CC BY
122
УДК 616-092.18
ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ И РЕОКСИГЕНАЦИИ НА МЕХАНИЧЕСКОЕ НАПРЯЖЕНИЕ ГЛАДКИХ МЫШЦ СОСУДОВ ПРИ АКТИВАЦИИ ai-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ
Бирулина Ю.Г., Гусакова С.В., Рязанцева Н.В., Ковалев И.В., Смаглий Л.В., Алейник А.Н.1
^бирский государственный медицинский университет,
г. Томск
Национальный исследовательский Томский политехнический университет, г. Томск E-mail: birulina20@yandex.ru
Проявления гипоксии ткани, а также последующей реоксигена-ции сопровождаются целым комплексом метаболических нарушений, которые приводят, в том числе, к повреждению гладко-мышечных клеток сосудов и нарушению их сократительной функции. Гладкомышечные клетки играют важную роль в регуляции просвета кровеносных сосудов, а следовательно, системного артериального давления и локального снабжения тканей кислородом. Предполагается, что при гипоксии и реоксигенации сосудистых гладких мышц происходит их расслабление и снижение силы сокращений. Механографическим методом было изучено влияние гипоксии и реоксигенации на сократительную активность изолированных гладких мышц аорты крысы на фоне действия а1-адреномиметика фенилэфрина. Проведенные нами исследования показали, что при активации а1-адренергических рецепторов в условиях гипоксии и реоксигенации наблюдается снижение сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы, причем в большей степени при реоксигенации. Блокирование калиевых каналов плазмалеммы тетраэтиламмони-ем позволило установить, что угнетающие эффекты гипоксии и реоксигенации на сократительную активность гладкомышечных клеток обусловлены повышением калиевой проводимости мембраны клеток.
Ключевые слова:
Гладкомышечные клетки сосудов, сократительная активность, гипоксия, реоксигенация, фенилэфрин.
Введение
Гипоксия традиционно рассматривается как типовой патологический процесс, возникающий в результате снижения содержания кислорода в тканях и/или нарушения его утилизации в процессе биологического окисления [13]. Известно, что метаболические и функциональные нарушения, возникающие при недостатке кислорода, прежде всего, связаны с дефицитом макроэргических соединений, образуемых в сопряженных с окислительно-восстановительными процессами реакциях фосфо-рилирования на внутренней мембране митохондрий [1]. В условиях гипоксии происходит снижение электрического потенциала внутренней мембраны митохондрий, что влечет за собой
Бирулина Юлия Георгиевна,
аспирант каф. патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ, г. Томск. E-mail: birulina20@yandex.ru Область научных интересов: молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в гладкомышечных клетках, газотрансмиттеры, гипоксия. Гусакова Светлана Валерьевна, зав. каф. биофизики и функциональной диагностики, д-р мед. наук ГБОУ ВПО СибГМУ, г. Томск. E-mail: gusacova@yandex.ru Область научных интересов: молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации, объем-зависимые процессы в сосудистых гладких мышцах, газотрансмиттеры.
Рязанцева Наталья Владимировна, зав. каф. молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики, д-р мед. наук, профессор ГБОУ ВПО СибГМУ, г. Томск. E-mail: nv_ryazan@mail.ru Область научных интересов: идентификация молекулярных мишеней и маркеров для разработки технологий персонализированного сопровождения социально значимых заболеваний; селективное управление апоптозом, пролиферацией и дифференцировкой нормальных и патологически измененных клеток.
Ковалев Игорь Викторович,
д-р мед. наук, профессор каф. биофизики и функциональной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ, г. Томск.
E-mail: kovalew@mail.ru Область научных интересов: физиология висцеральных систем, механизмы межклеточной и внутриклеточной сигнализации в гладких мышцах, регуляция вторичными посредниками электрической и сократительной активности гладких мышц желудочно-кишечного тракта.
уменьшение, а затем и потерю митохондриями способности аккумулировать внутриклеточный кальций [3].
В последние годы были получены убедительные данные о том, что гипоксия и последующая реоксигенация приводят к повреждению не только клеток паренхиматозных органов, но и клеток сосудов: эндотелиоцитов и глад-комышечных клеток (ГМК). Действие гипоксического фактора ведет к нарушению сократительной функции гладких мышц [4, 5]. Влияние гипоксии по степени и продолжительности неодинаково нарушает сократительные свойства ГМК. Как известно, их сокращение развивается при поддерживаемой деполяризации мембраны, открывании медленно инактивирующихся Са2+-каналов и обеспечивается оперированием С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы [6, 7].
