(7225): 92-96.
Chan C.K., Chen C.C., Luppen C.A. et al. Endochondral ossification Is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature 2009; 457:490-4
Мембранный потенциал играет важную роль в дифференцировке ММСК
Во время эмбрионального развития и регенерации тканей ключевую роль в процессах пролиферации и дифференцировки различных типов стволовых клеток и клеток-предшественниц играет не только молекулярная, но и биофизическая сигнализация, то есть биоэлектрические сигналы, генерируемые при участии ионных каналов, имеющихся в клеточной мембране [1, 2]. Например, на модели дифференцировки клеток нейробла-стомы было продемонстрировано, что дифференцировка сопровождается деполяризацией мембраны, вызываемой работой калиевых и натриевых ионных каналов [3].
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
На модели заживления раны роговицы также было показано, что колебания мембранного потенциала, создающие в ткани электрические поля, регулируют миграцию клеток [4], их поляризацию и частоту делений [5]. На данный момент, к сожалению, о биоэлектрических сигналах и их роли в развитии и регенерации известно удручающе мало.
Одним из самых интересных направлений в изучении биоэлектрических сигнальных систем является контроль поведения стволовых клеток. Исследования показывают, что стволовые клетки в недифференцированном
А
■ И I II II
Новости клеточных технологий
состоянии демонстрируют уникальный профиль электро-физиологических характеристик мембраны [6—10]. Более того, ионные токи имеют огромное значение для дифференцировки миобластов, кардиомиоцитов и нервных клеток [6, 10—13]. Например, при дифференцировке и слиянии миобластов потенциал их мембраны изменяется от —10 до ^70тУ (мембрана становится более отрицательно заряженной, или гиперполяризуется) [14, 15]. Но являются ли эти электрофизиологические сигналы следствием или причиной происходящих в клетках изменений, оставалось до настоящего времени невыясненным. В ноябре 2008 г. была опубликована работа научной группы Б. Бипсіеіасгиі , в которой ученые охарактеризовали изменения мембранного потенциала (Утет) мультипо-тентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека при их дифференцировке в ади-погенном и остеогенном направлениях, а также изучили функциональную взаимосвязь изменений мембранного потенциала и способности клеток к дифференцировке.
Чтобы определить, зависит ли изменение мембранного потенциала ММСК от стадии их дифференцировки, исследователи проследили Утет ММСК в процессе их остеогенной и адипогенной дифференцировки, индуцированной дексаметазоном и индометацином соответственно, с помощью потенциал-чувствительного флуоресцентного красителя 0іБВАС2 [16]. Этот краситель представляет собой анионный бис-оксонол, который
встраивается в мембрану при деполяризации клетки. Выяснилось, что флуоресценция по мере дифференцировки ММСК постепенно исчезает, то есть их мембранный потенциал снижается и происходит гиперполяризация мембраны. Причем гиперполяризация происходит постепенно в течение второй, третьей и четвертой недели дифференцировки, достигая максимума к концу четвертой недели после индукции дифференцировки.
Обнаружив зависимость мембранного потенциала от стадии дифференцировки клетки, авторы работы решили проверить, является ли эта гиперполяризация функционально необходимой для дифференцировки. Чтобы это выяснить, они нарушили естественное изменение мембранного потенциала, искусственно деполяризовав мембрану ММСК, в которых уже была запущена диф-ференцировка. Для этого были применены два разных подхода.
Первый подход заключался в повышении в среде культивирования концентрации ионов калия [К+]. В норме внутриклеточная концентрация калия выше концентрации калия вне клетки, и мембрана остается слабо гипер-поляризованной. Когда концентрации ионов по обе стороны от мембраны уравниваются, ее заряд становится равным нулю, то есть мембрана деполяризуется. Второй, более сложный подход, состоял в блокировании 1Ма+/К+ АТФазы, основного генератора трансмембранного потенциала, специфическим ингибитором уабаином (рис.).
