Научная статья на тему 'Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов -хитина и хитозана'

Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов -хитина и хитозана Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
928
192
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ПОЛИСАХАРИДЫ / ХИТИН / ХИТОЗАН / ПЛЕНКИ / ФИБРОБЛАСТЫ / КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Панарин Е. Ф., Нудьга Па, Петрова В. А., Бочек Am, Гофман И. В.

С целью получения резорбируемых матриц для культивирования клеток кожи человека разработаны составы и условия формования пленочных материалов на основе природных полисахаридов хитина и хитозана. Определено количество первичных аминогрупп, обеспечивающих адгезию и пролиферацию фибробластов кожи на поверхности пленок. Необходимая степень дезацетилирования (СД) достигнута путем щелочной обработки хитина либо термообработкой хитозановых пленок. Для обеспечения пористости пленок в формовочный раствор вводили нетоксичные добавки эфиров целлюлозы, поливинил-пирролидона или поливинилового спирта (ПВО. Определены степени структурирования формовочных растворов и физико-механические свойства полученных пленок. Проведено тестирование пленок на пригодность в качестве матриц для культивирования фибробластов кожи человека. Показано, что добавка синтетического полимера (ПВО приводит к ухудшению адгезии и гибели клеток. Наилучшие результаты получены на пленках из частично дезацетилированного хитина (СД 0,20] и термо-обработанных хитозановых пленках клетки хорошо адгези-ровали и образовали монослой за 5 суток культивирования.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Панарин Е. Ф., Нудьга Па, Петрова В. А., Бочек Am, Гофман И. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов -хитина и хитозана»

Оригинальные исследования

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов -хитина и хитозана

Е.Ф. Панарин1, ПА. Нудьга1, В А. Петрова1, А.М. Бочек1, И.В. Гофман1,

М.Ф. Лебедева1, М.И. Блинова 2, ОГ. Спичкина 2, Н.М. Юдинцева 2, ГЛ. Пинаев 2

1 Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург

2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Matrices for culturing human skin cells based on natural polysaccharides - chitin and chitosan

E.F. Panarin1, LA. Nud'ga1. V.A. Petrova1. A.M. Bochek1,I.V. Gofman1. M.F. Lebedeva1,

M.F. Blinova 2. O.G. Spichkina 2. N.M. Yudintseva 2. G.P. Pinaev2 11nstitute of Macromolecular Compounds RAS, Saint Petersburg 2 Institute of Cytology RAS, Saint Petersburg

С целью получения резорбируемых матриц для культивирования клеток кожи человека разработаны составы и условия формования пленочных материалов на основе природных полисахаридов — хитина и хитозана. Определено количество первичных аминогрупп, обеспечивающих адгезию и пролиферацию фибробластов кожи на поверхности пленок. Необходимая степень дезацетилирования (СД) достигнута путем щелочной обработки хитина либо термообработкой хитозановых пленок. Для обеспечения пористости пленок в формовочный раствор вводили нетоксичные добавки эфиров целлюлозы, ПОЛИВИНИЛ-пирролидона или поливинилового спирта (ПВС). Определены степени структурирования формовочных растворов и физикомеханические свойства полученных пленок. Проведено тестирование пленок на пригодность в качестве матриц для культивирования фибробластов кожи человека. Показано, что добавка синтетического полимера (ПВС) приводит к ухудшению адгезии и гибели клеток. Наилучшие результаты получены на пленках из частично дезацетилированного хитина (СД 0,20) и термообработанных хитозановых пленках — клетки хорошо адгези-ровали и образовали монослой за 5 суток культивирования.

Ключевые слова: Полисахариды, хитин, хитозан, пленки, фибробласты, культивирование.

