CC BY
13© Коллектив авторов, 2013 УДК 618.19-006.6-092.4
МЕХАНИЗМ УСТОЙЧИВОСТИ К ГИПОКСИИ КЛЕТОК ЭСТРОГЕННЕЗАВИСИМОГО РАКА
МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: РОЛЬ БЕЛКОВ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ПЕРЕХОДА SNAIL1 И ß-КАТЕНИНА
Л.Б. Стефанова, А.М. Щербаков, кандидат биологических наук, Д.В. Сорокин, В.А. Шатская, кандидат биологических наук, М.А. Красильников, доктор биологических наук, профессор
ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
E-mail: alex.scherbakov@gmail.com
Основная задача работы — исследование механизма повышенной толерантности к гипоксии клеток резистентного рака молочной железы (РМЖ). Исследования проводились на культивируемых in vitro клетках РМЖ: эстрогензависимой линии MCF-7 и резистентной рецепторнегативной линии HBL-100. Показано, что одним из факторов, поддерживающих выживаемость клеток эстрогеннезависимого РМЖ в условиях гипоксии, является высокий уровень Snaill — ключевого белка эпителиально-мезенхимального перехода. Протективный эффект Snaill реализуется с участием ß-катенина — транскрипционного кофактора, регулирующего экспрессию гипоксиязависимых генов. Продемонстрировано, что активация Snaill может быть обусловлена (как минимум, частично) снижением активности рецептора эстрогенов, связанного со Snaill системой негативной регуляции. Полученные данные показывают, что направленное подавление Snaill-сигнального пути способствует частичному увеличению чувствительности клеток к гипоксии, что свидетельствует о перспективности использования Snaill и его эффекторов в качестве мишеней таргетной терапии для лечения резистентного РМЖ.
Ключевые слова: эпителиально-мезенхимальный переход, рак молочной железы, Snaill, ß-катенин, рецепторы эстрогенов, гипоксия
THE MECHANISM OF TOLERANCE OF THE ESTROGEN-INDEPENDENT BREAST CANCER CELLS TO HYPOXIA: THE ROLE OF SNAIL1 AND BETA-CATENIN, THE EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION PROTEINS L.B. Stefanova, A.M. Scherbakov, D.V. Sorokin, V.A. Shatskaya, M.A. Krasilnikov
Federal State Budgetary Institution «The N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» of the Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation
The main goal of the project was to study the heightened tolerance of the resistant breast cancer cells to hypoxia. Two in vitro cultured breast cancer cell lines, the estrogen-dependent MCF-7 cells and the resistant ER-negative HBL-l00 cells were used in the study. We have demonstrated that the high expression of Snaill (the key protein of epithelial-mesenchymal transition) is one of the factors supporting the ER-negative breast cancer cell survival under hypoxic conditions. Snaill produces a synergistic protective effect with beta-catenin, the transcription cofactor regulating the expression of hypoxia-dependentgenes. We have established that the downregulation of estrogen receptor activity results in Snaill activation. The target inhibition of Snaill signaling pathway was demonstrated to be conducive to the increased cell sensibility to hypoxia. Thus Snaill and its effectors may serve as perspective targets in the treatment of resistant breast cancer.
Key words: epithelial-mesenchymal transition, breast cancer, Snaill, beta-catenin, ERa, estrogens, hypoxia
Внимание исследователей давно привлекают причины высокой устойчивости злокачественных опухолей к гипоксии и способности опухолевых клеток быстро адаптироваться к условиям гипоксии in vivo и in vitro. Во многом подобная толерантность к гипоксии связана с особенностями внутриклеточного метаболизма опухоли, включая как усиление гликолиза и стимуляцию соответствующих ферментов анаэробного каскада, так и акти-
вацию ряда митогенных и антиапоптотических сигнальных путей, поддерживающих рост клеток в условиях гипоксии. В целом опухоли, развивающиеся в условиях гипоксии, характеризуются более высокой степенью злокачественности и выраженной способностью к автономному, нерегулируемому росту [2, 5, 21].
