CC BY
20
УДК 615; 616-05
Механизмы защиты сердца синтетическим агонистом рецепторов галанина при повреждении хроническим введением доксорубицина
И. М. Студнева1, О. М. Веселова1, A. A. Бахтин2, Г. Г. Коновалова1, В. З. Ланкин1, О. И. Писаренко1*
Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии Минздрава России, Москва, 121552 Россия
2Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России, Москва, 123182 Россия
*E-mail: olpi@live.ru
Поступила в редакцию 27.07.2019
Принята к печати 29.11.2019
DOI: 10.32607/actanaturae.10945
РЕФЕРАТ Применение противоопухолевого препарата доксорубицина (Докс) ограничено из-за его карди-отоксического действия. Изучено влияние нового синтетического агониста рецепторов галанина GalRl-3 [ßAla14, His15]-галанин (2-15) (G) на метаболизм, активность антиоксидантных ферментов, окислительный стресс и функцию сердца у крыс с кардиомиопатией (КМП), вызванной хроническим введением Докс. Совместное введение пептида G и Докс статистически значимо увеличивало фракцию укорочения (ФУ) и фракцию выброса (ФВ) в среднем на 30 ± 4% по сравнению с этими показателями в группе Докс. Уменьшение дисфункции сердца под действием G сочеталось со снижением в 2.5 раза активности креатинкиназы-МВ (КК-МВ) в плазме крови. Защитное действие пептида G обусловлено снижением пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) вследствие увеличения активности Си^п-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-SOD) и глутатионпероксидазы (GSH-Px) в поврежденном сердце. Введение пептида G статистически значимо увеличивало пул адениннуклеотидов (SAH), АТР, фосфокреатина (ФКр) и общего креатина (ИКр) в поврежденном миокарде, а также снижало накопление лактата по сравнению с этим показателем в группе Докс. Улучшение энергетического обеспечения кардиомиоцитов под действием пептида G предотвращало накопление цитотоксичного аммиака и нарушения обмена ключевых аминокислот сердца - глутамино-вой (Глу) и аспарагиновой (Асп), а также аланина (Ала). Пептид G снижал морфологические изменения в сердце крыс, получавших Докс. Результаты указывают на перспективность использования пептида G для эффективной коррекции функциональных, морфологических и метаболических повреждений сердца при химиотерапии антрациклинами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА антиоксидантные ферменты, галанин, доксорубицин, крыса, метаболизм миокарда. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота; АЭЗ - аденилатный энергетический заряд; АФК - активные формы кислорода; Докс - доксорубицин; И/Р - ишемия/реперфузия; КК-МВ -креатинкиназа-МВ; КМП - кардиомиопатия; Кр - креатин; ЛЖ - левый желудочек; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ТБКАП - тиобарбитуратные кислотно-активные продукты; ФВ - фракция выброса; ФКр - фосфокреатин; ФУ - фракция укорочения; ЭхоКГ - эхокардиография; CAT - каталаза; Cu,Zn-SOD -Cu^n-супероксиддисмутаза; GSH-Px - глутатионпероксидаза; PPARs - рецепторы, активируемые проли-фераторами пероксисом; ХАН - пул адениннуклеотидов; £Кр - общий креатин.
ВВЕДЕНИЕ
Снижение выработки энергии кардиомиоцитами, вызванное нарушением функций митохондрий или токсическим воздействием лекарственных препаратов, может приводить к хроническому повреждению ми-
окарда. Доксорубицин (Докс) - противоопухолевое средство антрациклинового ряда - способен вызывать развитие кардиомиопатии (КМП) и сердечной недостаточности, что ограничивает его использование в онкологической практике [1]. Кардиотоксичность,
инициируемая Докс, является многофакторным процессом, который приводит к гибели кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток [2]. Ключевые причины кардиотоксичности Докс - нарушения окислительного фосфорилирования и генерация активных форм кислорода (АФК), вызывающих перекисное окисление липидов (ПОЛ) [3]. Оптимизация режимов введения Докс и применение его липосомальных форм не устраняют высокую кардиотоксичность этого препарата [4]. В связи с этим актуальной остается разработка лекарственных средств, предотвращающих или ослабляющих повреждения сердца, вызванные Докс. Ранее нами было показано, что экзогенные ^концевые фрагменты галанина (2-11) и (2-15), связываясь с рецептором GalR2, оказывают защитное действие на кардиомиоциты при ишемическом и реперфузионном (И/Р) повреждении. Оно обусловлено снижением образования супероксидных радикалов в митохондриях и запуском сигнальных каскадов, приводящих к уменьшению гибели клеток от апоптоза и некроза [5, 6]. Впоследствии мы синтезировали ряд пептидных аналогов фрагментов гала-нина (2-11) и (2-15) с сохранением фармакофорных аминокислотных остатков, ответственных за связывание с рецептором GalR2. Тестирование этих пептидов на моделях И/Р повреждения сердца выявило их кардиотропные свойства [7]. Наиболее эффективной оказалась химерная молекула, представляющая последовательность галанина (2-13), дополненную природным дипептидом карнозином, Н-Тгр-Т^-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-PAla-His-OH [8]. Пептид G улучшал функцию сердца крыс, интегрированность мембран и энергетическое состояние кардиомиоцитов при хроническом повреждении миокарда Докс [9], что указывало на его влияние на метаболизм миокарда. Однако механизмы действия этого соединения остаются малоизученными. В связи с этим цель настоящей работы заключалась в исследовании действия пептида G на менее изученные мишени Докс - активность антиоксидантных ферментов и показатели азотистого и углеводного обмена в сердце крыс при кардиомиопатии, моделированной введением Докс. Кардиотоксическое действие Докс характеризовали изменениями активности креатинкиназы-МВ (КК-МВ) в крови, уровнем окислительного стресса в сердце и плазме крови животных и морфологическим состоянием миокарда.