The compositions and formation conditions of the films based on natural polysaccharides — chitin and chitosan were developed to obtain resorbtive matrices for human dermal cells cultivation. The optimal amount of amino groups was determined insuring cells adhesion and proliferation. The required degree of deacetylation (CD) was achieved by alkali treatment of chitin or thermal processing of the chitosan films. Some additions of cellulose ethers, polyvinylpirrolidone or polyvinylalcohol (PVA) were introduced in the film forming solutions to obtain porous chitin films. The structurization degrees of solutions were calculated. The mechanical tests of obtained films were carried out. The films were tested as matrix layers for fibroblast cells cultivation. The addition of synthetic polymer (PVA) in the film forming solution was shown to level down cells adhesion and provoke the cells death. The best results were obtained at films of partly deacetylated chitin (CD=0.20) and thermally treated chitosan films. While using these films as matrices fibroblast cells adhered effectively and formed the monolayer during 5 days of cultivation.

Key words: polysaccharides, chitin, chitosan, membranes, fibroblasts, culturing.

Создание новых матричных материалов на основе природных полисахаридов, которые могут служить подложкой для культивирования кератиноцитов и фибробластов, покровом для раневых поверхностей и трансплантатом при восстановлении поврежденных участков кожи человека является актуальной задачей заместительной клеточной терапии. Особенно важно разработать биосовме-стимые матрицы, способные рассасываться в организме человека в процессе заживления раны без осложнений и интоксикации организма продуктами распада.

В последние десятилетия в зарубежных клиниках для решения этих проблем стали применять многослойные пласты кератиноцитов, выращенные in vitro. В процессе культивирования количество клеток, выделенное из кусочка кожи, может увеличиваться в десятки тысяч раз, что позволяет закрывать большие раневые поверхности. Однако при трансплантации пласты кератиноцитов

e-mail: noudga@imc.macro.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009

необходимо ферментативно отделить от подложки, что приводит к повреждению клеточной мембраны и затрудняет процесс трансплантации. При трансплантации клеток, выращенных на полимерной рассасывающейся матрице, можно избежать нарушения клеточной целостности, ускорить и облегчить процесс пересадки клеточных продуктов.

В качестве таких полимерных матриц целесообразно использовать материалы на основе хитина (ХИН) и его производного хитозана. Эти природные полисахариды биологически совместимы, обладают иммуноадъювант-ным, антимикробным, фунгистатическим, радиопротектор-ным, противоопухолевым, ранозаживляющим, антихоле-стерическим и гемостатическим действием [1]. Они распадаются под действием фермента лизоцима (мура-мидаза — mucopeptide-N-acethylmuramowile hydrolyse, индекс 3.2.1.17) в организме человека на N-ацетилглю-

Оригинальные исследования

козамин и глюкозамин — естественные продукты метаболизма. Изучение механизма воздействия названных полисахаридов на иммунную систему организма показало, что хитин и в большей степени хитозан увеличивают активность ферментов гликолиза фагоцитов [2]. Частично дезацетилированный хитин также активирует макрофаги, проявляет биологическую активность не свойственную нативному хитину и легче расщепляется лизоцимом [3].

Указанные характеристики хитина и хитозана позволяют полагать, что материалы на их основе перспективны для использования их в качестве матрицы для культивирования клеток кожи человека и последующей трансплантации их при лечении ожоговых и других травматических поражений кожного покрова.

На основании имеющихся литературных данных можно сформулировать требования, предъявляемые к полимерным матрицам, используемым в качестве субстрата для культивирования клеток кожи. Полимер и продукты его разложения в организме должны быть нетоксичными, полимерные матрицы должны быть стабильными во время культивирования клеток, сохранять прочность при перенесении на рану и резорбироваться в процессе их заживления. Для лучшей адгезии клеток матрица должна содержать на поверхности небольшое количество первичных аминогрупп, обладать пористостью и шероховатой поверхностью.

Настоящая работа посвящена разработке состава, способа формования матриц на основе модифицированного хитина и характеристике физико-химических свойств полученных материалов, а также изучению их пригодности для культивирования клеток кожи человека.