Существующие на сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что гипоксия и реоксигенация сосудистых мышц приводят к их расслаблению и снижают силу как спонтанных, так и вызванных деполяризацией мембраны ГМК или действием физиологически активных веществ сокращений. Но по-прежнему продолжается дискуссия в отношении наиболее вероятных клеточных механизмов гипоксической вазодилатации [4, 5]. Известно, что сосудистый эндотелий может способствовать гипоксическому расслаблению и снижению силы сокращений за счет освобождения релаксирующих факторов [4, 8]. В противоположность этому имеется много свидетельств в пользу сосудистых гладких мышц как сенсора низкого напряжения кислорода независимо от метаболических факторов, освобождаемых эндотелием или окружающими тканями [3]. В понимании процессов гипоксической вазодилатации превалирует парадигма активация калиевой проводимости мембраны гладкомышечных клеток, в частности плазмолеммальных АТФ-чувствительных калиевых каналов (КАТФ) на фоне снижения уровня внутриклеточного АТФ [3, 4]. Калиевые токи через открытые калиевые каналы и последующая гиперполяризация мембраны ведут к закрыванию потенциал-зависимых кальциевых каналов и подавлению входа кальция, а значит, и к расслаблению гладких мышц. Согласно вышесказанному необходимо установить механизмы эндотелий-зависимого и независимого гипоксического расширения/расслабления сосудов и снижения сократительных реакций ГМК на действие возбуждающих факторов; исследовать индуцированное гипоксией и реоксигенацией изменение ионной проводимости сосудистых гладких мышц.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовались деэндотелизированные гладкомышечные сегменты грудного отдела аорты самцов крыс линии Wistar.
Для исследования сократительной активности сосудистые гладкомышечные сегменты фиксировали с помощью стальных крючков в аэрируемых камерах объемом 10 мл четырехканальной механографической установки Myobath II, заполненных сбалансированным солевым раствором Кребса и термостатируемых при температуре 37 °C, рН=7,4. Механическое напряжение сосудистых сегментов изучалось с помощью аппаратно-программного обеспечения LAB-TRAX-4/16 (Германия). После 40-50-минутной инкубации сегментов в растворе Кребса дважды вызывали гиперкалиевое сокращение (эквимолярное замещение 30 мМ NaCl на KCl). Далее, в зависимости от целей эксперимента, использовали физиологический раствор с добавлением тестируемых соединений. Гипоксический раствор Кребса создавали путем
Смаглий Людмила Вячеславовна, канд. мед. наук, ассистент кафедры биофизики и функциональной диагностики ГБОУ ВПО Сиб-ГМУ, г. Томск.
E-mail: lud.smagly@yandex.ru Область научных интересов: механизмы внутриклеточной и межклеточной сигнализации в сосудистых гладких мышцах, газовые посредники, сероводород, натрий-зависимые ион-транспортирующие системы. Алейник Александр Никоно-рович, канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. каф. прикладной физики Физико-технического института НИ ТПУ, г. Томск. E-mail: aleinik@tpu.ru Область научных интересов: спектроскопия, медицинская физика, ядерная электроника.
пропускания через него газообразного азота (чистота 99,99 %) в течение 15 минут. Реоксигенация достигалась сменой гипоксического раствора на физиологический с нормальным содержанием кислорода. Уровень кислорода в растворе оценивали с помощью портативного оксиметра HI 9145 (HANNA). Объемная доля кислорода в гипоксическом растворе Кребса не превышала 5,0±0,2 %.
Все растворы готовили на основе дистиллированной воды путем добавления соответствующих реактивов. Физиологический раствор Кребса содержал ^M): 120,4 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 5,5 глюкозы, 15 NH2C(CH2OH)3 [tris(hydroxymethyl)-aminomethane] (pH 7,4). Тестирующие растворы готовились путем добавления в физиологический раствор Кребса или его модификаций следующих реактивов: фенилэфрина (ФЭ), тетраэтиламмония хлорида (ТЭА) (все Sigma).
В качестве контрольных (100 %) служили значения амплитуды сократительных ответов на действие фенилэфрина. Анализ данных проводили при помощи программы SPSS 17.0 for Windows. Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (M±m). Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney test). Различия считали статистически значимыми при значении р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В серии предварительных экспериментов нами было показано, что инкубация гладкомышечных сегментов в гипоксическом растворе Кребса в течение 60 минут не влияет на их исходный базальный тонус.
Обязательным условием для индукции сокращения в ГМК является использование внеклеточных ионов кальция. Повышение их концентрации внутри клетки можно воспроизводить с помощью физиологически активных веществ, например агонистов ai-адренергических рецепторов. Связываясь со своим рецептором на плазматической мембране гладких мышц, данные соединения обеспечивают рецептор-управляемый вход Са2+ в клетку, активируют С-киназную ветвь кальциевой сигнальной системы и способствуют высвобождению Са2+ из депо.
Исследование влияния гипоксии и реоксигенации на сократительную активность сосудистых ГМК производили на фоне добавления в исследуемый раствор а1-адреномиметика ФЭ. Амплитуда сокращений сосудистых ГМК в ответ на добавление 1 мкМ ФЭ в нормоксический раствор Кребса была сравнима с ответной реакцией на действие гиперкалиевого раствора. Однако в условиях гипоксии происходило статистически значимое уменьшение амплитуды сокращения ГМК, вызванного действием 1 мкМ ФЭ (рис. 1). Так механическое напряжение составило 73,4 ±2,5 % (n=8, р<0,05) от контрольного ФЭ-индуцированного сокращения в условиях нормоксии.