Мембранный
потенциал
Дифференцированные производные ММС К Н е дифференцированные ММС К
(остеобласты, аципоциты)
Влияние величины мембранного потенциала на дифференцировку ММСК in vitro
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
Эффекты деполяризации были оценены по экспрессии характерных для адипогенной и остеогенной дифференцировки генов с помощью метода полимеразной цепной реакции. В случае адипогенной дифференцировки анализировались специфические для адипоцитов транскрипционный фактор PPARG [17, 18] и ген специфической липопротеин-липазы (LPL), активируемый транскрипционным фактором PPARG. Также колонии клеток были окрашены специфическим для липидных включений красителем OI Red О. Для оценки остеогенной дифференцировки определялась экспрессия двух специфичных генов: щелочной фосфатазы (ALP) и костного сиалопротеина (BSP) [19]. Помимо этого исследователи анализировали активность ALP и внутриклеточную концентрацию ионов кальция.
Оказалось, что деполяризация клеточной мембраны с помощью ионов К+ (концентрация в среде культивирования — от 20 до 80 тМ) ингибирует адипоцитарную дифференцировку, о чем свидетельствовали снижение экспрессии обоих маркерных генов и данные специфической гистологической окраски. При этом ингибирование дифференцировки было обратимым — при возвращении в стандартные условия культивирования через три недели ММСК восстанавливали способность отвечать на индометацин. Чтобы убедиться, что подавление дифференцировки не специфично для ионов К+, а действительно является следствием деполяризации, исследователи подтвердили свои результаты, оценив адипогенную дифференцировку ММСК при ингибировании Na+/K+ АТФазы. Эффект оказался таким же, хотя блокирование Na+/K+ мембранной помпы в несколько меньшей степени снижало экспрессию маркерных генов, нежели повышение концентрации калия во внешней среде. Возможно, в клетках просто существуют другие механизмы поддержания мембранного потенциала помимо Na+/K+ АТФазы. При этом подавление дифференцировки, как было показано в отдельной серии экспериментов, оказалось дозозависимым и коррелировало с продолжительностью присутствия деполяризующего агента в среде культивирования.
Сходным образом деполяризация с помощью ионов калия или уабаина ингибировала остеогенную дифференцировку ММСК. Наблюдалось снижение уровней экспрессии LPL и BSP, снижение активности щелочной фосфатазы и концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток. Были показаны те же, что и в случае адипогенной дифференцировки, корреляции, то есть снижение способности клеток отвечать на дифференцировочный стимул было тем больше, чем выше была концентрация и продолжительность воздействия деполяризующего агента. Интересный момент: после удаления деполяризующего агента из среды культивирования, Vmem возвращался к исходному уровню, а экспрессия маркерных генов не восстанавливалась.
Деполяризация ингибировала дифференцировку ММСК в двух направлениях, однако этого результата было недостаточно для полного представления о мембранном потенциале как о ключевом специфическом регуляторе дифференцировки. Поэтому исследователи провели дополнительную серию опытов, чтобы выяснить, насколько влияет на способность к дифференцировке противоположное деполяризации состояние — гиперполяризация.
ММСК, дифференцирующиеся в остеогенном направлении, подвергли воздействию веществ, активирующих калиевые АТФ-зависимые каналы: пинацидила и диа-зоксида. Эти вещества, как было показано в нескольких работах, приводят к гиперполяризации мембран клеток различных типов [20—23]. Через семь суток после воздействия гиперполяризующих агентов была оценена экспрессия маркерных генов остеогенной дифференцировки. Действительно, оказалось, что экспрессия этих генов повышается: пинацидил резко повышал экспрессию костного сиалопротеина (примерно в 2 раза) и практически не влиял на экспрессию гена щелочной фосфатазы. Диазоксид повышал экспрессию обоих генов в 2^4 раза. Эффект обоих гиперполяризующих агентов, как и в случае деполяризующих, был дозозависмый — с увеличением концентраций агентов повышалась и экспрессия маркерных генов, достигая своего максимума при Утет =10 тУ.
Было бы интересно выяснить, насколько искусственное изменение мембранного потенциала ММСК может влиять на их дифференцировку в других направлениях, помимо адипогенного и остеогенного, хотя уже на данный момент влияние деполяризации и гиперполяризации на дифференцировку очевидно. Работа группы Б. Бипйе1асги2 убедительно доказывает, что изменение мембранного потенциала в сторону гиперполяризации предшествует дифференцировке клеток, и что посредством него можно увеличивать эффективность дифференцировки ММСК под действием индукторов дифференцировки. Деполяризованное состояние мембраны определяет недифференцированное состояние клеток.