Материал и методы

В работе использован хитин, полученный из панцирей крабов (фирма «Сонат», Москва), подвергнутый дополнительной очистке от солей кальция (обработка 2% НС1), липидов (экстракция ацетоном) и протеинов (экстракция 6% №ОН), отмытый водой до нейтральной реакции, промытый ацетоном и высушенный в вакууме при 40 С. После дополнительной очистки хитин имел следующие характеристики: зольность — 0%, белок отсутствует (по реакции кумасси), элементный анализ С — 46,40; Н - 5,86; N — 6,19; [^1 = 8,4 дл/г, М = 137 кДа, рассчитано по формуле [^] = 2,4х10~3 - М0-89 [4].

Частично дезацетилированный хитин был получен щелочной обработкой очищенного хитина. После тщательной отмывки до нейтральной реакции, сушки при комнатной температуре и выдержки в эксикаторе над Р205, полученные образцы анализировали на элементный состав, содержание аминного азота методом кондукто-метрического титрования и определяли молекулярную массу вискозиметрически. Характеристики полученных образцов приведены в таблице. 1.

Поливинилпирролидон (ПВП) — синтезирован в ИВС РАН, ММ = 35 кДа.

Таблица 1. Условия получения и характеристика

образцов частично дезацетилированного хитина

№ Условия реакции N амин, сд, [л]> ММ

обр. Т, °К время, мин % % дл/г

1 - - 0,26 0,04 8,4 137000

2 3S3 30 0,8S 0,12 3,94 45600

3 373 30 1,45 0,19 3,89 44900

Поливиниловый спирт (ПВС) — ММ = 100 кДа.

Гидроксиэтилцеллюлоза (ГОЗЦ) ^производства «По-лимерсинтез» (Владимир), мольное замещение 1,98; ММ = 305 кДа.

Формование хитиновых пленок проводили по сухомокрому и мокрому способам. Хитин и полимерные добавки были растворены в ДМАА/5% LiCI раздельно с получением 3% концентрации по каждому полимеру. Затем были приготовлены смеси растворов полимеров с содержанием 2,5 и 10% порообразующего полимера.

Реологические измерения проводили на ротационном вискозиметре «Реотест 2.1.» с рабочим узлом цилиндр^цилиндр в диапазоне напряжений сдвига 3^600 Па в интервале температур 293^308оК.

При сухо-мокром способе растворы наносили на стеклянную подложку и выдерживали на воздухе в течение суток для формования структуры пленки, после чего пленку на подложке погружали в осадитель (вода). При мокром способе формования раствор на подложке сразу погружали в воду. Сформованные пленки отмывали водой от модификатора. Полноту удаления контролировали по его отсутствию в промывных водах (упаривание пробы на стекле) и на ионы хлора по реакции с азотнокислым серебром. Отмытые пленки сушили на воздухе с фиксацией, затем определяли деформационно-прочностные свойства и пористость по скорости фильтрации воды сквозь пленку.

Формование хитозановых пленок из 3% растворов в 2% уксусной кислоте осуществляли по сухому способу: раствор наносили на стеклянную подложку через щелевидную фильеру и сушили на воздухе, а затем прогревали при 120°С в течение 30 мин.

Механические характеристики пленок определяли в режиме одноосного растяжения на образцах в виде полос шириной 2 мм с длиной рабочей части 20 мм. Испытания проводились на универсальной установке для механических испытаний UTS 10 (UTStestsysteme, Германия). Растяжение образцов проводилось со скоростью 20 мм/мин. В процессе испытаний регистрировалась диаграмма растяжения образца; по результатам испытаний определяли модуль упругости Е, прочность ст , разрывную деформацию s и предел пластичности стп.

