Материалы i российско-германского симпозиума «Иммунобиология туберкулеза» Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская Иммунология 2003, Т.5, №3-4 © 2003, СПб РО РААКИ

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОСПРИИМЧИВОСТИ К ТУБЕРКУЛЕЗУ И ЕГО ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

АптА.С.. РадаеваТ.В.. Никоненко Б.В., Лядова И.В., Ерусланов Е.Б., Орлова М.О., Майоров К.Б., Кондратьева Т.К.

Лаборатория иммуногенетики ЦНИИ Туберкулеза РАМН, Москва

Восприимчивость к М. tuberculosis и тяжесть течения туберкулезного процесса находятся под контролем локу-сов с количественной фенотипической экспрессией (quantitative trait loci - QTL). У инбредных мышей линий I/St и A/Sn заражение микобактериями рриводит, соответственно, к тяжелому й умеренному течению заболевания. Мы провели в мышах ВС1 (I/St х A/Sn) х I/St и F2(I/St х A/Sn) геномный скрининг на сцепление двух признаков, сроков выживания (СВ) и темпа потери веса после заражения (ТПВ), с маркерами- микросателлитами. Один из QTL был картирован в дистальном участке длиной 12 сМ хромосомы 3 и обозначен tbsl (tuberculosis severity 1), другой QTL, tbs2, расположен в интервале 9 сМ в проксимальной части хромосомы 9, третий QTL расположен в пределах комплекса Н-2 в хромосоме 17. Различия между аллельными вариантами tbsl и tbs2 проявляются только у самок, причем первый влияет только на ТПВ, а второй - как на ТПВ, так и на СВ. При этом в Х-хромосоме удается картировать ген-модификатор, но прямое сцепление с полом не подтверждается. QTL в комплексе Н-2 участвует в контроле туберкулезного процесса у животных обоего пола. У самок гетерозиготных по tbsl и tbs2 ниже ТПВ и длиннее СВ, чем у любой из двух гомозигот, то есть отчетливо проявляется преимущество гетерозигот. Все три локуса проявляют выраженное эпи-статическое взаимодействие.

На фенотипическом уровне межлинейные различия между мышами I/St и A/Sn проявляются в характере иммунного ответа и воспаления в легочной ткани. В легких резистентных мышей A/Sn и F1 происходит стабилизация роста микобактерий, совпадающая по времени с развитием специфического Т-клеточного ответа. В легких мышей чувствительной линии I/St, несмотря на успешную активацию Т-клеток, размножение микобактерий нарастает вплоть до момента гибели животных. Прогрессирование инфекции в легких мышей I/St, но не A/Sn и F1, сопровождается интенсивной инфильтрацией нейт-рофилами и лимфоцитами CD4+ и CD8+. Легочные макрофаги мышей I/St гораздо более чувствительны к цито-патическому действию микобактерий in vitro по сравнению с макрофагами мышей A/Sn и F1, тогда как макрофаги мышей A/Sn продуцируют больше азотных радикалов и сильнее подавляют рост микобактерий. Макрофаги легких здоровых мышей неспособны усиливать микобак-терицидную активность в ответ на стимуляцию IFN-y. Напротив, через 3 недели после заражения макрофаги всех мышей приобретают способность отвечать на активирующее действие IFN-y, но на этой стадии его продукция клетками легкого у мышей I/St в 10 раз ниже, чем у мышей A/Sn.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ В ДИАГНОСТИКЕ СИЛИКОТУБЕРКУЛЕЗА

Бородулин Б.Е.

Самарский государственный медицинский университет, г. Самара, Россия

Пневмокониозы являются медико-биологическими факторами повышенного риска заболевания туберкулезом легких, что приводит к формированию кониотуберку-леза. Целью данной работы является определение критериев прогнозирования развития туберкулеза при силикозе.Проведены комплексные клиническо-иммунологичес-кие исследования у 40 больных силикозом, 40 пациентов с установленным диагнозом силикотуберкулез. (очаговой форме туберкулезных изменений), 44 человека с впервые установленным диагнозом очаговый туберкулез легких, 64 здоровых человека без признаков поражения иммунной системы - контрольная. Обследование включало в себя стандартное клинико-рентгенологическое. Оценка функции внешнего дыхания проводилась путем анализа кривой поток-объем. Иммунологические методы исследования включали определение субпопуляций лимфоцитов с помощью моноклональных антител, содержание иммуноглобулинов А, М, G, уровни циркулирующих иммунных комплексов, уровни лизоцима, 3EG5, концентрацию общего IgE в сыворотке. В обработке полученных результатов использованы новейшие методы статистической обработки: дискриптивная статистика, дискриминантный и факторный анализ.Использование традиционных методов клинического исследования не позволили своевременно диагностировать присоединение туберкулеза к силикозу и выделить значимые критерии в развитии силикотуберкулеза.