С этой точки зрения безусловный интерес представляет исследование путей и особенностей адап-
Молекулярная медицина
29
тации к гипоксии эстрогензависимых и резистентных опухолей молочной железы. Известно, что развитие эстрогеннезависимого фенотипа опухолей связано с активацией ключевых белков митогенно-го и антиапоптотического ряда, функционирующих независимо от гормона и способных поддерживать автономный рост клеток [1, 11]. Эстрогеннезави-симые опухоли молочной железы характеризуются более агрессивным ростом, тенденцией к дедиффе-ренцировке, повышенной способностью к инвазии и метастазированию [17, 18], а также относительно более высокой устойчивостью к гипоксии [3, 6]. Каков механизм адаптации эстрогензависимых и резистентных опухолей к гипоксии, действительно ли рецепторный статус и уровень гормональной зависимости могут играть определенную роль в регуляции гипоксического ответа опухолей молочной железы? Определенного ответа на эти вопросы пока нет.
Нами исследована взаимосвязь между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии клеток РМЖ. На модели культивируемых in vitro клеток эстрогензависимого и резистентного РМЖ мы показали, что повышенная устойчивость к гипоксии клеток резистентного РМЖ ассоциирована с активацией транскрипционного белка-супрессора Snail 1, одного из ключевых белков эпителиально -мезенхимального перехода, и продемонстрировали участие Snail1 и его эффекторов в поддержании роста клеток в условиях гипоксии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клетки РМЖ человека линий MCF-7 и HBL-100 культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 5% эмбриональную сыворотку телят (HyClone, США) и гентамицин (50 ед/мл) («Paneco», Россия) при 37° и 5% СО2. Линии клеток MCF-7 и HBL-100 получены из коллекции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). При определении скорости роста клеток был использован МТТ-тест, основанный на утилизации живыми клетками МТТ-реагента (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенилтетразол бромида) [14]. Для моделирования условий гипоксии клетки культивировали в двухгазовом СО2-инкубаторе «Binder» с поддержанием концентрации О2 в пределах 1%. Ингибитор р-катенина ICG-001 [4] (предоставлен В. Татарским) использовали в конечной концентрации 5 мкМ.
В трансфекционных экспериментах использовались плазмида, содержавшая дикий ген ERa (предоставлена Dr. Craig Jordan, Georgetown University Medical Center), плазмида ERE/luc, содержавшая ген-репортер люциферазы под контролем ER-респонсивного элемента (предоставлена Dr. G. Reid) [13], плазмида E-cad/luc, содержавшая ген-репортер люциферазы под контролем Snail1 —
чувствительного промотора (предоставлена Dr. Antonio García de Herreros) [19] и плазмида HRE/luc, содержавшая ген люциферазы под контролем гипоксияреспонсивного элемента (HRE) (предоставлена Dr. Giovanni Melillo) [12]. Репор-терная конструкция, содержащая ген люциферазы под контролем ß-катенинчувствительного промотора, предоставлена В. Татарским.
Для контроля эффективности и потенциальной токсичности процедуры трансфекции применялась котрансфекция клеток плазмидой, содержавшей ген ß-галактозидазы. Активность люциферазы рассчитывали в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах).
Для трансфекции коротких интерферирующих РНК использовали олигонуклеоти-ды последовательностей: scrambled siRNA (sense 5'-CAGUCGCGUUUGCGACUGGdTdT-3'), Snaill siRNA(sense 5'-AGGCCUUCAACUGCAAAUAdTdT-3'), а также соответствующие антисмысловые олигону-клеотиды («Синтол», Россия). Трансфекцию клеток полученными олигонуклеотидами проводили в течение 4 ч с использованием Metafectene (Biontex Laboratories GmbH) при 37°. Конечная концентрация siRNA составляла 50 нмоль.
