CC BY
157
Актуальность задачи исследования клеточных и молекулярных механизмов экзогенных интоксикаций обусловлена необходимостью поиска новых эффективных методов диагностики и патогенетической коррекции заболеваний химической этиологии. В основе цитотоксического действия ряда ксенобиотиков лежит их способность индуцировать окислительный стресс, приводящий к нарушению клеточного энергетического и ионного гомеостаза, в том числе за счет повреждения митохондрий, изменения активности кальциевых и калиевых ионных каналов, стимуляции высвобождения кальция из внутриклеточных депо [6,16]. Альтерация клеточных структур при этом может приобретать необратимый характер и индуцировать элиминацию клеток механизмами некроза и апоитоза. Известно, что одним из ключевых событий при апоптозе является эксгернализация фосфатидилсерина [9].
Поддержание асимметрии липидов клеточной мембраны является одним из непременных условий жизнедеятельности клеток. Преимущественная локализация различных классов фосфолипидов на внутренней или внешней сторонах цитоплазматической мембраны, определяемая специфическими ферментами, важна для поддержания конформации и функциональной активности интегральных мембранных белков, межклеточного взаимодействия, адгезии клеток и их миграции [15,18].
Предполагают, что изменение мембранной локализации фосфатидилсерина, ассоциированное с потерей ассиметрии клеточных мембран, может быть патогенетически связано с нарушением активности ферментов, регулирующих обмен фосфолипидов в мембране, изменением мембран-цитоскелетных взаимоотношений, окислением мембранных белков, а также, что наименее изучено, с повреждением механизмов регуляции гомеостаза кальция в клетке [1]. В динамике апоптоза фосфатидилсерин с внутренней стороны липидного бислоя перемещается на наружную, что приводит к распознаванию апоптотических клеток фагоцитами [3,4].
Предполагают, что одним из механизмов экстернализации фосфатидилсерина является окисление этого фосфолипида и/или нарушение поступления кальция в клетку [8,10]. Внимание исследователей в последние годы привлечено к механизмам регуляции связи между степенью наполнения кальциевых депо в клетках и активностью кальциевых (потенциал-зависимых и емкостных) каналов плазматической мембраны. Так, согласно существующим представлениям, вызванное действием ксенобиотиков опустошение внутриклеточных кальциевых депо стимулирует активность депорегулируемых (емкостных) кальциевых каналов, что приводит к поступлению кальция в клетки [14]. Само по себе истощение кальциевых депо является мощным стимулом к развитию апоптоза, вне зависимости от входа кальция в клетку. С другой стороны, перегрузка эндоплазматического ретикулума кальцием приводит к развитию так называемого эндоплазматического стресса, активирующего фактор транскрипции NF-кВ, костимулирующим эффектом в отношении которого обладают и реактивные формы кислорода [13].
Лимфоциты экспрессируют широкий спектр ионных каналов, участвующих в рефляции их функциональной активности, процессах пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели [2,7]. Экспрессия этих каналов зависит от стадии развития иммунокомпетентных клеток, что делает лимфоциты (и тимоциты в частности) хорошей моделью для изучения ионного гомеостаза электроневозбудимых клеток.
Целью работы явилось изучение кальций-зависимых механизмов экстернализации фосфатидилсерина при апоптозе тимоцитов, индуцированном действием прооксиданта - акрилонитрила.
Методика исследования
Исследования выполнены на белых беспородных мышах-самцах массой 16-18 г. Выделение тимоцитов и краткосрочное культивирование этих клеток осуществляли по стандартной методике в бессывороточной среде 199 в концентрации 10 млн. клеток на 1 мл среды. Жизнеспособность тимоцитов оценивалась по исключению клетками 0,1% раствора витального красителя трипанового синего.
