CC BY
51
© О. А. Шепель
УДК 612. 622:577. 245
О. А. Шепель
МЕХАНІЗМ ДІЇ ІНТЕРФЕРОНУ-А НА МЕЙОТИЧНЕ ДОЗРІВАННЯ ООЦИТІВ,
ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ ТА ЗАГИБЕЛЬ ФОЛІКУЛЯРНИХ КЛІТИН
Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України (м. Київ)
Робота виконувалась відповідно науковій тематиці «Вивчення механізмів розвитку імуноіндукова-них запальних процесів в печінці і органах жіночої репродуктивної системи та шляхів їх корекції», державний реєстраційний номер 0108U003914.
Вступ. Інтерферони (ІФН) - поліфункціональні цитокіни, які беруть участь в антивірусному, антимікробному, протипухлинному захисті організму, а також мають антипроліферативні, імуномодулюючі та радіопротективні властивості [1]. ІФН відіграють важливу роль у захисті організму, модулюючи генну експресію через активацію янус кіназ та факторів сигнальної трансдукції і активації транскрипції (Jak-STAT) [10]. ІФН І типу активують Jak1 і Tyk2 тирозинкінази та генерують цитоплазматичні сигнали фосфориляцією тирозину STAT-білків [1]. ІФН-активовані STATs (STAT1, STAT2, и STAT3) димеризу-ються і переміщаються в ядро, щоб викликати генну транскрипцію. В основі всіх ефектів ІФН лежать зміни активності визначених генних комплексів клітин -ІФН-індукованих генів. Крім цього загальноприйнятого шляху для реалізації ефекту ІФН-а ідентифіковано сигнальну систему, пов’язану з активацією фосфатидилінозитол З-фосфату/Akt (протеїнкінази В) та ядерного транскрипційного фактору-кБ (NF-кБ), що активується в залежності від типу клітин [9]. Встановлено, що NF-кБ, крім функції регулювання імунних та запальних реакцій, захищає клітини проти апоптотичних стимулів [6, 10]. Миші, у яких пошкоджений ген RelA/p65, помирають в ембріональний період від обширного апоптозу в печінці [6]. Однак активація NF-Kß інтерфероном захищає клітини від апоптотичної загибелі. Припускають, що здатність ІФН-а стимулювати апоптоз врівноважена індукцією сигналів виживання клітини через сигналізацію, залежну від STAT3, РІЗК і Akt, що призводить до активації NF-Kß [10, 11]. Встановлено вплив ІФН-а на мейотичне дозрівання ооцитів та життєздатність і загибель клітин їх кумулюсного оточення у мишей [З, 4, 5]. Однак сигнальні шляхи, які активуються при зв’язуванні ІФН-а зі специфічними рецепторами і стимулюють транскрипцію ІФН-індукованих генів в ооциті та кумулюсних клітинах не з’ясовані. Розуміння молекулярної основи дії ІФН-а є важливим, беручи до уваги терапевтичний потенціал ІФН-а при
лікуванні багатьох захворювань органів репродуктивної системи [10]. Можливість модуляції дії ІФН-а на апоптоз та виживання клітин дасть змогу підсилити клінічно корисні ефекти ІФН-а або ж, навпаки, мінімізувати небажані дії ІФН-а при певних патологічних станах.
Тому метою роботи було дослідити участь сигнальних шляхів, пов’язаних із активацією ^к-ЭТАТ білків та РІ3К у механізмі дії ІФН-а на мейотичне дозрівання ооцитів мишей, а також життєздатність і загибель фолікулярних клітин.
Об’єкт і методи дослідження. Дослідження проведені на самицях статевозрілих мишей СВА віком 6-8 тижнів, масою 16-20 г, що утримувалися на стандартному раціоні віварію. Утримання тварин та експерименти проводилися відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985), «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», ухвалених Першим національним конгресом з біо-етики (Київ, 2001).