У пациентов с силикозом отмечено повышение уровней общего IgE, муцинового антигена 3EG5, фибронекти-на и натуральных киллеров; снижение содержания лимфоцитов и их основных субпопуляций - клеток, экспрессирующих CD3 , CD4 , CD20 маркеры, активированных HLA-DR лимфоцитов, соотношения CD4 /CD8 клеток, а также фагоцитарной активности лейкоцитов и активности комплемента по сравнению с контрольной группой.

У больных силикотуберкулезом анализ показателей дескриптивной статистики выявил снижение следующих параметров иммунного гомеостаза: IgM, IgA, лимфоцитов, клеток, экспрессирующих CD16 маркер, HLA-DR лимфоцитов, активности комплемента, лизоцима, фагоцитарной активности лейкоцитов. По сравнению с контрольной группой были повышены уровни общего IgE, муцинового антигена 3EG5, фибронектина, лейкоцитов, Т- и В-лимфоцитов (клеток, экспрессирующих соответственно CD3 и CD20 маркеры).

При обследовании больных с очаговой формой туберкулезного процесса нами были выявлены следующие особенности. Были повышены уровни лейкоцитов, общего IgE, муцинового антигена 3EG5, фибронектина (максимальное значение из всех групп обследованных), отмечалась активация гуморального иммунитета - повышены

концетрации IgA и IgG в сыворотке и содержание клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD20 маркер. При этом уровни лизоцима, комплемента, фагоцитарной активности лейкоцитов, а также HLA-DR лимфоцитов, клеток, экспрессирующих CD4 , CD16 маркеры, были сниженными по сравнению с контрольной группой.

Руководствуясь результатами проведенного факторного и дискриминантного анализов нами выделены наиболее значимые факторы иммунного гомеостаза при си-ликотуберкулезе. Основными признаками возможного развития специфической инфекции при силикозе являются повышение уровней общего IgE и IgG, фибронектина, а также клеток, экспрессирующих CD4 и CD20 маркеры; снижение концентрации муцинового антигена 3EG5.

По полученным данным была разработана дискриминантная модель описанных выше типов иммунного статуса и создана формула для прогнозирования осложнений.

МОДИФИКАЦИЯ МИКРОБНОГО И АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЖИТЕЛЕЙ ЧЕРНОБЫЛЬСКОГО РЕГИОНА БЕЛАРУСИ

Борткевич Л.Г., Лавор З.В., Позднякова А.С., Кривошеева Ж.И., Сапунова Т.А., Пашкова О.Л., Сагальчик Е.Р, Бадыгина Н.А.

00 Белорусский зеленый крест,

НИИ пульмонологии и фтизиатрии М3,

Минск, Беларусь

Более 2 млн. жителей Беларуси подвергаются воздействию радиоизотопов, выброшенных в окружающую среду в результате Чернобыльской аварии. При этом 15-25% от общего количества инкорпорированных радионуклидов поступает в организм ингаляционным путем. Это обстоятельство является ведущей причиной повышения заболеваемости туберкулезом легких (ТЛ):61.5/100т. в Гомельской области при 45/100т. по стране) среди жителей Чернобыльского региона. Обнаружены признаки па-томорфоза заболевания, основные проявления которого характеризуются изменением клинических симптомов. Такие осложнения, как казеозная пневмония, туберкулез бронхов, неспецифические бронхиты обнаружены в группе облученных лиц значительно чаще, а именно в 18%, 42,1,42,1% в сравнении с 9,8,33,3,31,5% соответственно). У детей из Чернобыльской зоны для легочного туберкулеза характерно более частым обострением болезни (35,8% в сравнении с 16,7% в контрольной группе) и признаки интоксикации (повышение температуры, астения, анорексия). У подавляющего числа больных этой группы обнаружены достоверные различия уровней изменений гемограммы; нейтрофилии, эозинофилии, лейкоцитоза, эрит-ро- и моноцитопении. Клеточный состав лаважа пациентов характеризовался выраженным дисбалансом моно- и полинуклеаров: нейтрофильно-макрофагальный индекс в 1,9 раз превышал таковой у необлученных больных ТЛ. Важнейшей причиной формирования атипичного воспалительного процесса в патогенезе ТЛ у облученного контингента является повышение локальной активации альвеолярных макрофагов и эпителиальных клеток и, как следствие, возрастание продукции и концентрации в очаге и в бронхиальном секрете провоспалительных цитоки-нов, а именно: TNF-ot, IL-1, IL-6, IL-8. Концентрации

