CC BY
31
УДК 618.145-02:612.015.13
матриксные металлопротеинзы 14 и 17 как факторы ревасуляризации
при аденомиозе
Е.В. Ткачева1, М.З. Горелик2, И.В. Дюйзен1
1 Тихоокеанский государственный медицинский университет (690950, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2),
2 Приморское краевое патологоанатомическое бюро (690002, г. Владивосток, пр-т Острякова, 4)
Ключевые слова: внутренний эндометриоз, матка, протеолитические ферменты, шкала иммунореактивности.
MATRIx METALLOPROTEINAsEs 14 AND 17 As FACTORs of revascularization in adenomyosis
E.V. Tkachyova1, M.Z. Gorelik2, I.V. Dyuizen1 1 Pacific State Medical University (2 Ostryakova Ave. Vladivostok 690950 Russian Federation), 2 Primorsky Regional Patho-anatomical Department (4 Ostryakova Ave. Vladivostok 690002 Russian Federation)
Background. The localization of matrix metalloproteinases (MMPs) 14 and 17 was studied in eutopic en-dometrial tissue of women with internal endometriosis.
Methods. The study included 20 women of childbearing age suffering from dysfunctional uterine bleeding and infertility. The control group consisted of patients with no signs of endometriosis, who had a history of pregnancy. The endometrial biopsy was detected the presence and location of MMP14 and MMR17 by immunohis-tochemistry.
Results. All women with endometriosis diagnosed glandular endometrial hyperplasia and tissue changes observed selective localization and activity of MMP14 and MMR17. In the endometrial stroma adenomy-osis was a growing activity of MMP14 in the wall of blood vessels and MMP14 expressed MMR17, and in the cells of uterine glands appearing not peculiar stage of the cycle MMR17. Conclusions. Eutopic endometrial tissue of women with adenomyosis are characterized by changing the profile of activity of some MMPs. Together, these changes may disrupt the support and signaling proper-ties of the fabric, creating favorable conditions for endometrioid heterotopia.
Keywords: internal endometriosis, uterus, proteolytic enzymes, immunoreactive scale.
Pacific Medical Journal, 2015, No. 2, p. 69-73.
Основные морфологические и функциональные процессы в женской половой системе (циклические изменения яичников и матки, имплантация плодного яйца, развитие плодных оболочек) протекают при прямом участии протеолитических ферментов межклеточного матрикса - матриксных металлопротеиназ (Matrix Metalloproteinases - MMPs) [4]. Их набор имеет высокую тканевую специфичность, что определяется типом белкового субстрата, а также клеточным составом ткани, где происходит синтез, секреция и инактивация этих ферментов. Нарушение баланса между процессами образования и деградации MMPs, а также появление в ткани новых, несвойственных ей матрикс-ных протеолитических белков часто ассоциируется с глубокой структурной патологией. С дисбалансом в тканевом наборе и биохимической активности MMPs связывают, в частности, развитие таких заболеваний, как эндометриоз, аденокарцинома эндометрия, миома матки и др. [2, 7, 8]. Выявление клеточной локализации,
Ткачева Елена Владимировна - канд. мед. наук, ассистент кафедры акушерства и гинекологии ТГМУ; e-mail: [email protected]
распространенности, активности и набора ММР и их ингибиторов в тканях женских половых органов, по мнению ряда авторов, может являться дополнительным морфохимическим критерием уточнения глубины и стадии ряда патологических процессов и выбора адекватной лечебной тактики [1, 14].