В настоящее время уже существует ряд предположений относительно механизмов того, каким образом уровень Утет контролирует внутриклеточные пути сигнализации посредством системы вторичных посредников [1]. В настоящее время авторы работы занимаются изучением влияния на дифференцировку клеток баланса внутриклеточной и внеклеточной концентраций ионов кальция, а также других механизмов изменения мембранного потенциала. Они убеждены, что в будущем методы контроля Утет войдут в повседневную лабораторную и клиническую практику, и будут широко использоваться для стимуляции дифференцировки различных типов стволовых клеток в заданном направлении.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Levin М. Large-scale biophysics: ion flows and regeneration. Trends in Cell Biology 2007; 17: 261-70.
2. McCaig C.D., Rajnicek A.M., Song B., Zhao M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiological Reviews 2005; 85: 943—78.
3. Arcangeli A., Rosati B., Crociani 0. et al. Modulation of HERG current and herg gene expression during retinoic acid treatment of human neuroblastoma cells: Potentiating effects of BDNF. Journal of Neurobiology 1999; 40: 214-25.
4. Zhao М., Song B., Pu J. et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-c and PTEN. Nature 2006; 442: 457-60.
5. Song B., Zhao М., Forrester J.V., McCaig C.D. Electrical cues
regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. PNAS 2002; 99: 13577-82.
6. Biagiotti T., D’Amico M., Marzi I. et al. Cell renewing in neuroblastoma: Electrophysiological and immunocytochemical characterization of stem cells and derivatives. Stem Cells 2006; 24: 443—453.
7. Cai J., Cheng A., Luo Y. et al. Membrane properties of rat embryonic multipotent neural stem cells. Journal of Neurochemistry 2004; 88: 212—26.
8. Gersdorff Korsgaard M.P., Christophersen P., Ahring P.K., Olesen
S.P. Identification of a novel voltage-gated Na+ channel rNav1.5a in the rat hippocampal progenitor stem cell line HiB5. Pflugers Archiv European Journal of Physiology 2001; 443: 18—30.
9. Heubach J.F., Graf E.M., Leutheuser J. et al. Electrophysiological properties of human mesenchymal stem cells. Journal of Physiology 2004; 554: 659-72.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
■ И I и и
■TD
Новости клеточных технологий
10. Van Kempen Van Ginneken A., De Grijs I. et al. Expression
of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cellular Physiology and Biochemistry 2003; 13: 263—70.
11. Cho T., Bae J.H., Choi H.B. et al. Human neural stem cells: Electrophysiological properties of voltage-gated ion channels. NeuroReport 2002; 13: 1447-52.
12. Konig S., Hinard V., Arnaudeau S. et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry 2004; 279: 28187-96.
13. Sun W., Buzanska L., Domanska-Janik K. et al. Voltage-sensitive and ligand-gated channels in differentiating neural stem-like cells derived from the nonhematopoietic fraction of human umbilical cord blood. Stem Cells 2005; 23: 931-45.
14. Fischer-Lougheed J., Liu J.H., Espinos E. et al. Fluman myoblast fusion requires expression of functional inward rectifier Kir2.1 channels. Journal of Cell Biology 2001; 153: 677—85.
15. Liu J.FI., Bijlenga P., Fischer-Lougheed J. et al. Role of an inward rectifier K+ current and of hyperpolarization in human myoblast fusion. Journal of Physiology 1998; 510: 467—76.
16. Altizer A.M., Moriarty L.J., Bell S.M. et al. Endogenous electric
current is associated with normal development of the vertebrate limb. Developmental Dynamics 2001; 221: 391—401.
17. Avram M.M., Avram A.S., James W.D. Subcutaneous fat in normal and diseased states. 3. Adipogenesis: From stem cell to fat cell. Journal of the American Academy of Dermatology 2007; 56: 472—92.
18. Spiegelman B.M. PPAR-c: Adipogenic regulator and thiazolidinedione receptor. Diabetes 1998; 47: 507—14.
19. Zur Nieden N.I., Kempka G., Ahr H.J. In vitro differentiation of embryonic stem cells into mineralized osteoblasts. Differentiation 2003; 71: 18-27.