Під ефірним наркозом тварин забивали методом зміщування шийних хребців. Фолікули механічно звільняли від сполучної тканини під мікроскопом МБС-9. Після проколу фолікула голкою виділяли кумулюсно-ооцитарні клітинні комплекси (КОКК). Пропускаючи КОКК через тонку скляну піпетку, отримували ізольовані ооцити, що знаходилися на стадії «зародкового пухирця» (ЗП+), яку встановлювали за наявністю чітко сформованої ядерної оболонки [2]. КОКК та ооцити культивували при 37 °С у стерильному боксі в камерах, що містили 500 мкл культурального середовища йМЕМ з 15 ммоль НЕРЕЭ з фізіологічною концентрацією Са2+ (1,71 ммоль/л) та додаванням відповідних препаратів (ІФН-а (100 нг/ мл), ІУ294002 (специфічний інгібітор РІЗК; 1 цМ, 10 цМ, 50 цМ), геністеїн (інгібітор тірозін кінази 2; 100 цМ). Усі контрольні та тестовані ооцити і КОКК культивувалися в однакових умовах. Після 4 год. культивування підраховували кількість ооцитів із розчиненим зародковим пухирцем (ЗП-, стадія метафази І), а через 20 год. - таких, що сформували перше полярне тільце (ПТ, стадія метафази ІІ) [7]. Вираховували відношення кількості ооцитів з (ЗП-) та ооцитів
з ПТ до початкової (загальної) кількості (ЗП+) ооци-тів у відсотках (% ЗП- та % ПТ).
Для оцінки стану клітин фолікулярного оточення ооцитів використано метод прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками: Хехст 33422 та пропідіум йодид [8]. Останній проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами і забарвлює їх ядра в оранжевий колір. Барвник Хехст 33342 проникає і через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин в синьо-зелений колір.
Результати досліджень та їх обговорення.
I. Для дослідження участі Янус-кіназ та білків сигнальної трансдукції і активації транскрипції ^ак-БТАТ) у механізмі дії ІФН-а на мейотичне дозрівання ооцитів та життєздатність і загибель фолікулярних клітин мишей був використаний геністеїн (100 цМ). Результати показали, що безпосередньо геністеїн не впливав на мейотичне дозрівання ооцитів (відповідно для метафази І і ІІ: 87,11±2,31 та 49,12±4,49% проти 89,84±3,48 та 56,53±4,71% у контролі). Застосування геністеїна в умовах впливу ІФН-а (100 нг/мл) на 24% покращує дозрівання ооцитів. Зокрема, відсоток ооцитів, що відновили мейоз та сформували перше ПТ, відповідно складав 89,60±4,30 і 50,02±4,13% (р<0,05), в той час, як під час самостійної дії ІФН- а цей показник дорівнював, відповідно, 76,58±2,07 та 38,00±1,58% (р<0,05).
Встановлено, що геністеїн не впливав на кількість живих та апоптотичних гранулярних клітин (відповідно: 69,33±1,28% та 26,50±1,48% проти 68,17±0,60% та 26,00±0,89% у контролі; р>0,05), але зменшував число некротичних порівняно з контролем (4,17±0,48% проти 5,83±0,48% у контролі; р<0,05). Під час сумісної дії геністеїну з ІФН-а збільшувалась кількість живих клітин за рахунок зниження апоптотичних (відповідно 51,50±0,91 та 43,00±0,65%) порівняно з самостійною дією ІФН-а (відповідно 41,25±1, 11 та 55,75±1,31%; р>0,05). Водночас, даний показник живих клітин залишався вірогідно меншим, а кількість апоптотичних - більшою порівняно з контролем (68,17±0,60 та 26,00±0,89%; р>0,05) та дією геністеїна (69,33±1,28 та 26,50±1,48%; р>0,05). Відсоток некротичних клітин за даних умов відносно контролю і гінестеїну вірогідно не змінювався (5,50±0,63% - геністеїн+ІФН-а; 5,83±0,48% -контроль; 4,17±0,48% - гінестеїн).
Таким чином, отримані результати дозволяють стверджувати, що інгібіторний вплив ІФН-а на мейотичне дозрівання ооцитів, а також гранулярні і ку-мулюсні клітини частково опосередкований активацією иак-БТАТ білків.