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для моделирования кардиомиопатии использовали хроническое введение Докс, описанное в работе [9]. Животные были разделены на четыре группы. Контрольная группа (К) - внутрибрюшинное введение физиологического раствора (1 мл/кг веса еженедельно в течение 8 недель); Докс (Д) - вну-трибрюшинное введение Докс (1 мг/кг веса еженедельно в течение 8 недель); Докс + пептид G (Д + G) - внутрибрюшинное введение Докс (1 мг/кг веса еженедельно в течение 8 недель) и подкожное введение пептида G (50 нмоль/кг веса ежедневно в течение 8 недель); пептид G (G) - подкожное введение G (50 нмоль/кг веса ежедневно в течение 8 недель). Перед проведением исследования (исходное состояние) и после 8-недельного эксперимента животных взвешивали, в плазме крови определяли активность креатинкиназы-МВ (КК-МВ) и содержание тиобар-битуратных кислотно-активных продуктов (ТБКАП). Показатели функции сердца оценивали методом эхокардиографии (ЭхоКГ). По окончании 8-недель-ного эксперимента у наркотизированных животных каждой группы (уретан, 120 мг/кг) извлекали сердца для определения содержания метаболитов и ТБКАП, активности антиоксидантных ферментов и морфологического исследования.
Модифицированный N-концевой фрагмент галанина G
Пептид G (H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-ßAla-His-OH, молекулярная масса 1499.7) получен путем ступенчатого твердофазного синтеза с использованием Fmoc-методологии [7]. Пептид G очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе, его структура охарактеризована с помощью :Н-ЯМР-спектроскопии и MALDI-масс-спектрометрии [8].
Трансторакальная ЭхоКГ
Применена высокочастотная ультразвуковая система Vevo 1100 Visual Sonic (FUJILM, Нидерланды) с линейным датчиком 13-24 МГц и максимальной глубиной лоцирования 30 мм. Исследование проводили у крыс под наркозом (Золетил 100, Virbac Sante Animale, Франция, 5 мг/кг) с использованием пара-стернального доступа по короткой и длинной осям. В B-режиме измеряли диастолические и систолические размеры левого желудочка (ЛЖ), на их основе рассчитывали параметры ЛЖ в диастоле и систоле, а также фракции выброса (ФВ) и укорочения (ФУ).
Дизайн эксперимента
Опыты выполнены на крысах-самцах линии Вистар весом 280-300 г, полученных из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.
Определение содержания метаболитов в ткани сердца
Часть ткани сердец, замороженных в жидком азоте, гомогенизировали в холодной 6% НС104
(10 мл/г ткани) в гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 (IKA-Labortechnik, Германия). Белки осаждали центрифугированием (центрифуга Sorvall RT1, Thermo Fisher Scientific, США) при 2800g в течение 10 мин при 40С. Супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7.4. Осадок KClO4 отделяли центрифугированием в тех же условиях. Безбелковые экстракты хранили при -20°С до определения метаболитов. Сухой вес гомогенизированной ткани определяли после высушивания образцов в течение суток при 1100С. Содержание адениннуклеотидов (АТР, ADP и АМР), фосфокреатина (ФКр), креатина (Кр), глюкозы, лактата, глутаминовой и аспа-рагиновой кислот, аланина и аммиака в экстрактах определяли энзиматическими методами [10] с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1800 (Япония).
Определение активности антиоксидантных ферментов и ТБКАП в сердце
Оставшуюся часть замороженной ткани сердец крыс гомогенизировали в 50 мМ Na-фосфатном буфере рН 7.4 (10 мл/г ткани) при помощи гомогенизатора Ultra-Turrax T-25 (IKA-Labortechnik, Германия) и центрифугировали на центрифуге Sigma 3-16 KL (США) при 1000g и 4 °С в течение 10 мин. Содержания ТБКАП определяли в гомогенатах, активность Си^п-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-SOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы (GSH-Px) - в супер-натантах. Белок в супернатанте определяли по методу Лоури. Все измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu 2600 (Япония). Содержание ТБКАП определяли в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (2ТБК) при X = 532 нм [11]. Активность Cu,Zn-SOD определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления ксанти-на ксантиноксидазой при X = 560 нм [12]. Активность САT измеряли по скорости расходования пероксида водорода (Н2О2) при 200С в течение 1 мин, принимая коэффициент молярной экстинкции Н2О2 равным 43.6 М-1см-1 [13]. Активность GSH-Px определяли по скорости окисления NADPH в сопряженной глутати-онредуктазной системе при X = 340 нм. В качестве субстрата использовали Н2О2. Реакцию проводили в присутствии 3 мМ азида натрия для ингибирования CAT [14].