20. Hoenicke E.M., Damiano Jr R.J. Superior 12-hour heart preservation with pinacidil hyperpolarizing solution compared to University of Wisconsin solution. Journal of Heart and Lung Transplantation 2001; 20: 1106—14.
21. Lawson K. Potassium channel openers as potential therapeutic weapons in ion channel disease. Kidney International 2000; 57: 838—45.
22. Nielsen-Kudsk J.E. Potassium channel modulation: A new drug principle for regulation of smooth muscle contractility. Studies on isolated airways and arteries. Danish Medical Bulletin 1996; 43: 429—47.
23. Xiong Y., Harmon C.S. Evidence that diazoxide promotes calcium influx in mouse keratinocyte cultures by membrane hyperpolarization. Skin Pharmacology 1995; 8: 309—18.
Подготовила А.С. Григорян
По MarepnanaMiSundelacruz S., Levin M„ Kaplan D.L. Membrane potential controls adipogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells, Plos One 2008; 3
Идентификация истинно стволовых клеток скелетной мышечной ткани в популяции миосателлитоцитов
В результате эмбрионального миогистогенеза из стволовых клеток миотома сегментированной мезодермы путем дивергентной дифференцировки развиваются два взаимодействующих между собой дифферона: камбиальный и симпластический, которые формируются параллельно и определяют в постнатальном периоде репаративные свойства [1, 2]. Первый дифферон представлен миосателлитоцитами, впервые описанными A. Mauro (1961), развивающимися из промиоцитов, локализуется между базальной пластинкой и сарколеммой мышечных волокон и является морфофункциональной основой камбиального резерва тканевой системы скелетной мышцы. В постнатальном периоде активная пролиферация миосателлитоцитов определяется уже к третьему дню после повреждения ткани. После серии митозов в посттравматическом рабдомиогенезе из них формируется популяция миобластов, которые, сливаясь, образуют новые мышечные симпласты [1—3]. Симпластический дифферон также участвует в репаративной регенерации: вблизи линии разрыва волокна делятся, ядра, симпласты колбообразно утолщаются с формированием «мышечных почек», растущих по направлению друг к другу с тенденцией к слиянию [4]. Однако вопрос о механизмах репаративной регенерации мышечных симпластов до настоящего времени остается дискуссионным. Это связано с появлением данных о возможности реализации репаративного процесса за счет клеток, образующихся посредством отделения ядросодержащей части симпластов. Значительную сложность представляет собой доказательство этого механизма, так как с момента отделения «ядерно-саркоплазмати-ческой территории» (если этот процесс реален), она становится неотличима по ультраструктуре от мио-сателлитоцита [2].
Несмотря на наличие ряда механизмов репаративной регенерации скелетной мышечной ткани, гистоти-пическое восстановление целостности мышц после значительных повреждений ограничено — место дефекта заполняется соединительной тканью [4]. В этой связи достаточно перспективным является изучение механизмов стимуляции репаративной регенерации скелетной мышечной ткани [2], особенно в части, касающейся миосателлитоцитов.
Большинство исследователей отмечают, что популяция миосателлитоцитов гетерогенна, однако нет общепринятого унифицированного разделения на субпопуляции: каждая исследовательская группа предлагает свой вариант в соответствии с поставленными целями и примененными методами. В частности, замечено, что мио-сателлитоциты различаются по экспрессии CD34 и Myf5 с присутствием немногочисленной фракции, представители которой не экспрессируют ни один из них [5]. Ряд авторов предполагают, что именно эта группа составляет популяцию стволовых клеток, в то время как оставшаяся большая часть — коммитированные в миогенном направлении клетки [6, 7]. По другим данным, экспрессия Myf5 отражает лишь степень активности, а не детерминацию дифференцировки, за которую ответственен MyoD [8].
Одной из важнейших характеристик стволовых клеток является способность к самообновлению in vivo — долгосрочной пролиферации без сопутствующей дифференцировки [9]. Поэтому для обоснованного определения одной из субпопуляций миосателлитоцитов как миогенных стволовых клеток большинство исследователей пытаются установить способность их к многократному делению, используя, главным образом, метод серийных трансплантаций [10, 11], который, однако, не обладает достаточной чувствительностью и не позволяет в полной
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