TNF-a в плазме крови и лаважной жидкости облученных больных ТЛ составили 420 и 320 пг/мл в сравнении с 30 и 145 пг/мл в группе сравнения. Кроме того, отмечено формирование механизмов комплементзависимого воспаления: возрастание концентрации IgM, IgGl, IgG3, СЗ. Третий механизм, модифицирующий воспалительный процесс в легочной ткани в присутствии инкорпорированных радионуклидов, это нарушение иммунорегуляции в направлении синтеза элементов атопического воспаления. Концентрация IL-4 в лаважной жидкости превышала таковую у больных группы сравнения в 3,4 раза, IgE в 2,2 раза. В эксперименте in vitro показана способность минимальных концентраций Csl37 стимулировать в культуре клеток цельной крови здоровых необлученных доноров синтез провоспалительных цитокинов моноцитами, IgG4, IgE плазматическими клетками и IL-4 Тх2 - лимфоцитами, предварительно стимулированными специфическими микобактериальными антигенами. Т.о., инкорпорированные в легочной ткани радионуклиды способны модифицировать процесс воспаления, вызванный микобактериями туберкулеза, в виде активации синтеза провоспалительных цитокинов, вовлечения комплементза-висимой воспалительной реакции и формирования атопической аллергии in loco.

ЛЕКАРСТВЕННО-УСТОЙЧИВЫЙ ТУБЕРКУЛЁЗ ЛЕГКИХ: ПРОБЛЕМЫ ХИМИОТЕРАПИИ

Васильева И. А.

ГУ Центральный научно-исследовательский институт туберкулёза РАМН, Москва, Россия

Цель исследования: изучение зависимости эффективной химиотерапии туберкулеза легких от спектра лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза (МБТ) у больных .Под нашим наблюдением находилось 164 ранее леченных больных туберкулезом легких. Из них 158 (94,9%) больных выделяли МБТ, резистентные к трем и более противотуберкулезным препаратам, при этом множественная лекарственная устойчивость (МДР) составила 84,8%

Исследование показало, что диапазон лекарственной чувствительности МБТ определял частоту и динамику исчезновения возбудителей из мокроты. Так, при лекарственной устойчивости к одному и более противотуберкулезным препаратам, кроме сочетания изониазида и ри-фампицина, абациллирование мокроты наступило у 68,5% больных после 3 месяцев химиотерапии и у 94,4% - после 6 месяцев лечения. При лекарственной устойчивости к обоим этим препаратам частота и скорость исчезновения МБТ из мокроты снижались соответственно до 11,7% и 50,7% больных.

Эффективность химиотерапии больных туберкулезом, выделявших различные по спектру лекарственной чувствительности МБТ, не зависела от генотипического варианта возбудителя: при устойчивости к одному и более химиопрепаратам, кроме сочетания изониазида и рифам-пицина, прекращение выделения штаммов семейства W отмечалось в 94,3% , семейства AI - в 100,0 % через 6 месяцев лечения; при множественной лекарственной устойчивости - в 72,9 и 73,7% соответственно через 12 месяцев .

Спектр множественной лекарственной устойчивости в значительной степени определяет эффективность противотуберкулезной химиотерапии. При лекарственной

устойчивости к трем препаратам (изониазиду, рифампи-цину и стрептомицину) бактериовыделение прекратилось у 90,5% больных после 6 месяцев и у всех 100% - после 12 месяцев лечения. При множественной лекарственной устойчивости к 5 противотуберкулезным препаратам аба-циллирование в соответствующие сроки достигнуто у 51,3 и у 78,7% больных, а при устойчивости к 6 препаратам -не наблюдалось ни в одном случае.

Частота и сроки прекращения бактериовыделения у больных МЛУ туберкулезом зависели также от режима химиотерапии. Использование комбинации 5-ти препаратов второго (резервного) ряда с самого начала интенсивной фазы химиотерапии повышает её эффективность у больных мультирезистентным туберкулезом, обеспечивая исчезновение МБТ из мокроты у 55,3% больных после 3 месяцев и у 83,0% - после 6 месяцев лечения, рассасывание инфильтративного воспаления - у 61,7 и 87,2% в эти же сроки, в то время как при стандартном режиме химиотерапии абациллирование мокроты отмечено у 9,1 и 34,1 %, инволюция специфических изменений - у 11,4 и 38,6% в соответствующие сроки.

ПРОБЛЕМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

Вишневский Б.И.