Для проведения иммуноблоттинга клетки на стадии формирования 80% монослоя снимали с чашек в 1 мл фосфатного буфера. Далее из полученных образцов выделяли клеточные экстракты для последующего электрофореза и иммуноблоттинга, как описано ранее [10]. Использовались антитела к ERa (Sigma -Aldrich Co), a-tubulin, Snaill, ß-actin, E-cadherin (Cell Signaling Technology).
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы Origin 6. Во всех случаях статистические критерии считали достоверными при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Чувствительность к гипоксии и уровень ERa в клетках MCF-7 и HBL-100. Эксперименты проводили in vitro на клетках эстрогензависимого РМЖ человека MCF-7 и эстрогеннезависимого ER-негативного РМЖ линии HBL-100. Определение уровня рецептора эстрогенов ERa в клетках MCF-7 методом иммуноблоттинга выявило выраженную гипоксиязависимую деградацию ERa (рис. 1а). Сходные результаты получены при анализе активности ERa методом репортерного анализа, продемонстрировавшим падение транскрипционной активности ERa в условиях гипоксии (рис. 1б). Анализ скорости роста клеток после перевода в условия гипоксии (1% О2) показал резкое снижение роста клеток MCF-7 при сохранении относительно устойчивой пролиферации ER-негативных клеток HBL-100 (рис. 1в).
30
№1, 2°13 Молекулярная медицина
ERa
Контроль Гипоксия MCF-7
1000
-a-Tubulin
со св
•е 2 <2 * 12 ¿3
KPi
gw
500
-i-
3000
2000
о <u w
ft я
а о
1000
К
0
MCF-7
Контроль □ Гипоксия (1%О2)
MCF-7
HBL-100
Рис. 1. Влияние гипоксии на содержание (иммуноблоттинг) ЕЯ.а (а), транскрипционную активность ЕЯ.а (б) и скорость роста клеток МСЕ-7 и ИБЬ-100 (в)
И
1500
¡¡т S
я ^
4cj
ь lu
сл1000
500
Я о и |
S W
0
Таким образом, относительная устойчивость к гипоксии клеток РМЖ (как и клеток HBL-100) может развиваться на фоне эстрогеннезависимого фенотипа и связана скорее всего с действием факторов, сохраняющих активность в отсутствие эстрогенов.
Значение Snail1 в регуляции чувствительности клеток РМЖ к гипоксии. Как известно, в регуляции выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии большое значение принадлежит антиапопто-тическим белкам, уровень активации которых может во многом определять окончательную реакцию клеток на гипоксию [16]. Ранее мы показали, что активность транскрипционного супрессора Snail1 в ER-негативных клетках HBL-100 значительно выше, чем в клетках MCF-7 [15]. Целью данного исследования было изучение влияния гипоксии на активность Snail1 и роли последнего в регуляции чувствительности к гипоксии клеток РМЖ.
Обнаружено, что гипоксия вызывает существенное повышение в клетках MCF-7 и HBL-100 трансрепрессорной активности Snail 1, определяемой по степени подавления экспрессии репор-терного гена E-cad/luc (рис. 2а). Для дальнейшего изучения роли Snail1 в регуляции ответа клеток на гипоксию была использована методика подавления экспрессии Snail1 с помощью короткой интерферирующей РНК. Установлено, что подавление Snail1 приводит к увеличению чувствительности
клеток HBL-100 к гипоксии, что свидетельствует об участии этого белка в поддержании выживаемости клеток в условиях гипоксии (рис. 2б).
В какой степени активация Snail1 может быть связана с потерей рецепторов эстрогенов и раз-
0
100
Л -
и W о о
50
К
0
MCF-7 HBL-100 si-scrambl si-Snail1
Контроль □ Гипоксия (1%О2)
Рис. 2. Влияние гипоксии на трансрепрессорную активность БпаИ1 в клетках МСЕ-7и ИБЬ-100 (а); влияние трансфекции siRNA Бпа111 на чувствительность клеток ИБЬ-100 к гипоксии (б)
И
2000
« u 1500 ы 4 а £ 2 ^
S €
о ^
я 8 500
М I
S W т(
Snail1
1000
0
<—ERa
<-P-actin
HBL-100
рс3
ERa
Контроль
□ ERa
HBL-100
Рис. 3. Влияние трансфекции ERa на трансрепрессорную активность (а) и экспрессию (иммуноблоттинг) (б) Snaill в клетках HBL-100
Молекулярная медицина №1, 2013
31
0
витием гормональной резистентности? Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали влияние трансфекции рецептора эстрогенов на активность Snaill. Было показано, что трансфекция ERa приводит к заметному подавлению трансрепрессор-ной активности Snaill при отсутствии выраженных изменений в уровне белка, что свидетельствует об участии ERa в негативной регуляции Snaill (рис. 3а, б).