II. Для дослідження участі сигнальної системи, пов’язаної з активацією РІ3К при дії ІФН-а на мейотичне дозрівання ооцитів мишей та життєздатність і загибель фолікулярних клітин в експериментах був використаний специфічний інгібітор РІ3К - І_У294002 у концентраціях 1 цМ, 10 цМ та 50 цМ. Встановлено, що в ізольованих ооцитах _У294002 у дозі 1 цМ не впливав на відновлення мейозу та формування
першого ПТ (відповідно 88,64±2,35 та 54,61±3,24% порівняно з 89,43±2,94 та 64,41 ±4,60% у контролі р>0,05). Збільшення концентрації _У294002 до 10 цМ та 50 цМ не впливало на відновлення мейозу (відповідно, 88,74±1,56 та 88,26±1,83% проти 89,43±2,94% у контролі), але знижувало кількість ооцитів із першим ПТ (відповідно, 49,26±3,85 та 27,62±3,34% проти 64,41±4,60% у контролі; р<0,05). Ці дані є непрямим доказом для ролі РІ3К у регуляції мейотичного дозрівання після стадії метафази І. В ооцитах, культивованих у складі КОКК, _У294002 у концентрації 1 цМ не мав ефекту на мейотичне дозрівання ооцитів (58,72±2,50% порівняно з контрольним 65,74±2,71%), 10 цМ та 50 цМ _У294002 знижували кількість ооцитів із першим ПТ (відповідно 52,28±2,73 та 30,96±2,28% проти 65,74±2,71% у контролі; р<0,05).
Оскільки у дозі 10 цМ інгібітор виявляв найменший вірогідний інгібіторний вплив для подальших досліджень з ІФН-а була використана саме ця його концентрація. Під час сумісної дії ІФН-а (100 нг/мл) та _У294002 (10 цМ) спостерігалось посилення ін-гібіторного впливу ІФН-а на здатність ізольованих ооцитів формувати перше ПТ (29,84±1,84% порівняно з дією ІФН-а 39,02±2,09%; р<0,05). Крім того відбувалось пригнічення мейозу в ооцитах, культивованих у складі КОКК (39,35±3,43%; р<0,05), в той час коли ІФН-а, діючи самостійно на КОКК, не викликав змін у дозріванні ооцитів (62,41±3,24% порівняно з 65,74±2,71%).
Встановлено, що _У294002 мав незначну токсичність на гранулярні клітини. В дозі 1 цМ інгібітор не впливав на життєздатність фолікулярних клітин, збільшення концентрації до 10 і 50 цМ знижувало кількість живих (60,75±0,48 та 42,88±0,95%) та збільшувало число апоптотичних клітин (32,75±0,63 та 50,50±1,08%) порівняно з контролем (66,88±0,41 та 26,88±0,69%). Показник некротичної загибелі не змінювався; відповідно для _У294002 10 цМ, 50 цМ та в контролі: 6,50±0,29, 6,63±0,46 і 6,25±0,53%. Для подальшого дослідження була використана концентрація інгібітора, яка має найменший вірогідний вплив на клітини, тобто 10 цМ. Показано, що його дія в умовах впливу ІФН-а (100 нг/мл) значно посилювала апоптотичну загибель, але не впливала на некроз фолікулярних клітин (порівняно із самостійним впливом ІФН-а). Відповідно відсоток живих, апоптотичних і некротичних клітин при дії _У294002 (10 цМ) + ІФН-а складав: 36,00±0,46, 56,88±0,44 та 7,13±0,29% проти 47,5±0,89, 47,38±1,97 та 2,00±0,26% - при дії ІФН-а.
Отже, результати свідчать, що ІФН-а під час дії на ооцити активує РІ3К-сигнальний шлях, який зменшує інгібіторний вплив цитокіна на них. А у випадку КОКК нівелює його дію, що дозволяє ооцитам досягти стадії метафази ІІ. Встановлено, що вплив ІФН-а на життєздатність та загибель фолікулярних клітин також опосередкований активацією РІ3К-залежного шляху, який захищає їх від токсичного ефекту ІФН-а (рис.).
Висновок. Встановлено, що вплив ІФН-а на мейотичне дозрівання ооцитів, а також життєздатність і загибель фолікулярних клітин пов’язаний із залученням 2 сигнальних шляхів: активацією Jak-STAT, що відповідає за клітинну загибель, а також PI3K-залежного шляху, який зменшує токсичний ефект цитокіну.
Перспективи подальших досліджень. У подальшій роботі планується дослідити вплив активації PI3K-залежного шляху, індукованої ІФН-а, на мейотичне дозрівання ооцитів мишей, а також життєздатність і загибель фолікулярних клітин за умов імунного ушкодження яєчників з метою з’ясування молекулярної основи дії ІФН-а на ооцити та їх куму-люсне оточення за даних умов.