Анализ экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны проводился методом регистрации связывания FITC-меченого аннекси-на V, проницаемость мембраны оценивали с помощью пропидия йодида (Annexin V Apoptosis Detection Kit, Caltag Laboratories, США). Методом флуоресцентной микроскопии определяли относительное количество клеток четырех субпопуляций: 1) жизнеспособные; 2) находящиеся на ранней стадии апоптоза; 3) находящиеся в состоянии вторичного некроза; 4) собственно некротические клетки
Исследование влияния ксенобиотика-индуктора окислительного стресса акрилонитрила (AN) на тимоциты in vitro проводилось при совместной инкубации суспензии клеток с AN в концентрации 5 мМ в течение 1 ч при +37 °С. Прединкубация клеток с блокаторами потенциал-управляемых каналов изоптином в концентрации 10 мкМ и депо-управляемых каналов SKF 963645 (Sigma, США) в концентрации 10 мкМ проводилась в течение 10 минут С последующим добавлением в среду AN и совместным инкубированием клеток в течение 1 ч.
Статистическая обработка результатов осуществлена с помощью t-критерия Стыодента.
Результаты исследования
В краткосрочной культуре тимоцитов около 3% клеток имели признаки экстернализации фосфатидилсерина (аннексии V клетки). При этом 90% клеток демонстрировали жизнеспособность в течение всего периода инкубации (табл. 1).
При инкубации тимоцитов с акрилонитрилом (AN) в течение 1 часа происходило значительное увеличение аннексии V* клеток и клеток в состоянии некроза, регистрируемого по повышению проницаемости клеточной мембраны для пропидия иодида (табл. 1, рис. 1А на цветной вкладке).
Цитотоксическое действие акрилонитрила in vitro модулировалось агентами, регулирующими функционирование внутриклеточных кальциевых депо: подавлялось нитропруссидом натрия, кофеином, рутениевым красным, потенцировалось прокаином, ЭДТА (рис. 2), что позволяет сделать вывод об акрилонитрил-индуцируемом высвобождении кальция из эндоплазматического ретикулума.
Предварительная инкубация тимоцитов с изоптином, известным в качестве блокатора потенциал-управлясмых
ионных каналов, снижала апоптогенную и некрозогенную активность акрилонитрила (табл. 1). Однако при этом отмечалось увеличение количества клеток в состоянии вторичного некроза (рис. 1Б на цветной вкладке). При этом изолированное применение изоптина Не влияло на жизнеспособность тимоцитов.
Обнаруженный эффект изоптина может быть интерпретирован как проявление им способности тормозить генерацию свободных радикалов при действии ксенобиотика, коль скоро известно, что изоптин может проявлять антиоксидантную активность. С другой стороны, изоптин блокирует потенциал-управляемые кальциевые каналы в разных типах клеток. Вместе с тем лимфоциты не экспрессируют этот тип каналов, но проявляют чувствительность к действию их блокаторов за счет ингибирования ими активности калиевых потенциал-уп-равляемых Kv каналов. Эти каналы максимально экс-прессированы в незрелых Т-клстках, физически ассоциированы с белками цитоскелета, ответственны за поддержание потенциала клеточной мембраны тимоцитов, необходимого для активности депо-управляемых кальциевых каналов CRAC (calcium release activated channels), присутствующих в лимфоцитах и участвующих в процессе активации этих клеток [2].
Для идентификации роли депо-контролируемого входа кальция в клетку в развитии апоптоза и некроза тимоцитов мы использовали блокатор депо-управляемых кальциевых каналов плазматической мембраны SKF96365. В дозе 10 мкМ он увеличивал количество аннексии V* клеток в популяции тимоцитов (рис. 3).
На фоне действия SKF96365 достоверно увеличивались акрилонитрил-индуцируемые процессы экстерна-лизации фосфатидилсерина, при этом некроз-индуци-рующая активность ксенобиотика не изменялась (рис. 1В на цветной вкладке; 3).
Известно, что физиологический уровень цитоплазматического кальция необходим для сбалансированной работы флоппазы и аминофосфолипидтранслоказы, участвующих в поддержании асимметрии фосфолипидов в мембране [15,18]. При диерегуляции кальциевого гомеостаза в клетках, в том числе за счет депо-управляемого входа кальция, происходит нарушение этого баланса и активация скрамблазы, в результате чего фосфатидилсерин переходит на наружную сторону мембраны [17].