Оценка повреждения клеточных мембран и концентрации ТБКАП в плазме
Активность КК-МВ определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) при X = 340 нм, используя наборы фирмы BioSystems. Концентрацию ТБКАП в плазме определяли по образованию окра-
шенного комплекса в реакции с 2ТБК, который экстрагировали из реакционной смеси бутанолом [15].
Морфологическое исследование
Сердца крыс каждой группы фиксировали в 10% растворе забуференного формалина (рН 7.4) в течение 24 ч. Из верхней части ЛЖ вырезали слайс толщиной 2 мм, перпендикулярный длиннику органа, содержащий свободную стенку ЛЖ. Затем образцы обрабатывали в спиртах возрастающей концентрации (70-100%), ксилоле и заливали в парафин. Далее формировали парафиновые блоки с последующим изготовлением срезов толщиной 5-7 мкм. После высушивания срезов в горизонтальном положении проводили обзорную окраску гематоксилином и эозином (ГЭ), а также окрашивание гематоксилин-основной фуксин-пикриновой кислотой (ГОФП) для выявления фуксинофильных кардиомиоцитов [16]. Использовали оптический микроскоп Leica DM2500 (Германия).
Статистическая обработка результатов
Использовали пакет программ SigmaPlot 11.2 (SysStat, США). Результаты представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (М ± m). Различия между группами подтверждены статистически с применением дисперсионного анализа (ANOVA). При сравнении нескольких групп с контролем использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми отличия считали при Р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние пептида G на кардиотоксичность и окислительный стресс
ЭхоКГ-исследование животных контрольной группы не выявило изменений в частоте сокращений сердца и показателях сократимости ЛЖ по сравнению с исходным состоянием спустя 8 недель наблюдения. При введении Докс у животных развивалась КМП -конечно-систолический размер (КСР) ЛЖ был увеличен, а фракция укорочения (ФУ) и фракция выброса (ФВ) были снижены до 67 и 69% соответственно (рис. 1А-В). Совместное введение Докс и пептида G статистически значимо уменьшало КСР ЛЖ и увеличивало ФУ и ФВ по сравнению с этими показателями в группе Д. Развитие КМП под действием Докс сопровождалось активацией ПОЛ и повреждением мембран кардиомиоцитов. После 8 недель исследования содержание ТБКАП в сердце и плазме крови крыс, получавших Докс, было выше, чем у животных контрольной группы (рис. 1Г, Д). Совместное введение пептида G и Докс значимо снижало этот показатель.
6 5
5 4
6 3
2 1 0
Л
ИС К Д Д+G С
60 50
о 40
£
> зо ^ е
20 10 0
ИС
К Д Д+С С
90 75 Н 60 Й 45 н
е
30 15 0
*#
ИС
К Д Д+С С
К
I
Д Д+С С
30 25
| 20
С
<
К
ш
15 10 5 0
л
ИС
Д *#
К Д Д+С С
700
600
\ 500-ш
Ч 400 Н со
^ 300 Н К
К200 100 ^ 0
ИС
*#
К Д Д+С С
Рис. 1. Показатели ЭхоКГ, окислительного стресса и повреждения мембран кардиомиоцитов в исследуемых группах. А - конечно-систолический размер (КСР) ЛЖ. Б - фракция укорочения (ФУ = (КДР - КСР)/КДРх 100%), где КСР и КДР - конечно-систолический и конечно-диастолический размеры ЛЖ. В - фракция выброса (ФВ = (КДО - КС0/КД0х100%)), где КДО и КСО - конечно-диастолический и конечно-систолический объемы ЛЖ. Г - содержание тиобарбитуратных кислотно-активных продуктов (ТБКАП) в сердце. Д - концентрация ТБКАП в плазме крови. Е - активность креатинкиназы-МВ (КК-МВ) в плазме крови. ИС - исходное состояние, К - контроль, Д - доксорубицин, Д + С - доксорубицин + пептид С, С - пептид С. Данные представлены как М ± т (п = 12). Р < 0.05 от: * ИС, # К, л Д, + Д + С
Б
В
Е
0
В конце исследования активность КК-МВ в группе Д была почти в 3 раза выше, чем в контроле (рис. 1Е). Введение пептида G одновременно с Докс снижало этот показатель практически до значения в контроле. Под действием одного пептида G изменений в ЭхоКГ-показателях, содержании ТБКАП в сердце и плазме и активности КК-МВ в плазме крови не происходило. Таким образом, пептид G снижал повреждающее действие Докс, уменьшая окислительный стресс и повреждения мембран кардиомиоцитов.