Література
1. Лазаренко Л. М. Папіломовірусна інфекція та система інтерферону / Л. М. Лазаренко, М. Я. Співак, О. М. Михайленко, Г. Т. Сухих. - К.: Фітосоціоцентр, 2005. - 288 с.
2. Манк М. Биология развития млекопитающих: Методы / М. Манк. - М.: Мир, 1990. - 406 с.
3. Шепель О. А. Вплив цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей в умовах експериментального імунного пошкодження яєчників ксеногенними антиоваріальними антитілами / О. А. Шепель, О. М. Сердюк // Матеріали VI Міжнародної науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених “Шевченківська весна”, м. Київ, Україна, 2023 березня, 2008.: Тези доповідей. - Вип. VI : У 4-х част., Ч. 2. - С. 114-115.
4. Янчій Р. І. Вплив альфа інтерферону на відновлення мейотичного дозрівання ооцитами мишей in vitro / Р. І. Янчій, Т. Ю. Вознесенська, О. А. Зюбіна // Наук. записки Терноп. нац. пед. ун-ту ім. В. Гнатюка, сер. біол. - 2005. - № 1-2 (25). - С. 85-89.
5. Янчій Р І. Цитокіни - як чинники впливу на репродуктивну систему / Р І. Янчій, Т. Ю. Вознесенська, О. А. Шепель [та ін.] // Наук. записки Терноп. нац. пед. ун-ту ім. В. Гнатюка, сер. біол. - 2007. - № 1. - С. 89-95.
6. Beg A. A. Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kappa B / A. A. Beg, W. C. Sha, R. T. Bronson [et al.] // Nature. - 1995. - Vol. 376, № 6536. - P 167-170.
7. Donahue R. P. Maturation of the mouse oocyte in vitro I. Sequence and timing of nuclear progression / R. P. Donahue // J. Exp. Zool. - 1968. - Vol. 169, № 2. - P. 237-249.
8. Shimizu S. Involvement of ICE family proteases in apoptosis induced by reoxygenation of hypoxic hepatocytes / S. Shimizu, Y Eguchi, W. Kamiike [et al.]// Am. J. Physiol. - 1996. - Vol. 271, № 6 (Pt. 1). - P. 949-958.
9. Yang C. H. Interferon induces NF-KB-inducing kinase/tumor necrosis factor receptor-associated factor-dependent NF-kB activation to promote cell survival / C. H. Yang, A. Murti, L. M. Pfeffer // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280, Issue 36. -P. 31530-31536.
10. Yang C. H. Interferon a/p promotes cell survival by activating nuclear factor kB through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt / C. H. Yang, A. Murti, S. R. Pfeffer [et al.]// J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276, Issue 17. - P 13756-13761.
11. Yang C. H. Interferon-alpha activates NF-kappa B in JAK1-deficient cells through a TYK2-dependent pathway / C. H. Yang, A. Murti, W. J. Valentine [et al.]// J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280, Issue 27. - P. 25849-25853.
УДК 612. 622:577. 245
МЕХАНІЗМ ДІЇ ІНТЕРФЕРОНУ-А НА МЕЙОТИЧНЕ ДОЗРІВАННЯ ООЦИТІВ, ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ ТА ЗАГИБЕЛЬ ФОЛІКУЛЯРНИХ КЛІТИН
Шепель О. А.
Резюме. Вплив інтерферону-а на мейотичне дозрівання ооцитів мишей, життєздатність і загибель фолікулярних клітин опосередкований залученням 2 сигнальних шляхів, пов’язаних з активацією: 1) янус-кіназ і білків сигнальної трансдукції та активації транскрипції, які відповідають за пригнічення мейозу та клітинну загибель; 2) фосфатидилінозитол 3-кінази, що зменшує токсичний ефект цитокіну.
Ключові слова: ооцити, фолікулярні клітини, інтерферон-а, янус-кіназа і білки сигнальної трансдукції та активації транскрипції, фосфатидилінозитол 3-кіназа.
Рис. Схема, що описує залучення сигнальних шляхів, пов’язаних із активацією иак-БТАТ і РІ3К під час дії ІФН-а (ІРИа) на ооцити та гранулярні клітини мишей.
УДК 612. 622:577. 245
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ИНТЕРФЕРОНА-А НА МЕЙОТИЧЕСКОЕ СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ, ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ГИБЕЛЬ ФОЛЛИКУЛЯРНЫХ КЛЕТОК
Шепель Е. А.