Участие кадхерин-катенинового сигнального пути в реакции клеток на гипоксию. Для дальнейшего исследования механизма действия Snaill в условиях гипоксии проанализировано содержание Е-кадхерина (E-cadherin) — одного из основных трансмембранных белков, находящихся под негативным контролем Snaill. Как и ожидалось, уровень Е-кадхерина в клетках HBL-l00 оказался резко понижен по сравнению с таковым в клетках MCF-7 (рис. 4а), при этом гипоксия практически не влияла на содержание Е-кадхерина (рис. 4б).
Известно, что в клетках Е-кадхерин образует комплекс с р-катенином — белком, который участвует в формировании клеточных контактов, но при диссоциации комплекса с Е-кадхерином транс-
лоцируется в клеточное ядро и функционирует как транскрипционный кофактор [8, 20]. Для исследования влияния гипоксии на активность р-катенина была проведена трансфекция клеток репортерной конструкцией, содержавшей ген люциферазы под контролем р-катенин-чувствительного промотора с последующим культивированием клеток при гипоксии. Полученные результаты продемонстрировали выраженное увеличение транскрипционной активности р-катенина в условиях гипоксии (рис. 5а), развивающееся параллельно с активацией Snaill (см. рис. 2а).
Каким образом р-катенин включается в регуляцию гипоксического ответа клеток? По последним данным литературы, одним из таких путей может быть взаимодействие р-катенина с HRE промоторов HIF-l-зависимых генов [7, 9]. Изучая в эксперименте влияние р-катенина на активность репортерной плазмиды, содержавшей ген люциферазы под контролем HRE, мы установили, что уровень активации репортерной плазмиды под действием гипоксии существенно ослабляется в присутствии специфического низкомолекулярного ингибитора р-катенина — ICG-00l (рис. 5б), что свидетельствует о непосредственном участии р-катенина в регуляции HIF-l-зависимых генов в клетках РМЖ.
E-кадхерин
- P-actin
HBL-l00
E-кадхерин
- P-actin
Контроль Гипоксия MCF-7
Рис. 4. Сравнительный анализ Е-кадхерина в клеткахMCF-7и HBL-100(а); влияние гипоксии на содержание Е-кадхерина в клеткахMCF-7(б)
Рис. 5. Транскрипционная активность в-катенина в условиях гипоксии (а); влияние ингибитора в-катенина ICG-001 на активность HRE (б)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленные данные свидетельствуют, что высокий уровень Snaill является одним из факторов, поддерживающих выживаемость клеток РМЖ в условиях гипоксии; при этом активация Snaill может быть обусловлена (как минимум, частично) снижением активности рецептора эстрогенов ER, связанного со Snaill-системой негативной регуляции.
Мы рассматриваем полученные результаты как базу для дальнейших исследований, цель которых — изучение механизма адаптации опухолевых клеток к гипоксии и разработка на основе полученных данных новых подходов, повышающих чувствительность злокачественных опухолей к антиангиогенной терапии.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 11-04-00222 и 12-04-00992) и Благотворительного фонда «Протек».
32
№1, 2013 Молекулярная медицина
ЛИТЕРАТУРА
1. Arpino G., De Angelis C., Giuliano M. et al. Molecular mechanism and clinical implications of endocrine therapy resistance in breast cancer // Oncology. - 2009; 77 (1): 23-37.