ГУ НИИ фтизиопульмонологии Минздрава РФ, Санкт-Петербург, Россия

Продолжающийся повсеместный рост лекарственной устойчивости (ЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ) является основной проблемой современной фтизиатрии. В этом отношении представляет несомненный интерес опыт мониторинга ЛУ МБТ при различных локализациях туберкулеза, ведущийся в СПбНИИФ с 1984 г., а также данные о тенденциях развития ЛУ МБТ в регионах Северо-Запада России.

На территориях Северо-Запада прежде всего обращает на себя внимание стремительный рост первичной ЛУ МБТ. За последние 10 лет в большинстве регионов первичная ЛУ увеличилась в 2-3 раза, достигая 45,5% (Архангельская обл.), 47% (Карелия), 35% (Мурманская обл.), 39,9% (Санкт-Петербург). Это чрезвычайно тревожные тенденции, тем более, что еще в середине 80-х годов первичная Л У МБТ не превышала 8-12-15%. Вторичная ЛУ МБТ, характеризующая бациллярное ядро в регионах, многие годы оставалась на уровне 50%, но за последние 10 лет также значительно возросла, превышая в большинстве регионов 70-80%.

Такие же неблагоприятные тенденции наблюдаются и по данным СПбНИИФ как при туберкулезе органов дыхания (ТОД), так и при внелегочном туберкулезе (ВЛТ).

ЛУ МБТ при ТОД в середине 80-х годов составляла 69% и за последние 2 года увеличилась до 94%. При этом произошло резкое утяжеление структуры ЛУ МБТ: монорезистентность за этот период снизилась с 26 до 4,8%, а множественная ЛУ (МЛУ), то есть резистентность по крайней мере к изониазиду и рифампицину, возросла с 42 до 59,9%.

Аналогичные тенденции развития ЛУ МБТ за этот период, и даже более быстрыми темпами, наблюдаются и при ВЛТ. Частота ЛУ МБТ возросла с 39,4 до 90%, монорезистентность в структуре ЛУ снизилась с 48,5 до 2,5%, а МЛУ увеличилась с 25 до 45,5%. Даже принимая во

внимание, что в СПбНИИФ находится на лечении наиболее тяжелый контингент больных, приведенные данные четко иллюстрируют чрезвычайно опасные тенденции развития ЛУ МБТ в настоящее время.

Современная ситуация с ЛУ МБТ обостряется еще и тем обстоятельством, что, по данным наших совместных исследований с СПбНИИЭМ им.Пастера, более половины штаммов МБТ, циркулирующих в Санкт-Петербурге и на Северо-Западе России, относятся к клональному семейству Beijing. По нашим данным, штаммы МБТ семейства Beijing в 75% являются мультирезистентными, высоко контагиозными, более вирулентными и вызывающими более тяжелое течение туберкулезного процесса, чем штаммы индивидуальных генотипов.

Все вышеизложенное свидетельствует, что для стабилизации ситуации необходимо принятие мер эпидемиологического характера для разделения потоков больных, во избежание нозокомиальной суперинфекции, а также разработка методов эффективного лечения полирезистен-тного туберкулеза.

ПРОДУКЦИЯ IFNy И ЭКСПРЕССИЯ IFNy R У БОЛЬНЫХ С ПЕРВИЧНЫМИ ИММУНОДЕФИЦИТАМИ И МИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

Галкина Е.В.. ПичугинаЛ.В.. Кондратенко И.В., ПинегинБ.В.

Российская детская клиническая больница;

НИИ Детской гематологии М3 РФ,

Институт иммунологии М3 РФ, Москва, Россия

Введение: Нарушения элиминации внутриклеточных возбудителей инфекций, в том числе микобактерий, возникают при многих формах первичных иммунодефицитов (ПИД). Наиболее ярким примером врожденной недостаточности противотуберкулезного иммунитета являются генетические дефекты рецепторов интерферона гамма IFNy и интерлейкина-12 (IL-12). Однако повышенная склонность к туберкулезу и микобактериозам встречается и при других иммунодефицитах, например Х-сцеплен-ном гипер IgM-синдроме (HIGM1) и хронической гранулематозной болезни (CGD).

Цель работы: Исследование продукции IFNy и экспрессии IFNyR у больных с HIGM1 и CGD, имевших в анамнезе микобактериальную инфекцию, или на фоне её течения.

Материалы и методы: Диагноз ПИД поставлен на основании характерных лабораторных показателей. Микобактериальная инфекция подтверждена клинически у всех больных, из них 3 имели морфологическое подтверждение и 1 - цитологическое. Экспрессию внутриклеточного IFNy и его рецепторов на активированных мононуклеарах оценивали с помощью моноклональных антител на проточном цитофлюориметре. Обследовано 5 больных: 2 с HIGM1 и 3 с ХГБ.