Влияние пептида О на морфологические изменения в миокарде
В контроле при окрашивании ГЭ отмечали небольшое полнокровие и умеренный стаз эритроцитов в сосудах капиллярного типа (рис. 2А). При окра-
ске по ГОФП очаги фуксинофилии не обнаружены, что косвенно свидетельствует об отсутствии контрактуры и ишемии миокарда [17]. В группе Д в большинстве случаев наблюдался выраженный стаз эритроцитов в капиллярах, а также полнокровие. При окрашивании по ГОФП в половине случаев наблюдали множественные очаги фуксинофилии кар-диомиоцитов, носящие как диффузный, так и очаговый характер (рис. 2Б). В группе Д + G лишь в одном случае на фоне выраженного стаза эритроцитов и полнокровия выявлены единичные кардиомиоци-ты с фуксинофилией (рис. 2В). В большинстве сердец животных группы G очаги фуксинофилии не обнаружены. При введении одного пептида G наблюдали незначительный стаз эритроцитов, как и в контрольной группе. При окрашивании ГОФП единичные фукси-
Б
Рис. 2. Влияние пептида G на морфологические изменения сердца крыс, получавших Докс. А - контроль, ГЭ, Х200. Незначительное полнокровие и стаз эритроцитов. Б - группа Докс, ГОФП, Х200. Обширные очаги фуксинофилии кардиомиоцитов. В - группа Д + G, ГОФП, Х200. Группы единичных кардиомиоцитов, проявляющих цитоплазматическую фуксинофилию. Г - группа G, ГОФП, Х200. Незначительный стаз эритроцитов, отсутствие фуксинофильных кардиоми-оцитов
Таблица 1. Влияние Докс и пептида G на активность антиоксидантных ферментов в сердце крыс после 8-недельного исследования
Группа крыс Cu,Zn-SOD CAT GSH-Px
Контроль 220.75 ± 17.92 16.73 ± 0.43 0.21 ± 0.01
Докс 165.50 ± 22.77 21.50 ± 0.50* 0.16 ± 0.01*
Докс + G 259.64 ± 13.78# 23.67 ± 1.49* 0.20 ± 0.01#
G 227.55 ± 19.31 19.13 ± 1.08 0.19 ± 0.01
Примечание. Данные представлены как М + т (п = 6) и выражены в ед. активности/мг белка. Р < 0.05 от: * контроля; # Докс + G.
Влияние пептида G на активность антиоксидантных ферментов сердца
Отмечено, что действие Докс приводит к снижению активности GSH-Px, появлению тенденции к уменьшению активности Cu,Zn-SOD и увеличению активности CAT по сравнению с контролем (табл. 1). Совместное введение Докс и G статистически значимо увеличивало активность Cu,Zn-SOD и GSH-Px и незначимо CAT (P = 0.082) по сравнению с этими показателями в группе Д. Введение одного пептида G не влияло на активность ферментов.
нофильные кардиомиоциты обнаружены лишь в одном случае. У основной части животных группы G очаги фуксинофилии кардиомиоцитов не выявлены (рис. 2Г). Таким образом, введение пептида G снижало морфологические изменения в сердце крыс, вызванные воздействием Докс.
Влияние пептида G на показатели энергетического обмена сердца
После 8 недель исследования общий пул аденинну-клеотидов (ХАН) в сердце и аденилатный энергетический заряд (АЭЗ) кардиомиоцитов у крыс группы Д были статистически значимо ниже, чем в контроле, за счет уменьшения содержания АТР (табл. 2).
Таблица 2. Влияние Докс и пептида G на энергетическое состояние миокарда крыс после 8-недельного исследования
Метаболит Контроль Докс Докс + G G
АТР 18.84 ± 1.17 11.83 ± 1.33* 16.31 ± 1.32# 18.91 ± 1.97#
ADP 5.47 ± 0.11 5.60 ± 0.35 7.28 ± 0.47*# 6.30 ± 0.33*
АМР 0.92 ± 0.06 1.14 ± 0.16 1.58 ± 0.15* 1.50 ± 0.10*
ХАН 25.24 ± 1.22 18.56 ± 1.66* 25.18 ± 1.50# 25.71 ± 1.13#
АЭЗ 0.86 ± 0.01 0.78 ± 0.02* 0.79 ± 0.01* 0.85 ± 0.02
ФКр 22.57 ± 1.52 12.08 ± 1.25* 17.74 ± 1.14*# 20.66 ± 2.04#
Кр 34.94 ± 2.64 38.34 ± 3.80 38.24 ± 3.89 37.43 ± 2.67
ХКр 57.51 ± 1.67 50.42 ± 2.26* 55.98 ± 2.12 58.09 ± 2.81#
Примечание. Данные представлены как М ± т (п = 6) и выражены для метаболитов в мкмоль/г сух. веса. ХАН = АТP+АDP+АМP; АЭЗ (аденилатный энергетический заряд) = (АТР+0.5 АDP)/XАН; ХКр = ФКр+Кр. Р < 0.05 от: * контроля; # Докс.
К Д Д+G G К Д Д+G G К Д Д+G G
Рис. 3. Содержание глюкозы (А), лактата (Б), аммиака ^Н4+) (В), глутаминовой кислоты (Глу) (Г), аспарагиновой кислоты (Асп) (Д) и аланина (Ала) (Е) в миокарде крыс после 8 недель исследования. К - контроль, Д - доксору-бицин, Д + С - доксорубицин + пептид С, С - пептид С. Данные представлены как М ± т (п = 6). Р < 0.05 от: # К, л Д
Содержание ФКр в сердцах животных группы Д было в 2 раза ниже. Это стало причиной уменьшения содержания общего креатина (ХКр), поскольку содержание Кр под влиянием Докс не изменялось. Введение животным пептида G совместно с Докс повышало содержание АТР и ADP, результатом чего было 1.5-кратное увеличение ХАН до значения в контроле. У животных группы Д + G содержание ФКр и ХКр в миокарде было более высоким, чем в группе Д, и не отличалось значимо от значений в контроле. Поскольку потери внутриклеточного ХКр связывают с повреждениями сарколеммы [18], более высокое содержание ХКр в группе Д + G указывало на менее существенное повреждение клеточных мембран под действием G.