В большинство современных работ, посвященных исследованию активности ММРs при аденомиозе, описывается их протеолитическая активность в тех участках ткани, где морфологические изменения максимально выражены, в частности - в гетеротопи-ческих узлах эндометриоидной ткани [2, 13]. Вместе с тем существует предположение, что риск эктопии эндометрия во многом определяется морфохимичес-кими особенностями самой ткани и может зависеть от протеолитических свойств ферментов межклеточного матрикса и их способности разрушать окружающие структуры [2, 9]. В этой связи выявление дисбаланса в активности ММРs в участках миометрия с начальными признаками заболевания может не только помочь в ранней диагностике, но и приблизить к пониманию фундаментальных механизмов данной патологии. В настоящей работе изучена локализация некоторых типов MMPs (14 и 17) в тканях эутопического эндометрия женщин с внутренним эндометриозом.
Материал и методы. Работа выполнена на базе отделения гинекологии и эндоскопической хирургии Краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи (г. Владивосток). Объектом исследований послужили 20 женщин фертильного возраста (32,8±4,9 года), обратившихся по поводу дисфункциональных маточных кровотечений и бесплодия. Внутренний эндометриоз был диагностирован при проведении гистероскопии и ультразвукового исследования. Контрольную группу составили 18 пациенток сопоставимого возраста (34,0±5,3 года) без признаков эндометриоза, имевшие беременности в анамнезе.
Обследование проводилось в рамках комплексной подготовки к экстракорпоральному оплодотворению. Женщины обеих групп не получали противовоспалительного и гормонального лечения за 6 месяцев до хирургического вмешательства. Пациентки были осведомлены о проводимом исследовании, от каждой из них получено информированное согласие, все лабораторные данные зафиксированы в их историях болезни.
Лабораторные методы включали исследование гормонального профиля в первую фазу менструального
цикла (5-7-е сутки), биохимических маркеров печени, гемостазиограммы. Уровень гормонов в сыворотке крови и биохимические показатели были в пределах нормы за исключением 5 пациенток из контрольной группы с избыточной массой тела: у них диагностирована относительная гиперэстрогения. В гемостазио-граммах патологии не выявлено.
Забор материала для гистологического и иммуногис-тохимического исследования (биопсия или выскабливание слизистой оболочки матки) был осуществлен в фазу ранней пролиферации (5-10-й день менструального цикла). Биопсия выполнялась стерильной пайпель-кю-реткой (Unimar Inc., Prodimed, Neuilly-en-Thelle, France). Цуг эндометрия у женщин с эндометриозом забирался кюреткой № 2 в условиях операционной под внутривенным обезболиванием и контролем гистероскопии. Для последующего анализа прицельно отбирались образцы ткани, расположенные в зоне максимально выраженных патологических изменений. Материал был зафиксирован в растворе 4% забуференного параформальдегида при температуре 4 °С и после 5-6-кратной промывки в 50мМ фосфатном буфере (рН 7,2) заливался в парафин по общепринятой методике.
Для иммунопероксидазной реакции использованы первичные антитела против MMP14 (rabbit polyclonal, ab53712, Abcam, 1:100) и MMP17 (rabbit monoclonal, ab51075, Abcam, 1:100). Иммуногистохимическая реакция проводилась на парафиновых срезах толщиной 10 мкм согласно стандартной методике. Использовались видо-специфические биотинилированные вторичные антитела, стрептавидин-пероксидаза (Thermo Scientific) и хромоген (Peroxidase Substrate Kit, Vector NovaRED, SK-4800). Количественная оценка оптической плотности преципитата реакции осуществлялась на срезах без последующего докрашивания. Для анализа морфологических изменений тканей и подсчета числа иммунопозитивных элементов некоторые «параллельные» препараты после обработки хромогеном докрашивались гематоксилином и эозином.
Для оценки тканевого распределения и активности иммунопероксидазной реакции использовали методы количественного и полуколичественного анализа. Об уровне активности ферментов в образцах эндометрия судили по абсолютному и относительному количеству ММР-позитивных клеток в тканевых структурах и оптической плотности продукта иммуногистохимической реакции. Подсчет клеток выполнялся на каждом срезе в 10 неперекрывающихся полях зрения при 400-кратном увеличении. Плотность преципитата определяли с использованием программы ImageJ 4.0 после получения изображения с помощью камеры AxioCam ICc3 Rev.3 (Carl Zeiss) на срезах, не докрашенных гематоксилином и эозином.