Основные результаты: Среди больных с CGD у одного диагностирована генерализованная микобактериальная инфекция с поражением легких и мягких тканей, у второго - генерализованная БЦЖ инфекция, у третьего

- БЦЖ-ит с казеозной формой подмышечного лимфаденита. Один из больных с HIGM1 имел 3 рецидива мико-бактериальной инфекции с поражением периферических лимфоузлов и легких, второй - милиарный туберкулез легких. У всех больных отмечен стойкий клинический эффект от специфической терапии. У двух больных, имев-

ших в момент исследования острое течение микобактери-альной инфекции отмечено снижение количества CD3 клеток, продуцирующих внутриклеточный IFNy, у трех больных, находившихся в ремиссии микобактериально-го процесса количество СD3 IFNy клеток было нормальным. Количество продуцируемого интерферона, оцененное по интенсивности свечения, было одинаковым в первой и второй группах. Экспрессия IFNyR у всех вышеописанных больных была в пределах нормы.

Заключение. Полученные данные позволяют предполагать, что причиной развития микобактериальной инфекции у больных с HIGM1 и CGD явился первичный иммунологический дефект. Транзиторное снижение количества CD3 IFNy лимфоцитов в периферической крови в момент острого течения микобактериальной инфекции является, вероятнее всего, результатом перераспределения пула IFNy-продуцирующих CD3 клеток с преимущественным их накоплением в очаге воспаления.

HUMAN NKT CELLS EXPRESS GRANULYSIN AND EXHIBIT ANTIMYCOBACTERIAL ACTIVITY

JenniferL.Gansert, Viviane KieHler, MatthiasEngele, Frederick Wittke, Martin Ru,llinghoff,Alan M. Krensky, Steven A. Porcelli, Robert L. Modlin and Steffen Stenger

Human NKT cells are a unique subset of T cells that express an invariant Va24 T cell receptor that recognizes the non-classical antigen-presenting molecule, CDld. Activation of NKT cells is greatly augmented by the marine sponge-derived glycolipid, a-galactosyl ceramide (aGalCer). Since human monocyte-derived cells express CDld and can harbor the intracellular pathogen Mycobacterium tuberculosis, we asked whether the addition of ocGalCer could be used to induce effector functions of NKT cells against infected monocytes, macrophages, and monocyte-derived dendritic cells (Mo-DC). NKT cells secreted IFN-y, proliferated, and exerted lytic activity in response to aGalCer-pulsed monocyte-derived cells. Importantly, aGalCer-activated NKT cells restricted the growth of intracellular M. tuberculosis in a CD ld-dependent manner. NKT cells that exhibited antimycobacterial activity also expressed granulysin, an antimicrobial peptide shown to mediate an antimycobacterial activity through perturbation of the mycobacterial surface. Degranulation of NKT cells resulted in depletion of granulysin and abrogation of antimycobacterial activity. The detection of CDld in granulomas of tuberculosis patients supports the potential interaction of NKT cells with CDld expressing cells at the site of disease activity. These studies provide evidence that aGalCer-activated CD ld-restricted T cells can participate in human host defense against M. tuberculosis infection.

NEWVACCINATION STRATEGIES

Leander Grode and Stefan H. E. Kaufmann*

Vakzine Projekt Management GmbH, Schanzenkamp 7,

D -38124 Braunschweig, Germany;

*Max-Planck Institute for Infection Biology, Schumannstr.21/22, D-10117 Berlin, Germany

Tuberculosis (ТВ) is a major threat to humans, responsible for more deaths than any other single infectious disease. The only vaccine currently available against ТВ was discovered in the early 20th century. In 1908 the most

promising steps towards an ТВ vaccine were made by Albert Calmette and Camille Guerin. They developed the most wildly used live vaccine ever, Mycobacterium bovis “Bacille Calmette-Guerin (BCG). Over two billion people have been vaccinated since. It is safe to use and cheap to produce, but there have been increasing doubts about its effectiveness.

M. tuberculosis belongs to the group of intracellular bacteria that replicate within the phagosome of resting macrophages, thus protection against ТВ depends on T cell-mediated immunity. Several studies in mice and humans, have shown that mycobacteria stimulate antigen-specific, major histocompatibility complex (MHC) class Il-or Class I-restricted CD4 and CD8 T cells, respectively. M. tuberculosis antigen gain better access to the cytoplasm than antigens from BCG leading to more pronounced MHC class I presentation. Therefore, a more effective CD8 T cell response is required for an improved ТВ vaccine.