Влияние пептида G на содержание метаболитов углеводного и азотистого обмена в сердце
Снижение Р-окисления жирных кислот, увеличение захвата глюкозы миокардом и компенсаторное уси-
ление анаэробного гликолиза после 8-недельного введения Докс [19] значительно повышали содержание глюкозы и лактата в сердце крыс группы Д по сравнению с контролем (рис. 3А, Б). Введение пептида G совместно с Докс снижало содержание глюкозы до значения, близкого к контролю, и одновременно уменьшало содержание лактата по сравнению с этим показателем в группе Д. При введении только пептида G уровень глюкозы в сердце не отличался статистически значимо от уровня в контрольной группе, а содержание лактата было выше, чем в контроле.
Мы изучили действие Докс и пептида G на содержание в сердце ключевых аминокислот - глута-миновой (Глу), аспарагиновой (Асп), аланина (Ала) и аммиака. Нарушение аэробного энергетического обеспечения сердца под действием Докс увеличивало скорость катаболизма Глу и образования Ала. После 8 недель содержание Глу в группе Д было статистически значимо снижено, а Ала - увеличено вслед-
ствие трансаминирования гликолитического пиру-вата по сравнению с этими показателями в контроле. В результате сопряженного трансаминирования Глу и оксалоацетата содержание Асп в группе Д увеличивалось вдвое по сравнению с контролем (рис. 3Г, Д, Е). Под действием пептида G в группе Д + G содержание Глу восстанавливалось, а Ала снижалось. Одновременно уровень Асп в группе Д + G снижался до значений в контроле.
Введение Докс крысам статистически значимо увеличивало содержание аммиака в миокарде по сравнению с контролем (рис. 3В). Под действием пептида G этот показатель снижался до значения в контрольной группе. Таким образом, улучшение энергетического состояния сердца, поврежденного Докс, обусловленное действием пептида G, предотвращало изменения в обмене Глу, Асп и Ала и снижало накопление аммиака в миокарде. Содержание этих азотистых соединений у животных, которым вводили только пептид G, было таким же, как в контрольной группе.
ОБСУЖДЕНИЕ
В нашей работе на модели КМП у крыс, вызванной хроническим введением Докс, показано защитное действие пептида G. Снижение нарушений функции сердца, уменьшение ремоделирования ЛЖ и морфологических изменений при совместном введении Докс и пептида G сопровождались значительным улучшением энергетического обеспечения кардиомиоцитов. На это указывает более высокое содержание АТР, ХАН и ФКр в сердце, которое сочеталось со снижением накопления глюкозы и лактата. Существенно, что при доксорубициновой КМП увеличивалась скорость катаболизма миокардиальной Глу, что сопровождалось образованием Ала и Асп и накоплением ци-тотоксичного аммиака. Как правило, такие изменения в обмене этих аминокислот обнаруживаются в тех случаях, когда окислительное фосфорилирование не может обеспечить необходимого образования АТР, происходит активация гликолиза и использование резервных макроэргических фосфатов. Реакции сопряженного трансаминирования Глу и Асп и образования Ала сопряжены с усилением субстратного фосфори-лирования в митохондриях на уровне сукцината, компенсирующего ингибирование окислительного фос-форилирования. При этом потеря внутриклеточного пула Глу, участвующей в поддержании уровня АТР, и продукция Ала тесно связаны с энергетическим состоянием сердца [20, 21]. Увеличение аэробного обмена под действием пептида G в сердце, поврежденном Докс, восстанавливало нормальное содержание Глу, Асп и Ала и снижало образование аммиака. Такие сдвиги во внутриклеточном обмене миокарда отра-
жают снижение отношения NADH/NAD+ в цитозоле, нормализацию функции малат-аспартатного челнока и цикла трикарбоновых кислот [22, 23]. Они хорошо согласуются с более высоким дыхательным контролем в митохондриях сердца на NAD+-зависимых субстратах (Глу и малате), обнаруженном нами ранее после совместного введения Докс и пептида G крысам [9].
Контроль содержания аммиака в сердечной мышце, характеризующейся интенсивным аэробным обменом, имеет особое значение. Это связано с его способностью 1) ингибировать реакции декарбок-силирования а-кетокислот в цикле Кребса и синтез белка; 2) сдвигать направление глутаматдеги-дрогеназной реакции в сторону образования Глу и тем самым блокировать катаболизм аминокислот; 3) нарушать активный перенос одновалентных катионов и изменять внутриклеточный рН [24, 25]. Снижение внутриклеточного уровня аммиака, обладающего токсическим действием на окислительный обмен, обусловлено улучшением метаболизма миокарда под действием пептида G. Этот эффект, скорее всего, вызван активацией связывания аммиака в АТР-зависимых реакциях образования глута-мина, аспарагина, а также снижением деградации адениннуклеотидов [26, 27]. Таким образом, пептид G корректировал ключевые звенья метаболизма миокарда при КМП - энергетический, углеводный и азотистый обмены.