Резюме. Влияние интерферона-а на мейотическое созревание ооцитов мышей, жизнеспособность и гибель фолликулярных клеток опосредовано вовлечением 2 сигнальных путей, связанных с активацией: 1) янус-киназ и белков сигнальной трансдукции и активации транскрипции, ответственных за угнетение мейоза и клеточную гибель; 2) фосфатидилинозитол 3-киназы, которая уменьшает токсический эффект цитокина.
Ключевые слова: ооциты, фолликулярные клетки, интерферон-а, янус-киназа и белки сигнальной трансдукции и активации транскрипции, фосфатидилинозитол 3-киназа.
UDC 612. 622:577. 245
Mechanism of Action of Interferon Alpha on Oocyte Meiotic Maturation, Follicular Cell Viability and Death
Shepel O. A.
Summary. It is well known that cytokines play the role in local regulation of ovarian function. One of the least studied factors is interferon-а (IFN-а). Earlier, we found that in mice IFN-а inhibits meiotic maturation of oocytes isolated from cumulus cells. However, the mechanism by which this immunomodulator acts upon germ cells is not fully identified. In somatic cells IFN-а reveals its biological effects by modulating the expression of certain genes through activation of Janus kinases and Signal Transducer and Activator of Transcription (Jak-STAT). Apart from this main pathway, IFN-а can act through another signaling system that is associated with activation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. Cell signaling in oocytes and follicular cells is still not sufficiently studied. Therefore the purpose of the work was to investigate the involvement of signaling pathways associated with activation of Jak-STAT and PI3K in the mechanism of IFN-а action on oocyte meiotic maturation as well as follicular cell viability and death in mice.
Experiments were carried out on mature CBA female mice (18-20 g). Follicles were separated from ovaries and cumulus-oocyte cellular complexes were extracted mechanically. The cumulus-oocyte cellular complexes were cultured for 20 hours under the influence of corresponding agents. For experiments were used genistein (inhibitor of tyrosine protein kinase 2) and LY294002 (inhibitor of PI3K). The number of metaphase I oocytes was counted after four hours, while the number of metaphase II oocytes was estimated after 20 hours of culture by light microscopy. The percentage of viable, apoptotic and necrotic follicular cells was determined by their vital staining with fluorescent dyes Hoechst 33342 and propidium iodide. Not less than 200 cells were counted in each preparation; the ratio (%) of live, apoptotic and necrotic cells to the total amount of cells was calculated. The data were evaluated statistically using Student’s t-test for pairwise comparisons. Values were considered significantly different if *p<0,05.
Addition of genistein in a medium with IFN-а improved the oocyte meiotic maturation 24%. The percentage of oocytes that resumed meiosis and formed the first polar body, respectively was 89,60±,30 and 50,02±4,13% (p<0,05), compared with the effect of IFN-а alone respectively, 76,58±2,07 and 38,00±1,58% (p<0,05). Moreover, the number of live cells increased and the number of apoptotic cells reduced (respectively 51,50±0,91 and 43,00±0,65% compared with 41,25±1,11 and 55,75±1,31% under IFN-а action; p>0,05). Joint action of IFN-а (100 ng/ml) and LY294002 (10 цМ) resulted in increased inhibitory effect of IFN-а, compared with the effect of IFN-а alone: the number of oocytes at metaphase II was respectively 29,84±1,84% and 39,02±2,09% (p<0,05). The number of apoptotic cells increased considerably enhanced apoptotic cell death, but did not affect the necrosis when adding LY294002 in the medium with IFN-а. So the percentage of live, apoptotic and necrotic cells was respectively 36,00±0,46, 56,88±0,44 and 7,13±0,29% (p>0,05) compared with the effect of IFN-а alone, respectively 47,5±0,89, 47,38±1,97 and 2,00±0,26% (p>0,05).
Thus, effect of IFN-а on oocyte meiotic maturation, viability and death of follicular cells in mice is associated with two signaling pathways involvement - Jak-STAT, which is responsible for meiosis inhibition and cell death, as well as PI3K pathway, which reduces the toxic effect of the cytokine.
Key words: oocytes, follicular cells, interferon-а, Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, phosphatidylinositol 3-kinase.
Рецензент - проф. Мщенко I. В.
Стаття надшшла 12. 06. 2013 р.