Тестирование образцов пленок на пригодность в качестве матриц для культивирования клеток проводили по следующей методике: шаблоны, приготовленные из образцов, стерилизовали автоклавированием под давлением 1 атм. при 120°С в течение 40 мин., дополнительно отмывали физиологическим солевым раствором без ионов Са и Mg от полимерных добавок. На каждый из образцов пленки высевали нормальные дер-мальные фибробласты человека с концентрацией 2x104 клеток/см2. Контролем служили фибробласты из той же клеточной популяции, посеянные на стандартные пластиковые чашки Петри. При культивировании клеток использовали питательную среду ДМЕМ (ICN, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (HyClone, США). Через сутки и 5 сут. культивирования производили оценку состояния культур с помощью светового микроскопа Биолам П-2 СПОМО, Россия) с фотонасадкой

x

x

Результаты и обсуждение

Предварительные исследования образцов хитина различного происхождения на цитотоксичность обнаружили, что промышленные образцы хитина непригодны для культивирования фибробластов. В связи с этим

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009

Оригинальные исследования

была проведена тщательная очистка образцов хитина и хитозана от примесей белковой, липидной и минеральной природы. Испытания очищенных образцов хитина на цитотоксичность по отношению к фибробластам и кератиноцитам показали, что принятая нами методика очистки удаляет все токсичные примеси. Клетки адге-зируют и распластываются на хитине, а затем пролиферируют со скоростью сходной с контролем.

Согласно литературным данным влияние степени дезацетилирования (СД) хитозана на прикрепление клеток к матрице и их пролиферацию весьма существенно. Чем выше СД хитозановой матрицы, тем больше клеток к ней прикрепляется, но для роста клеток благоприятнее низкие СД [2]. К такому же выводу пришли авторы работы [5], отмечая зависимость адгезии клеток на хитозановых пленках. Фибробласты прикрепляются вдвое легче, чем кератиноциты, но пролиферация ке-ратиноцитов увеличивается с увеличением СД, в то время как фибробласты не размножаются на хитозановых пленках, хотя и остаются живыми. Противоположное заключение дано в работе [6]: хитозан с высокой СД сильно стимулирует рост фибробластов, а при низких СД проявляет низкую активность. Отмечено также, что кератиноциты замедляют рост на высоко дезацетилиро-ванном хитозане. Все приведенные данные показывают, что изменяя СД можно модулировать митогенезис клеток кожи человека in vitro.

Большое значение для адгезии клеток имеет пористость матрицы и топография ее поверхности. В работе [7] показано, что клетки хорошо прикрепляются и пролиферируют на матрицах с диаметром пор 15^100 мкм и при шероховатой поверхности.

\

N \ '( Л

А ж 1 m

Культура фибробластов, выращенная на пленках, изготовленных из различных материалов:

А - контроль: хорошо распластанные клетки, сформировавшие за 5 сут. культивирования сплошной монослой; Б - прогретая хитозановая пленка: хорошо распластанные клетки с характерной для фибробластов морфологией, образующие почти полный монослой за 5 сут. культивирования; В - пленка из частично дезацетилированного хитина [СД 029]: хорошо распластанные клетки с характерной для фибробластов морфологией, образующие почти полный монослой за 5 сут. культивирования; Г - пленка из частично дезацетилированного хитина [СД 0.12} с добавлением 0,5% поливинилового спирта: клетки не распластались и погибли

В связи с этим нами были получены образцы частично дезацетилированного хитина (см. табл.1) и сформованы хитиновые пленки с различной пористостью, для чего в растворы хитина вводили нетоксичные добавки водорастворимый эфир целлюлозы ГОЭЦ, ПВС или ПВП, которые вымывали водой после высушивания пленок. Надмолекулярная структура пленок в значительной степени определяется структурой раствора, которая в свою очередь зависит от взаимодействия растворенных компонентов. В связи с этим была изучена реология формовочных растворов при 298 и 308°К, содержащих хитин и порообразующие добавки, получены кривые течения, представленные на рис. и рассчитаны степень структурирования и Еа-энергия активации вязкого течения (табл. 2).

Таблица 2. Характеристика 3% растворов смесей

хитина с ПВП и ГОЭЦ

Состав раствора Степень структурирования, % Еа- КДж/моль

Хитин 60,2 46,6

ХИН - 2,5% ПВП 38,3 34,8

ХИН -10% ПВП 39,7 38,3

ХИН - 2,5% ГОЭЦ 51,0 38,3

ХИН - 10% ГОЭЦ 41,1 34,8

Наибольшие значения степени структурирования и Еа имеет раствор хитина, введение ГОЭЦ снижает обе эти характеристики тем в большей степени, чем выше концентрация модификатора. Это означает, что введение добавки нарушает собственную структуру раствора хитина и создает новую общую структуру раствора, что связано с родством химической природы хитина и целлюлозы. Иначе проявляет себя добавка ПВП — 2,5% концентрация ПВП оказывает более сильное влияние, чем 10%. В этом случае ПВП, нарушая структуру раствора хитина при меньшей концентрации, по-видимому, создает собственную фазу при 10% концентрации.