Активность калиевых каналов оказывает опосредованное действие на механизм емкостного входа кальция в лимфоциты за счет гиперполяризации мембраны и поддержания кальциевого тока через CRAC каналы [2]. Коль скоро изоптин увеличивает количество клеток, подвергающихся вторичному некрозу при действии акрилонитрила, вероятным представляется то, что изоптин не подавляет индукцию апоптоза, а лишь препятствует завершению программы апоптоза в поврежденных клетках. Блокатор CRAC, напротив, потенцирует апоптогенное действие акрилонитрила, не влияя на процессы некроза или вторичного некроза. На основании наших данных, массивное высвобождение кальция из эндо-плазматического ретикулума при действии акрилонитрила весьма вероятно, следовательно, опосредованное через калиевые каналы действие изоптина вызывает лишь частичное сокращение депо-управляемого поступления кальция в клетки через CRAC (в ответ на опустошение депо), тогда как прямое ингибирование активности этих каналов SKF96365 -полное прекращение входа кальция. Вследствие этого изоптин блокирует апоптоз, тогда как SKF96365 потенцирует эти процессы.
Действительно, существуют экспериментальные доказательства того, что частичное уменьшение уровня кальция во внутриклеточных депо и снижение активности емкостного кальциевого тока защищает клетки от апоптоза [14], тогда как полное торможение входа кальция в клетку через CRAC способствует прогрессии апоптоза [10].
Развитие вторичного некроза (процесса, связанного с невозможностью клетки сформировать апоптотические тельца) в тимоцитах, по нашему предположению, может быть связано с частичным торможением активности депо-управляемых кальциевых каналов, которое нарушает реализацию программы апоптоза и способствует развитию вторичного некроза.
Следовательно, существующие представления о том, что блокирование механизмов повышения внутриклеточной концентрации кальция и продукции свободных радикалов снижает токсичность ксенобиотиков [5, 12, 16], нуждаются в коррекции, коль скоро в некоторых случаях адекватное восполнение внутриклеточных кальциевых депо за счет входа кальция в клетку способно оказать выраженный протсктивный эффект.
Таким образом, возникающие при действии мембранотоксического ксенобиотика - акрилонитрила апоптоз-ассоциированная экстернализация фосфатидилсе-рина и некроз тимоцитов патогенетически связаны с активностью депо-управляемых кальциевых каналов.
%
40 ,
I 2 3 4 5 6 7
□ апоптоз U некрозМ нторичныи некроз
1
1 I ьЛ«=1
' и», п И Шт
SKF 96365 SKF 96365+AN
Рис. 2. Жизнеспособность тичоцитов при их культивировании in vitro в условиях воздействия: 1)контролъ; 2)акршонитрил 5мМ; 5) нитропруссид натрия 1 мМ + акрилонитрил,5 мМ; 4) кофеин 10 мМ + акрилонитрил, 5 мМ; 5) рутениевый красный 10-5 М + акрилонитрил, 5 мМ; 6) прокаии 1 мМ + акрилонитрил, 5 мМ; 7) ЭДТА 0,5 мМ+акрилонитрил, 5 мМ.
Рис. 3. Модификация цитотоксического эффекта акрилонит-рила, вызванная блокадой депо-упратяемого входа кальция в клетки in vitro.
Таблица1. Индукция акрилонитрилом (AN) процессов апоптоза и некроза в культуре тимоцитов (% от общего количества клеток)
Серия Живые Апоптоз Вторичный некроз Некроз
Контроль, N=10 89,82+0,75 3,23+0,53 1,97+0,4 4,98+0,36
AN,5mM,N = 10 74,13+1,55"* 9,34+1,03'" 2,54+0,51 14,0+0,78""
Изоптин 10 '5 М +AN, 5 мМ, N = 8 81,29+1,44" 4,57±0,65с 5,57+0,59ь 8,79+1,Пс
Примечания.Здесь и далее:р -уровеньзначимости;' -р < 0,05," -р < 0,02'" -р < 0,01,"" -р < 0,001 по сравнению с контролем;" -р < 0,05, '-р< 0,02,' -р<0,01," -р< 0,001 по сравнению с изолированным действием акрилонитрила