В настоящее время клонированы и охарактеризованы три подтипа рецепторов галанина - GalR1, GalR2 и GalR3, которые существуют и в сердце. За связывание с рецепторами отвечает ^концевой фрагмент пептида, первые 15 аминокислотных остатков которого консервативно сохраняются у большинства видов животных и человека [28]. Влияние пептида G на метаболическое состояние поврежденного сердца обусловлено, вероятно, его связыванием преимущественно с GalR2, сопряженного с различными типами G-белков, которое активирует механизмы клеточной защиты (рис. 4). Активация всех подтипов рецепторов галанина через белки Gi/o ингибирует активность аденилатциклазы, что приводит к ин-гибированию транскрипционного фактора СREB -белка, связывающего цикло-АМР-зависимый элемент. Это повышает экспрессию транспортера глюкозы GLUT4 и его перемещение в сарколемму, стимулируя захват и окисление глюкозы кардио-миоцитами. Запуск этого механизма имеет решающее значение в условиях снижения продукции АТР [29]. Сопряжение рецептора GalR2 с белком Gq/11 активирует фосфолипазу С и через гидролиз фос-фатидилинозитолдифосфата регулирует гомеостаз Са2+, что улучшает инотропные свойства сердца [30].
Пептид G
сг
9999991
Ca'
ata l^^-J G4/ll j \ /-<SC±) ¿ RhoA y / DAG
'^АМРт) J ^Wj Й -
-í Raf icAMPI s
/ (PDK-1)
p; -y Raf
ШШ) j p
ME К
J
Рис. 4. Пути внутриклеточной сигнализации, активируемые пептидом G - фармакологическим агони-стом рецепторов галанина(Runes-son [31]). AC - аденилатциклаза; (p)BAD - (фосфорилированный) ВС12-регулятор апоптоза; CaCC -Са2+-зависимый хлоридный канал; (p)CREB - фосфорилированный сАМР-зависимый элемент; DAG -диацилглицерин; GIRK - G-белок-связанный входящий калиевый канал; IP3 - инозитолтрифосфат; MAPK - митогенактивируемая протеинкиназа; MEK - APK/ERK-киназа; PDK-1 - фосфоинозитол-зависимая протеинкиназа-1; PIP2 -фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат; PIP3 - фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат; PI3K -фосфатидилинозитол-3-киназа; PKB - протеинкиназа B (Akt); PLC - фосфолипаза C; RhoA -Ras-подобный белок
Нижние звенья этого сигнального пути вызывают фосфорилирование протеинкиназы В (Akt), ингиби-рование проапоптотических белков BAD/BAX и активностей каспазы-3 и каспазы-9 [31]. Как правило, в моделях in vivo уменьшение апоптоза кардиомио-цитов, в том числе и индуцированного Докс, сочетается с уменьшением размера необратимого повреждения миокарда и улучшением его сократительной функции [32]. Активация GalRl и GalR2 стимулирует сигнальные пути, активируемые митогенактивируе-мыми протеинкиназами (MEK1/2 и ERK1/2), приводящие к ингибированию открытия митохондриаль-ной поры временной проницаемости (mPTP). Этот механизм отвечает за выживание и подвижность клеток [33]. Кроме того, активация фосфорилирова-ния ERK способствует повышенной экспрессии рецепторов, активируемых пролифераторами перок-сисом (PPARs), контролирующих энергетический метаболизм, включая и экспрессию PPARy, стимулирующего поглощение и окисление глюкозы кар-диомиоцитами [34]. Из этого следует, что пептид G способен запускать различные механизмы, которые способствуют защитным кардиометаболическим эффектам при повреждении сердца Докс.