Анализ данных по физико-механическим свойствам полученных пленок показывает (табл. 3 и 4), что при сухо-мокром формовании получены более прочные, но менее эластичные пленки, чем при мокром способе. Влияние концентрации модификатора проявляется только при сухо-мокром способе, причем при большем содержании модификатора пленки прочнее. Этот факт можно связать с данными по пористости пленок. Большее количество модификатора обеспечивает пленкам большую пористость, но при этом радиус пор уменьшается при обоих способах формования. Диаметр пор полученных пленок находится в диапазоне 20^140 Е.

Пленки из частично дезацетилированого хитина (см. табл.1, обр. 2 и 3) были сформованы сухо-мокрым способом при использовании в качестве порообразователя 2,5% ПВП с последующей отмывкой. Высушенные пленки были пластифицированы выдержкой в 5% растворе глицерина в воде.

Пленки, полученные мокрым формованием (см. табл. 3, обр. 5^8) были мутными, а потому состояние клеток на их поверхности нельзя было проследить визуально под инвертированным микроскопом. На образцах пленок 1—4 (см. табл. 3) фибробласты закреплялись и пролиферировали.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009

4- і ■ ■ тп

Оригинальные исследования

Таблица 3, Характеристика пористых пленок на основе хитина

№ обр. Состав раствора Пористость Толщина, мкм Скорость фильтрации, мл/мин Производительность, мл/мин. см2 Опор(Е)

Сухо-мокрое формование

1 ХИН - 2,5% ПВП 0,717 20,0 1,042 0,0969 120

2 ХИН - 10% ПВП 0,784 23,5 0,203 0,0189 55

3 ХИН - 2,5% ГОЭЦ 0,791 23,7 1,284 0,1194 138

4 ХИН - 10% ГОЭЦ 0,807 20,3 0,338 0,314 65

Мокрое формование

5 ХИН - 2,5% ПВП 0,877 25,0 0,662 0,0616 97

6 ХИН - 10% ПВП 0,870 21,0 0,044 0,0041 23

7 ХИН - 2,5% ГОЭЦ 0,896 18,0 1,166 0,1084 108

8 ХИН - 10% ГОЭЦ 0,899 18,0 0,052 0,0049 23

Пленки из растворов хитозана в кислоте, полученные методом сухого формования, прозрачны, прочны и эластичны, имеют низкую пористость.

Так как свежесформованные хитозановые пленки растворимы в воде, то для перевода их в нерастворимое состояние использована термообработка при 120°С. Происходящие при этом изменения — связывание уксусной кислоты, образование иминных связей, возникновение межмолекулярных сшивок приводят к уменьшению количества свободных аминогрупп, при этом физико-механические свойства пленок не ухудшаются [8].

Прогрев (табл. 5) увеличивает прочность пленок при разрыве, одновременно снижая их эластичность, что приводит к повышению жесткости пленок. Происходящее при этом уменьшение содержания аминогрупп благоприятствует закреплению и размножению клеток фиброблас-тов и кератиноцитов. За 5 сут. культивирования на этих пленках фибробласты образуют почти сплошной слой (см. рис.). Совокупные характеристики прогретых пленок свидетельствуют об их пригодности для использования в качестве матричного материала.

Тестирование пленок, сформованных из частично дезацетилированного хитина (СД 0.12, 0.19 и 0.29), показало, что с увеличением СД хитина адгезия фиб-робластов на их поверхности и пролиферация клеток улучшаются. При СД 0,29 за 5 сут. культивирования образуется почти полный монослой клеток. Однако, введение в хитиновые пленки синтетического полимера (ПВС) даже в количестве 0,5% от массы хитина, приводит лишь к частичной адгезии клеток и их гибели (см. рис.).