Secreted proteins of M. tuberculosis represents a good source of antigens for MHC class I presentation. Recombinant (r) BCG strains secreting hemolytically active listeriolysin (Hly) were constructed to promote delivery of mycobacterial antigens to the MHC class I presentation pathway, with the ultimate aim to enhance the antituberculosis vaccine efficacy of BCG by improved stimulation of CD8 T cells.

ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПРИТУБЕРКУЛЕЗЕУВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ

Дёгтев А.Ю.

Государственная медицинская академия, научно-исследовательский центр, г.Караганда, Казахстан

В настоящее время ВИЧ инфекция стала глобальной проблемой всего мира. С каждым годом становится все больше ВИЧ-инфицированных людей, у которых ослабленная иммунная система не может выдерживать натиски различных инфекционных агентов из-за функциональной несостоятельности CD4 лимфоцитов.

Целью работы явилось изучение особенностей функционального состояния лимфоцитов при туберкулезе у ВИЧ-инфицированных.

Для этого использовали тест определения антигенс-вязывающих лимфоцитов. Этот тест применяется при диагностике различных инфекционных заболеваний, в том числе и туберкулеза. Данный метод основан на том, что при проникновении инфекционного агента в организм человека образуются специфические Т-эффекторные лимфоциты, которые связывают этот антиген при непосредственном контакте. Выделив лимфоциты из периферической крови и в качестве антигена используя специальный эритроцитарный диагностикум, можно провести данную реакцию in vitro.

Были обследованы 84 ВИЧ-инфицированных, из которых у 14 был инфильтративный туберкулез легких, подтвержденный классическим клинико-лабораторным комплексом исследования. В контрольную группу вошли 18 человек с активным туберкулезом легких без ВИЧ-инфекции.

У больных с ВИЧ инфекцией в сочетании с туберкулезом легких при использовании метода антигенсвя-зывающих лимфоцитов диагноз туберкулеза подтвердился в 50% случаев. В контрольной группе при

использовании этого метода заболевание подтвердилось в 95% случаев.

Следует отметить, что из всей группы обследуемых лиц ложно-положительных реакций при использовании данного метода не наблюдалось, что говорит о его высокой специфичности.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что при ВИЧ инфекции наблюдается нарушение функционального состояния лимфоцитов, а именно нарушение на начальном этапе иммунного ответа - связывание антигена лимфоцитами.

PHAGOCYTE RESPONSES ТО MYCOBACTERIA IN GENETICALLY SUSCEPTIBLE AND RESISTANT MICE

EruslanovE.B.. Majorov K.B., Mischenko V.V., Kondratieva Т.К., Lyadova I. V., Apt A.S.

Laboratory for Immunogenetics,

Central Institute for Tuberculosis, Moscow, Russia

Previously, mice of the I/St and A/Sn inbred strains and their (A/Sn x I/St)Fl hybrids were characterized in our lab as, respectively, susceptible, intermediate and resistant regarding severity of the disease triggered by intravenous (i. v.) M. tuberculosis H37Rv challenge. Naturally, mycobacteria are spreading by aerosole route and predominantly affect the respiratory tract. To mimic these conditions, we have infected I/St, A/Sn and FI mice with 103 CFUs of M. tuberculosis H37Rv via intratracheal (i. t.) route. Mortality data obtained in i. t. challenge model confirmed a very high level of ТВ susceptibility in I/St mice. To characterize inflammatory reactions in the lungs of infected mice, suspensions of lung cells were obtained and the content of neutrophils (Ly-6G+), macrophages (F4/80‘), dendritic cells (CDllc+) and T cells (CD4+ and CD8+) was assessed along the course of infection. Starting week 3 following challenge, the total number of cells, as well as the amounts of dendritic cells and T cells, in the lungs of I/St mice significantly exceeded those in the lungs of A/Sn and FI mice. Accumulation of neutrophils was registered exclusively in the lungs of former mice. Ziell-Nielsen staining of glass prints of sliced lungs from infected I/St and A/Sn mice demonstrated that I/St neutrophils were associated with numerous mycobacteria, whereas no bacilli could be revealed in scarce A/Sn neutrophils.

In the model experiments on mycobacterial phagocytosis by neutrophils in peritoneal cavity it was shown that in I/St mice neutrophil infiltration was massive, and about half of peritoneal neutrophils contained intracellular mycobacteria. By contrast, neutrophil inflammatory reaction in A/Sn mice was mild, and neutrophils phagocyted only few mycobacteria. All three basic parameters of neutrophil response to mycobacteria in this model system, i. e. neutrophil yield, percentage phagocytosis and phagocytic number, were significantly higher in I/St than in A/Sn mice.