17,5
О 0,5 1.0 1,5 2,0 2,5
Время, часы
Рис. 1. Действие гипоксии на механическое напряжение гладкой мышцы аорты крысы, предсо-кращенной фенилэфрином (1 мкМ). По оси ординат - механическое напряжение (мН); по оси абсцисс - время (ч). Стрелками показано добавление и удаление соответствующих растворов
Для исследования влияния реоксигенации гладкомышечные сегменты после 60-минутной инкубации в гипоксическом растворе Кребса помещали в раствор с нормальным напряжением кислорода и спустя 15 минут регистрировали их сократительную активность. Ранее было установлено, что реоксигенация не влияла на базальный тонус сегментов. В условиях реоксигенации амплитуда сокращения, вызванного ФЭ, статистически значимо снижалась (рис. 2), составив 65,8 ±3,1 % (п=8, р<0,05), соответственно, от контрольного значения. Установлено, что на фоне реоксигенации сократительный эффект ФЭ угнетается сильнее, чем при гипоксии (р<0,05).
17,5
О 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Время, часы
Рис. 2. Влияние реоксигенации на амплитуду сократительного ответа гладкомышечного сегмента при действии 1 мкМ фенилэфрина. По оси ординат - механическое напряжение (мН); по оси абсцисс - время (ч). Стрелками показано добавление и удаление соответствующих растворов
Таким образом, в условиях гипоксии и реоксигенации механическое напряжение сосудистых ГМК, предсокращенных раствором ФЭ, достоверно снижалось относительно контрольных сокращений в условиях нормоксии. Полученные результаты могут быть обусловлены угнетением оперирования С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы, которая обеспечивает поддерживаемый ответ клеток при активации адренергических рецепторов или же индуцированы изменением ионной проводимости мембраны.
В наибольшей степени в этих процессах, предположительно, задействована калиевая проводимость мембраны. Добавление 10 мМ неселективного блокатора калиевых каналов ТЭА на фоне ФЭ-индуцированного сокращения вызывало статистически значимое увеличение амплитуды сокращений ГМК до 115,1 ±1,5 % (п=8, р<0,05) по сравнению с контрольным ФЭ-индуцированным сокращением. В условиях действия гипоксии и реоксигенации при добавлении ТЭА наблюдалось увеличение механического напряжения ГМК до 125,3 ±3,4 % и 116,4 ±4,5 % (п=8, р<0,05) по сравнению с контрольными значения при гипоксии и реоксигенации, соответственно (рис. 2). В результате было установлено, что только в гипоксических условиях по сравнению с нормоксией значимо усиливается констрикторное действие ТЭА на сокращение, индуцированное ФЭ (р<0,05). Полученные данные позволяют предположить, что в реализации эффектов гипоксии и реоксигенации на сократительную активность ГМК могут быть задействованы калиевые каналы плазмалеммы. Так, на фоне гипоксии или реоксигенации происходит повышение выходящих калиевых токов, что, в свою очередь, приводит к гиперполяризации мембраны ГМК и их расслаблению.
Заключение
Таким образом, полученные нами результаты позволяют утверждать, что гипоксия и реоксигенация оказывают угнетающее действие на сократительные свойства гладких мышц сосудов при активации а1-адренергических рецепторов. Данный эффект реализуется, прежде
всего, за счет повышения калиевой проводимости мембраны гладкомышечных клеток. Согласно литературным источникам одним из наиболее вероятных механизмов действия гипоксии и последующей реоксигенации на сократительную функцию сосудистых гладких мышц является активация АТФ-чувствительных калиевых каналов плазмалеммы.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (ГК№ 14.740.11.0932, соглашение № 8487).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Чеснокова Н.П. Современные представления о патогенезе гипоксий. Классификация гипоксий и пусковые механизмы их развития // Современные наукоемкие технологии. -2006. - № 5. - С. 23-27.
2. Semenza G.L. Oxygen homeostasis // WIREs Systems Biology and Medicine. - 2009. - V. 2. -P.336-361.
3. Walshe T.E. The Role of Hypoxia in Vascular Injury and Repair // Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis.
- 2008. - V. 3. - P. 615-643.
4. Benoit J.N. Vascular reactivity following ischemia/reperfusion // Frontiers in Bioscience. - 1997.
- V. 2. - P.28-33.
5. Otter D. Mechanisms of hypoxic vasodilatation of isolated rat mesenteric arteries: a comparison with metabolic inhibition // Journal of Physiology. - 1999. - V. 516. - № 1. - P. 249-259.
6. Миогенные эффекты циклического гуанозинмонофосфата в гладкомышечных клетках. Роль протеинкиназы С / И.В. Ковалев, М.Б. Баскаков, М.А. Медведев и др. // Рос. Физиол. ж. им. Сеченова. - 2003. - Т. 89. - № 4. - С. 436-446.
7. Throckmorton D.C. Protein kinase C activation during Ca2+-independent vascular smooth muscle contraction // J. Surg Res. - 1998. - V. 78 (1). - P. 48-53.
8. Li Ch. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2002. - № 282. - Р. 227-241.
Поступила 22.01.2015 г.