Выводы

1. Получены прочные и эластичные пленочные материалы на основе хитозана и частично дезацетилированного хитина, сохраняющие форму и прочность в водной среде.

2. Тестирование образцов пленок в качестве матриц для культивирования фибробластов показало, что наилучшими свойствами для адгезии и пролиферации клеток обладают термообработанные хитозановые пленки и пленки из частично дезацетилированного хитина.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009

Таблица 4. Деформационно-прочностные характеристики пористых пленок на основе хитина

А

Таблица 5, Характеристики хитозановых пленок

р. 21§ Дополнительная обработка N , амин’ % Свойства пленок

, я ШЕЕ МПа V МПа є , р’ %

1 Свежесформованная пленка 8,42 4,66 87 122 38

22 Та же пленка через 6 мес. 3,30 6,41 145 138 15

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

23 Прогрев 30 мин при 120°С _ 6,25 130 147 24

24 Прогрев 60 мин при 120°С _ 6,38 132 138 20

25 Прогрев 180 мин при 120°С 2,80 6,44 142 158 22

№ обр. Состав раствора о , МПа Р’ Єр, % Е, ГПа

Сухо-мокрое формование

Хитин 79 6,9 3,2

1 ХИН - 2,5% ПВП 74 16,0 1,79

2 ХИН - 10% ПВП 95 12,1 1,60

3 ХИН2-22,5%2ГОЭЦ 42 5,2 1,45

4 ХИН - 10% ГОЭЦ 73 6,4 3,16

Мокрое формование

Хитин 79 20,6 3,1

5 ХИН - 2,5% ПВП 44 7,5 1,3

6 ХИН - 10% ПВП 44 22,0 1,3

7 ХИН - 2,5% ГОЭЦ 30 40,0 1,0

8 ХИН - 10% ГОЭЦ 39 29,0 1,2

45

■ ИМИ!

Оригинальные исследования

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине», проект «Создание новых рассасывающихся матричных

ЛИТЕРАТУРА:

1. Жоголев К.Д., Никитин В.(О., Буланьков Ю.И. Изучение влияния препаратов хитина и хитозана на течение раневого процесса. Материалы конф. «Актуальные проблемы гнойно-септических инфекций» СПб. 1996: 36-7.

2. Жоголев К.Д., Никитин В.(О., Цыган В.Н. Препараты на основе хитина и хитозана в медицине и рациональном питании. Мед. иммунология 2001; 3[2): 316—7.

3. Shigemasa A., Minami S. Использование хитина и хитозана в медицине. Кобунси како 1997; 46С2): 27—33.

4. Terbojevich М., Corrado С., Cosani A., Marsano Е. Solution studies the chitin — lithium chloride — l\l,l\l-dimethylacetamide system. Carbohydr. Res. 1988; 180: 73-86.

Поступила 08.112008

материалов на основе природных полисахаридов для культивирования клеток кожи человека и трансплантации при заживлении ран».

5. Chatelet С., Damour О., Domard A. Influence of the degree of acetylation on some biological properties of chitosan films. Biomater. 2DD1; 22: 261-8.

6. Howling G.I., Dettmar P.W., Goddard P.A. et al. The effect of chitin and chitosan on the proliferation of human skin fibroblasts and keratinocytes in vitro. Biomater. 2001; 22: 2959—66.

7. Ma J., Wang H., He B., Chen J. A preminary in vitro study on the fabrication and tissue engineering application of a novel chitosan bilayer material as a scaffold of human neofetal dermal fibroblasts. Biomater. 2001; 22: 331-6.

8. Зоткин M.A., Вихорева Г.А., Качекьян A.C. Термомодификация хитозановых пленок в форме солей с различными кислотами. Высокомол. соед. 2004; 46АС2): 359—63.

■ ИМИ!

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 3, 2009

А

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.