Earlier we reported that lung macrophages from naive I/ St mice are significantly more sensitive to cytopatic effect of mycobacteria than their A/Sn counterparts. In the present study it was shown that this difference retained throughout the infection course. Remarkably, although at week 5 of infection I/St lung macrophages were readily activated for mycobacterial growth inhibition by exogenuos IFN-y, by this time point its synthesis dropped in the lungs of I/St but not A/Sn mice, and 10-fold less IFN-y were produced by the former animals. I/St lung cells produced also significantly

less TNF-a and IL-12. Progressive suppression of type 1 cytokine production along infection course might account for a severe course of ТВ in I/St mice. In addition, a prolonged neutrophil lung inflammation, accompanied by rapid phagocytosis and temporary survival of mycobacteria in newly arriving neutrophils - the phenotype expressed exclusively in susceptible I/St mice - may form an additional niche for mycobacterial infection, thus escaping the effector macrophage activity.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МАКРОФАГОВ И НЕЙТРОФИЛОВ С МИКОБАКТЕРИЯМИ У МЫШЕЙ С 0ПП03ИТН0Й ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ТУБЕРКУЛЕЗУ

ЕруслановЕ. Б.. Майоров К.Б., Мищенко В.В., Кондратьева Т.К., Лядова И.В., Апт А.С.

ЦНИИ туберкулеза РАМН, лаборатория экспериментальной иммуногенетики,

Москва, Россия

В нашей работе была исследована чувствительность к туберкулезу мышей 20-и различных инбредных линий. Среди них наиболее чувствительными к туберкулезной инфекции, вызванной внутривенным введением летальной дозы микобактерий штамма H37Rv, оказались мыши линии I/ St, а среди наиболее резистентных-мыши линии A/Sn при внутривенном заражении. Представлялось важным оценить иммунный ответ в легких чувствительных и резистентных животных при заражении их через респираторный тракт.

Исследование течения туберкулезной инфекции после внутритрахеального введения микобактерий показало, что, во-первых, независимо от способа заражения мыши линии I/St сохраняют высокую чувствительность к инфекции. Для воспалительного процесса в легких мышей I/St было характерно наличие выраженной воспалительной реакции со стороны клеток воспаления. Особенно следует отметить раннюю и интенсивную инфильтрацию легочной ткани нейтрофилами. Цитологическое исследование отпечатков легких показало, что процентное содержание полиморфно-ядерных лейкоцитов в легких зараженных мышей I/St было достоверно выше, чем в легких мышей A/Sn. При этом в легких мышей I/St в большинстве нейтрофилов были обнаружены микобактерии. В нейтрофилах, в легких мышей A/Sn, микобактерии отсутствовали. При оценке фагоцитоза микобактерий нейтрофилами in vivo, было установлено, что нейтрофилы I/St имеют более высокий процент фагоцитоза и фагоцитарный индекс, по сравнению с нейтрофилами A/Sn.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что макрофаги, выделенные из легких незараженных мышей линии I/St, имели гораздо более высокую чувствительность к цитопатическому действию микобактерии и слабую способность контролировать рост микобактерий in vitro, по сравнению с макрофагами мышей линии A/Sn. Данные, полученные нами, показывают, что в ходе туберкулезной инфекции макрофаги I/St и A/Sn сохраняют первоначальный спектр чувствительности/ резистентности к заражению М. tuberculosis in vitro. В то же время в ходе развития инфекции in vivo макрофаги легкого пробретают способность активироваться под действием IFN-y. В присутствии экзогенно добавленного IFN-y макрофаги I/St не отличаются по своим характеристикам от макрофагов A/Sn в тестах in vitro. Полученные нами данные о крайне низкой продукции IFN-y клетками легкого мышей I/St свидетель-

ствуют, что дефект в продукции IFN-y на поздней стадии инфекции может лежать в основе низкой антими-кобактериальной активности макрофагов легкого I/St и, как следствие - высокой чувствительности мышей I/St к туберкулезной инфекции.

DORMANT FORMS OF MYCOBACTERIA AND LATENT TUBERCULOSIS

Kaprelyants A.S.

Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow

Pathogenic Mycobacterium spp. have evolved mechanisms to ensure their survival inside the eukaryotic host. This results in a chronic form of the disease, in which bacteria may persist in vivo for protracted periods (up to decades) without causing apparent disease. It is estimated that one-third of the entire human population is latently infected with the tubercle bacillus and therefore faces a constant risk for reactivation of active disease. These bacilli presumably pass into a latent (dormant) state during which growth is either very slow or non-existent. However the existence of a dormant state for mycobacteria either in vitro or in mvo has not yet been convincingly established. The aim of the present study was to find conditions for the in vitro transition of two organisms belonging to mycobacteria (fast growing Mysmegmatis. and slow growing My. tuberculosis) to a “non-culturable’ (possibly dormant) state.