Для сравнительной оценки изменений активности ферментов при железистой гиперплазии использовали метод полуколичественного анализа на основе так называемой шкалы иммунореактивности (ШИ) [1, 13]. Для этого первоначально ранжировали образцы по
процентному содержанию иммунопозитивных клеток на 5 групп (от 0 до 4). В группу 4 включали образцы, в которых количество таких клеток было более 80% от общей клеточной популяции, в группу 3 - от 51 до 80%, в группу 2 - от 10 до 50%, в группу 1 - меньше 10% и в группу 0 - образцы, несодержавшие продукта иммуногистохимической реакции. Сходным образом ранжировались показатели оптической плотности преципитата с выделением 3 групп: группа 1 - слабо окрашенные (меньше 20 ЕОП), группа 2 - умеренно окрашенные (21-50 ЕОП) и группа 3 - интенсивно окрашенные (более 50 ЕОП). В дальнейшем для каждого образца показатели количества окрашиваемых клеток умножали на показатели плотности продукта реакции, получая показатели иммунореактивности по ШИ.
Результаты исследования. У 6 пациенток с признаками аденомиоза выявлена простая, у 14 - сложная железистая гиперплазия эндометрия. У всех женщин группы контроля диагностирован хронический эндометрит в стадии ремиссии.
У женщин без признаков аденомиоза наблюдалось очаговое распределение ММР14 (с минимальной активностью) в стромальных клетках. Наряду с участками, полностью лишенными иммуноцитохими-ческого окрашивая, в одном и том же образце ткани встречаются группы более интенсивно окрашенных клеток. В последнем случае фермент демонстрировал мелкозернистое расположение в цитоплазме или локализовался в субмембранной зоне. Во всех случаях эпителиоциты маточных желез и сосуды метку не содержали (рис., а).
При эндометриоидном повреждении матки признаки активации фермента проявлялись его экспрессией, в первую очередь - в эндотелии артерий (рис., б). Такое распределение фермента было характерно для эндометрия с признаками простой гиперплазии. В случае развития сложной железистой гиперплазии при адено-миозе продукт иммуногистохимической реакции регистрировался не только в интиме сосудов, но и в эпи-телиоцитах желез и единичных клетках стромы.
В соответствии с данными ШИ (табл.), экспрессия ММР14 была наиболее выражена в элементах микроциркуляторного русла и прямо коррелировала с выраженностью патоморфологического процесса в эутопическом эндометрии.
Таблица
Динамика активности ММР14 и ММР17 в клеточных элементах эндометрия женщин при развитии аденомиоза
Баллы по ШИ
ММР14 ММР17
Состояние эндометрия железы строма сосуды железы строма сосуды
Простая гиперплазия 0 0,5 1,25 1,25 2,00 2,75
Сложная гиперплазия 0,40 1,20 0,80 1,20 1,80 2,00
Контроль 0 2,00 0 0 0 0
и
ш
то
ш9тт »"су к «в* .
•_
ШШк4 ¿Ф^Щ; чей А
ьЛ2* л 'лтШ \» л¿ЯРьчъ^ш13
■^НИКНЯ
г_■
Рис. Локализация ММРб в эутопическом эндометрии:
а - ММР14, контроль; б - ММР14, эндометриоз; в - ММР17, контроль; г - ММР17, эндометриоз. Масштаб: а, б - 50 мкм, в, г - 100 мкм. Иммуно-позитивные клетки отмечены стрелками (пояснения в тексте).