2. Brahimi-Horn M., Pouyssegur J. The hypox-ia-inducible factor and tumor progression along the angiogenic pathway // Int. Rev. Cytol. - 2005; 242: 157-213.
3. Chun Y., Adusumilli P., Fong Y. Employing tumor hypoxia for oncolytic therapy in breast cancer // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. - 2005; 10: 311-18.
4. Eguchi M., Nguyen C., Lee S. et al. ICG-001, a novel small molecule regulator of TCF/ beta-catenin transcription // Med. Chem. - 2005; 1: 467-72.
5. Folkman J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis // Semin. Oncol. -2002; 29: 15-8.
6. Generali D., Buffa F., Berruti A. et al. Phosphorylated ERalpha, HIF-1alpha, and MAPK signaling as predictors of primary endocrine treatment response and resistance in patients with breast cancer //
J. Clin. Oncol. - 2009; 27: 227-34.
7. Iqbal S., Zhang S., Driss A. et al. PDGF upregulates Mcl-1 through activation of beta-catenin and HIF-1alpha-dependent signaling in human prostate cancer cells // PLoS One. - 2012; 7: e30764.
8. Jin T., George Fantus I., Sun J. Wnt and beyond Wnt: multiple mechanisms control the
transcriptional property of beta-catenin // Cell Signal. - 2008; 20: 1697-704.
9. Lehwald N., Tao G., Jang K. et al. Wnt-beta-catenin signaling protects against hepatic ischemia and reperfusion injury in mice // Gastroenterology. - 2011; 141: 707-18.
10. Lobanova Y., Scherbakov A., Shatskaya V. et al. NF-kappaB suppression provokes the sensitization of hormone-resistant breast cancer cells to estrogen apoptosis // Molecular and cellular biochemistry. - 2009; 324:65-71.
11. Musgrove E., Sutherland R. Biological determinants of endocrine resistance in breast cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2009; 9: 631-43.
12. Rapisarda A., Uranchimeg B., Sordet O. et al. Topoisomerase I-mediated inhibition of hypoxia-inducible factor 1: mechanism and therapeutic implications // Cancer Res. - 2004; 64: 1475-82.
13. Reid G., Hubner M., Metivier R. et al. Cyclic, proteasome-mediated turnover of unliganded and liganded ERalpha on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling // Mol. Cell. - 2003; 11: 695-707.
14. Romijn J., Verkoelen C.,Schroeder F. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment
of hormone-stimulated growth and drug-
induced cytostatic and cytotoxic effects // Prostate. - 1988; 12: 99-110.
15. Scherbakov A., Andreeva O., Shatskaya V. et al. The relationships between snail1 and estrogen receptor signaling in breast cancer cells // J. Cell Biochem. - 2012; 113: 2147-55.
16. Schmidt D., Textor B., Pein O. et al. Critical role for NF-kappaB-induced JunB in VEGF regulation and tumor angiogenesis // Embo J. - 2007; 26: 710-19.
17. van Agthoven T., Sieuwerts A., Meijer-van Gelder M. et al. Relevance of breast cancer antiestrogen resistance genes in human breast cancer progression and tamoxifen resistance // J. Clin. Oncol. -2009; 27: 542-49.
18. van Agthoven T., Veldscholte J., Smid M. et al. Functional identification of genes causing estrogen independence of human breast cancer cells // Breast Cancer Res. Treat. - 2009; 114: 23-30.
19. Vincent T., Neve E., Johnson J. et al.
A SNAIL1-SMAD3/4 transcriptional repressor complex promotes TGF-beta mediated epithelial-mesenchymal transition // Nat. Cell Biol. - 2009; 11: 943-50.
20. Weis W., Nelson W. Re-solving the cadherin-catenin-actin conundrum // J. Biol. Chem. -2006; 281: 35593-7.
21. Zhou J., Schmid T., Schnitzer S. et al. Tumor hypoxia and cancer progression // Cancer Lett. - 2006; 237: 10-21.
Молекулярная медицина
33