Окислительный стресс - один из ведущих факторов кардиотоксичности, инициируемой Докс [2, 4]. В нашей работе это подтверждено высокими уровнями продуктов ПОЛ ТБКАП как на системном, так и на органном уровне, а также повышенной активностью специфичного маркера некроза
сердца - КК-МВ - в плазме крови животных, получавших Докс. Для понимания особенностей окислительного стресса в сердце под действием Докс мы изучили его воздействие на ключевые ферменты антиоксидантной защиты - Cu,Zn-SOD, САТ и GSH-Px. Под влиянием Докс в сердце статистически значимо снизилась активность только GSH-Px, активность Cu,Zn-SOD снижалась незначительно, а CAT увеличилась по сравнению с контролем. Столь разнонаправленный ответ антиоксидантных ферментов связан с использованием низкой кумулятивной дозы Докс (8 мг/кг) в наших опытах. Докс, генерируя небольшое количество АФК, может не влиять на активность антиоксидантных ферментов или активировать ряд сигнальных путей, приводящих к индукции ферментов антиоксидантной защиты. Такие данные получены на моделях индуцируемого Докс окислительного стресса у животных различных видов [35, 36]. Важно, что введение пептида G на фоне повреждения сердца Докс существенно снижало содержание продуктов ПОЛ в сердце и плазме крови животных и одновременно улучшало интегрированность мембран кардиомиоцитов. Эти эффекты уменьшения окислительного стресса сопровождались увеличением активности Cu,Zn-SOD и GSH-Px, что указывает на усиление антиоксидантной защиты. Следует отметить, что внутриклеточная Cu,Zn-SOD контролирует не только образование АФК, но и высокореактивного пероксинитрита, и ограничивает таким образом нитрозильный стресс [37]. Наблюдаемое
увеличение активности Cu,Zn-SOD и GSH-Px могло быть связано с увеличением экспрессии генов этих ферментов под влиянием пептида G. Известно также, что некоторые пептиды обладают способностью перехватывать АФК и ингибировать ПОЛ [38]. Однако данные о прямом антиоксидантном действии галанина или пептидов, содержащих карнозиновую последовательность на С-конце молекулы, отсутствуют. Несомненно, механизмы снижения окислительного стресса с помощью пептида G заслуживают дальнейшего изучения. Мы полагаем, что основными факторами, обуславливающими фармакологическую эффективность пептида G и снижение кар-диотоксичности, вызванной длительным введением Докс, можно считать улучшение энергетического обеспечения кардиомиоцитов и усиление ферментативной антиоксидантной защиты. Схема, иллюстрирующая кардиопротектное действие этого синтетического агониста рецепторов галанина, представлена на рис. 5.
Ранее токсичность пептида G была изучена нами на мышах линии BALB/с. Введение пептида G не вызывало каких-либо признаков интоксикации и гибели животных в течение 14 дней наблюдения [39]. Существенно, что наиболее высокая из испытанных доз пептида G (520 мг/кг) многократно превышала его кумулятивную дозу, использованную в настоящей работе с Докс (4.2 мг/кг). Эти данные свидетельствуют о хорошей переносимости пептида G и перспективности проведения доклинических исследований этого препарата, обладающего широким спектром защитного действия при Докс-индуцированной КМП.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Несмотря на использование антрациклинов нового поколения со сниженной кардиотоксичностью (эпирубицина и идарубицина), Докс остается препаратом, обладающим высоким противоопухолевым эффектом, что, в свою очередь, требует снижения повреждений сердечно-сосудистой системы при его химиотерапевтическом использовании. Приведенные экспериментальные факты свидетельствуют о возможности коррекции КМП у крыс, вызванной хроническим применением Докс, с помощью пептида G - фармакологического агониста рецепторов гала-нина. Снижение кардиотоксического действия Докс при введении пептида G подтверждено уменьшением систолической дисфункции левого желудочка и уменьшением активности в крови КК-МВ - маркера повреждения сердечной мышцы. Эти эффекты прямо связаны со снижением окислительного стресса и улучшением метаболического и антиоксидантного состояния сердца. Для понимания механизмов дей-
Кардиомиоцит
Внутриклеточная сигнализация
Метаболическое состояние
Антиоксидантная защита
Улучшение функции сердца
Рис. 5. Активация рецептора галанина 6а11?2 пептидом G снижает систолическую дисфункцию миокарда при КМП, индуцированной Докс, благодаря улучшению метаболического и антиоксидантного состояния сердца
ствия пептида необходимо изучить роль активации рецепторов галанина этим лигандом и пути передачи сигнала в кардиомиоцитах. Полученные данные создают предпосылки для изучения возможности использования фармакологических лигандов рецепторов галанина в онкологии с целью снижения токсичности антрациклиновых антибиотиков. При этом они свидетельствуют о целесообразности доклинического исследования пептида G, который может быть использован в качестве потенциального противоише-мического, мембраностабилизирующего и антиоксидантного лекарственного средства. •
Авторы выражают искреннюю благодарность руководителю лаборатории синтеза пептидов ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ М.В. Сидоровой за предоставление пептида G и ценные советы при обсуждении результатов работы. Авторы признательны А.В. Просвирнину за проведение ЭхоКГ-исследования и обработку результатов.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 18-015-00008 и 18-015-00009).
Конфликт интересов. Все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. // Pharmacol. Rev. 2004. V. 56. № 2. Р. 185-229.
2. Zhang S., Liu X., Bawa-Khalfe T., Lu L.S., Lyu Y.L., Liu L.F., Yeh E.T. // Nat. Medicine. 2012. V. 18. № 11. Р. 1639-1642.
3. Tokarska-Schlattner M., Wallimann T., Schlattner U. // C. R. Biol. 2006. V. 329. № 9. Р. 657-668.
4. Octavia Y., Tocchetti C.G., Gabrielson K.L., Janssens S., Crijns H.J., Moens A.L. // J. Mol. Cell. Cardiol. 2012. V. 52. № 6. Р. 1213-1225.
5. Timotin A., Pisarenko O., Sidorova M., Studneva I., Shul-zhenko V., Palkeeva M., Serebryakova L., Molokoedov A., Veselova O., Cinato M., et al. // Oncotarget. 2017. V. 8. № 13. Р. 21241-21252.
6. Pisarenko O., Timotin A., Sidorova M., Studneva I., Shulzhen-ko V., Palkeeva M., Serebryakova L., Molokoedov A., Veselova O., Cinato M., Boal F., Tronchere H., Kunduzova O. // Oncotarget. 2017. V. 8. № 60. Р. 101659-101671.