В эндометрии здоровых женщин окраска на ММР17 полностью отсутствовала (рис., в). В образцах гиперпластичного эндометрия женщин с аденомиозом наибольшую активность этой иммуногистохимичес-кой реакции демонстрировали спиральные артерии базального слоя, где фермент локализовался в клетках интимы (рис., г). О высокой активности фермента в эндотелии свидетельствует тот факт, что 40,6% эндоте-лиоцитов содержали ММР17. Зачастую, в стромальной ткани встречались экстраклеточные скопления гранул иммунопозитивного материала. Такое распределение может быть характерно для дегранулировавших тучных клеток, в ряде случаев такие ММР17-позитивные гранулярные комплексы располагались вблизи от кровеносных сосудов.
Эпителиальный компонент эндометрия характеризовался весьма неоднородным распределением фермента: профили рядом расположенных желез могли значительно отличаться по его наличию и активности. Ряд желез не содержал фермента вообще, в то же время встречались железы, содержавшие большое число ММР17-позитивных эпителиоцитов (здесь до 36,7%).
В гландулоцитах фермент имел исключительно субмембранное расположение в клетках призматической формы. Отчетливых различий в активности ММР17 у женщин с простой и сложной гиперплазией эутопи-ческого эндометрия не обнаружено. При этом, несмотря на неоднородную активность фермента в пределах одного среза, общая иммунореактивность органа при развитии гиперплазии значительно повышалась, причем во всех клеточных элементах - железах, строме и сосудах (табл.).
Обсуждение полученных данных. Таким образом, иммуногистохимическая активность ферментов межклеточного матрикса в эутопическом эндометрии женщин с аденомиозом имела значительные количественные и качественные отличия от эндометрия женщин контрольной группы. Это свидетельствует о том, что развитию заболевания может способствовать повышенная протеолитическая активность эутопического эндометрия.
До настоящего времени вопрос о ранней диагностике аденомиоза остается открытым и является предметом активного исследования многих отечественных
и зарубежных авторов. Причина формирования эн-дометриальных гетеротопий не в полной мере может быть объяснена существующими трактовками патогенеза заболевания - теории ретроградного заброса менструальной крови, теория дисэмбрионального развития, теории гормонального и иммунологического дисбаланса и др. [9]. К настоящему времени накоплено большое число клинических и экспериментальных наблюдений, свидетельствующих о том, что возможность инвазивного роста эндометрия обусловлена свойствами самой эутопической ткани и в первую очередь - активностью протеолитических ферментов ее межклеточного матрикса.
Данные проведенного нами исследования свидетельствуют о том, что эта теория не лишена основания. Показано, что эутопический эндометрий женщин с диагностированным аденомиозом характеризуется рядом признаков, отличающих его от эндометрия здоровых женщин в сходной стадии овариально-менс-труального цикла (фаза ранней пролиферации).
В настоящем исследовании изучалась локализация ферментов межклеточного матрикса (ММР14 и ММР17), имеющих, по данным литературы, большой ангиогенный потенциал в условиях физиологического или репаративного морфогенеза, а также при опухолевом росте [5, 7, 8, 12].
Мембранносвязанный фермент ММР14 в образцах эндометрия, полученных от пациенток с аденомиозом, демонстрировал отчетливую активацию в элементах сосудистого русла на фоне снижения активности в стромальных клетках. К настоящему времени данные о функциях этого вещества в женских половых органах достаточно немногочисленны [11]. Известно, что вы-сокоскоординированные во времени и пространстве взаимодействия ММР14 с другими типами матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов имеют принципиальное значение для успешного пре- и постнатального органогенеза, репарации и регенерации [3]. Деятельность этого протеина тесно связана с активностью другой матриксной металлопротеиназы - ММР2 -которая в свою очередь считается одним из важнейших факторов инвазии при любом пролиферативном процессе [10].
Известно, что посредником ММР14 в обеспечении роста сосудов является сосудистый эндотелиальный фактор роста, экспрессия которого повышается в присутствии этой протеиназы [15]. В настоящей работе показано, что локализация ММР14 в эндометрии соответствует месту расположения и образования элементов кровеносного русла в его функциональном слое. Можно предполагать, что активация данного фермента при развитии патологического процесса в эндометрии может отвечать за трофическое обеспечение растущей ткани за счет усиления ее кровоснабжения.
Высокую экспрессию в сосудах эндометрия при аденомиозе продемонстрировал в нашем исследовании и другой мембранно-связанный протеин - ММР17, -активность которого также связывают с усилением
ангиогенеза и оптимизацией кровотока при гиперпла-зиях и дисплазиях различных тканей [5]. В отличие от ММР14 его сигнальные эффекты не зависят от других типов матриксных металлопротеиназ, а опосредованы цитокинами [6]. Вместе с тем при внутреннем эндо-метриозе, как показано в нашем исследовании, локализация и активность данного фермента приурочена не только к элементам сосудистого русла, но также наблюдается в гландулоцитах и стромальных клетках. В этой связи нельзя исключать сигнальную роль ММР17 в регуляции пролиферации функционального слоя эндометрия.
Таким образом, ткани эутопического эндометрия у женщин с аденомиозом характеризуются измененным профилем активности некоторых MMPs. Ряд проведенных ранее исследований показал, что развитию данной патологии могут способствовать некоторые протеиназы, секретируемые клетками маточных желез, интерстициальными фибробластоподобными клетками, а также макрофагами и моноцитами крови - ММР2, ММР9 [2, 10, 12]. В настоящей работе было установлено, что MMPs, секретируемые элементами сосудистой стенки, могут иметь важное патогенетическое значение в развитии данной патологии. Наряду с гормон- и цитокин-опосредованными изменениями в пролиферативной активности клеточных элементов, ферменты межклеточного матрикса также могут изменять опорные и сигнальные свойства ткани, создавая благоприятные предпосылки для развития эндомет-риоидной гетеротопии. Литература
1. Коган Е.А., Унанян А.Л., Демура Т.А. [и др.] Клинико-морфо-логические параллели и молекулярные аспекты аденомиоза // Архив патологии. 2008. № 5. С. 8-12.
2. Collette T., Bellehumeur C., Kats R. [et al.] Evidence for an increased release of proteolytic activity by the eutopic endometrial tissue in women with endometriosisand for involvement of matrix metalloproteinase-9 // Human Reproduction. 2004. Vol. 19, No. 6. Р. 1257-1264.
3. Coyle R.C., Latimer A., Jessen J.R. Membrane-type 1 matrix met-alloproteinase regulates cell migration during zebrafish gastrula-tion: Evidence for an interaction with non-canonical Wnt signaling // Experimental cell research. 2008. No. 314. Р. 2150-2162.
4. Curry J.T.E., Osteen K.G. Cyclic changes in the matrix metal-loproteinase system in the ovary and uterus // Biology of Reproduction. 2001. No. 64. Р. 1285-1296.
5. Egeblad M., Werb Z. New functions for the matrix metallopro-teinases in cancer progression // Nat Rev Cancer. 2002. No. 2. Р. 161-174.
6. English William R., Xose S., Jose M.P. [et al.] Membrane type 4 matrix metalloproteinase (MMP17) has tumor necrosis factor-a convertase activity but does not activate pro-MMP2 // The Journal of Biological Chemistry. 2000. Vol. 275, No. 19. Р. 14046-14055.
7. Freitas S., Meduri G., Le Nestour E. Expression of metallopro-teinases and their inhibitors in blood vessels in human endometrium // Biology of Reproduction. 1999. No. 61. Р. 1070-1082.
8. Gilabert-Estelle J., Estelle A., Gilabert J. Expression of several components of the plasminogen activator and matrix metalloproteinase systems in endometriosis // Human Reproduction. 2003. Vol. 18, No. 7. Р. 1516-1522.
9. Giudice L.C, Tazuke S.I., Swiersz L. Status of current research on endometriosis // Journal Reprod Me. 1998. No. 43. Р. 252-262.