7. Азьмуко А.А., Веселова О.М., Молокоедов А.С., Овчинников М.В., Палькеева М.Е., Писаренко О.И., Серебрякова Л.И., Сидорова М.В., Студнева И.М. Патент № 2648846. РФ. A61K 38/10 (2006.01). 2018.
8. Palkeeva M., Studneva I., Molokoedov A., Serebryakova L., Veselova O., Ovchinnikov M., Sidorova M., Pisarenko O. // Biomed. Pharmacother. 2019. V. 109. P. 1556-1562.
9. Studneva I., Palkeeva M., Veselova O., Molokoedov A., Ovchinnikov M., Sidorova M., Pisarenko O. // Cardiovascular. Toxicol. 2019. V. 19. № 2. Р. 136-146.
10. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis. New York: Acad. Press, 1974. Р. 1464-1467, 1772-1776, 1777-1781, 2127-2131.
11. Draper H.H., Hadley M. // Meth. Enzymol. 1990. V. 186. P. 421-434.
12. Beauchamp C., Fridovich I. // Anal. Biochem. 1971. V. 44. № 1. P. 276-287.
13. Beers R.F., Sizer I.W. // J. Biol. Chem. 1952. V. 195. № 1. Р. 133-140.
14. Paglia D.E., Valentine W.N. // J. Lab. Clin. Med. 1967. V. 70. № 1. P. 158-169.
15. Uchlyama M., Mihara M. // Anal. Biochem. 1978. V. 86. № 1. Р. 271-278.
16. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии. Руководство под ред. Д.Э. Коржевского. СПб.: Спец-Лит, 2013. 127 с.
17. Кактурский Л.В., Бахтин А.А. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Современные подходы в клинико-морфологической диагностике и лечении заболеваний человека», Санкт-Петербург, 9-10 октября 2015. С. 103-106.
18. Zervou S., Whittington H.J., Russell A.J., Lygate C.A. // Mini-Rev. Med. Chem. 2016. V. 16. Р. 19-28.
19. Hrelia S., Fiorentini D., Maraldi T., Angeloni C., Bordoni А., Biagi P.L., Hakim G. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1567. № 1-2. P. 150-156.
20. Sanborn Т., Gavin W., Berkowitz S., Perille Т., Leach M. // Am. J. Physiol. 1979. V. 273. № 5. P. H535-H541.
21. Weisner R.J., Deussen A., Borst M., Schrader J., Grieshaber M.K. // J. Mol. Cell. Cardiol. 1989. V. 21. № 1. Р. 49-59.
22. Safer В., Williamson J.R. // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. № 7. P. 2570-2579.
23. LaNoue K.F., Walajtys E.I., Williamson J.R. // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. № 20. Р. 7171-7183.
24. McKhann G.M., Tower D.B. // Am. J. Physiol. 1961. V. 200. P. 420-424.
25. Katunuma N., Okada M., Nishi Y. // Adv. Enz. Regul. 1966. V. 4. P. 317-336.
26. Watanabe T., Hamazaki N., Aoyama S. // Israel Med. Sci. 1969. V. 5. P. 496-500.
27. Katunuma N., Jkada M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. V. 19. P. 109-113.
28. Webling K.E.B., Runesson J., Bartfai T., Langel Ü. // Front. Endocrinol. 2012. V. 3. Article 146.
29. Tian R., Abel E.D. // Circulation. 2001. V. 103. № 24. P. 29612966.
30. Lang R., Gundlach A.L., Holmes F.E., Hobson S.A., Wynick D., Hökfelt T., Kofler B. // Pharmacol. Rev. 2015. V. 67. № 1. P. 118-175.
31. Runesson J. Galanin receptor ligands. Stockholm University, 2009. 36 р.
32. Krijnen P.A., Nijmeijer R., Meijer C.J., Visser C.A., Hack C.E., Niessen H.W. // J. Clin. Pathol. 2002. V. 55. № 11. P. 801-811.
33. Hausenloy D.J., Duchen M.R., Yellon D.M. // Cardiovasc. Res. 2003. V. 60. Р. 617-625.
34. Jay M.A., Ren J. // Curr. Diab. Rev. 2007. V. 3. № 1. P. 33-39.
35. Aniss H.A., Said A.A., Sayed I.H., AdLy C. // Egypt. J. Hosp. Med. 2012. V. 48. Р. 383-393.
36. Li T., Singal P.K. // Circulation. 2000. V. 102. № 17. Р. 21052110.
37. Ferdinandy P., Schulz R. // Br. J. Pharmacol. 2003. V. 138. № 4. P. 532-543.
38. Power O., Jakeman P., FitzGerald R.J. // Amino Acids. 2013. V. 44. № 3. P. 797-820.
39. Серебрякова Л.И., Палькеева М.Е., Студнева И.М., Овчинников М.В., Веселова О.М., Молокоедов А.С., Азьмуко А.А., Арзамасцев Е.В., Афанасьева Е.Ю., Терехова О.А. и др. // Биомед. химия. 2019. Т. 65. № 3. С. 231-238.