After growth of My.smegmatis in modified Hartman’s medium under specially selected conditions, and further incubation in stationary phase, there was fast decrease of the CFU count up to zero, while the total count remained similar to the initial value.

These “non-culturable” cells could be considered as dormant as their metabolic activity (respiration and membrane energization) was very low. The viability of dormant cells could be restored (resuscitated) by incubation of cells in liquid medium supplemented by supernatant taken from growing cultures. A small protein similar to Rpf (Mukamolovaefa/., PNAS USA 95,8916-8921) appeared to be responsible for some of the activity in the culture supernatant. Genetically engineered strain of M.smegmatis produced secreted form Rpf revealed spontaneous resuscitation of “non-culturable” cells in liquid medium.

Formation of non-culturable cells of the “Academia” strain of Mycobacterium tuberculosis was similarly observed following growth in Sauton’s medium and further incubation for an extended stationary phase. This resulted in the formation, 4-5 mo. post inoculation, of a homogeneous population of ostensibly “non-culturable" cells (zero CFU). Remarkably, these cells were able to spontaneous resuscitation increased by using supernatant from an actively growing culture or Rpf. Similarly viability of populations of My. tuberculosis isolated from murine peritoneal macrophage lysates several days postinfection in vivo enhanced when the Rpf was incorporated into the liquid culture medium at picomolar concentrations.

The “non-culturable”(dormant) cells that accumulate during prolonged stationary phase in both organisms or after surviving of My.tuberculosis inside of macrophages are small ovoid and coccoid forms with an intact permeability barrier but with undetectable respiratory activity. We consider these “non-culturable” bacteria to be dormant. The observed activity of culture supernatants and Rpf with non-culturable bacterial suspensions invites the speculation that one (or more) of the cognate My. tuberculosis Rpf-like molecule(s),

could be involved in mechanisms of latency and reactivation of tuberculosis in vivo.

THE IMMUNE RESPONSE TO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS: LESSONS FOR RATIONAL VACCINE DESIGN

Kaufmann S.H.E.

Max-Planck-Institute for Infection Biology Schumannstr. 21/22, D-10117 Berlin, Germany

The available vaccine against tuberculosis, BCG, protects newborns from miliary tuberculosis, but fails to prevent the most prevalent form of disease, pulmonary tuberculosis in adults. Thus: (i) Mycobacterium tuberculosis can be controlled (though not eradicated) by the immune response induced by natural infection; (ii) BCG fails to induce a protective immune response at least in those individuals who are susceptible to tuberculosis. Acquired immunity against tuberculosis is a T cell-dependent phenomenon. The T cell system comprises distinct populations. CD4 T cells are undoubtedly of central importance for acquired resistance against tuberculosis. Antigens or M. tuberculosis also have access to MHC class I processing, probably through cross-priming. In addition, unconventional T cells also seem to participate in immunity against tuberculosis. These include CD8 T cells restricted by non-classical MHC class lb molecules, T cells restricted by group I and group IICD1 molecules and yS T cells. CD1 restricted T cells are of particular interest as they recognize glycolipids, which are abundant constituents of the mycobacterial cell wall. What can we learn for rational vaccine design? Novel vaccination strategies either focus on subunit vaccines including naked DNA-vaccines or viable attenuated vaccines. Subunit vaccination strategies are based on the assumption that one or few antigens suffice for an efficient immune response. Hence, the identification of protective antigens represents an essential prerequisite for the success of this type of vaccines. Subunit vaccines come in two forms: Protein/adjuvant formulations or naked DNA constructs. Viable attenuated vaccines are based on the assumption that multiple antigens are required for efficacious protection. Two major strategies are being pursued: Knockout mutants of M. tuberculosis and improved recombinant (r)-BCG vaccines. Crippled versions of M. tuberculosis should not only be deleted of genes involved in virulence/persistence, but also in genes that manipulate the protective immune response. Improved r-BCG should first be endowed with a higher immunogenicity and second may need a broader antigenic repertoire. Taking advantage of our increasing knowledge about the immune response to M. tuberculosis will clearly facilitate rational design of novel vaccines against one of the most frightening threats in the world, tuberculosis.

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА ЛИКОПИДА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГРАНУЛОЦИТОВ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ IN VITRO.

КисинаТ.Е., ФрейдлинИ.С., КнорингБ.Е., БасекТ.С., Елькин А.В., Андронова Т.М.

ГУ НИИЭМ РАМН, СПб, Россия; НИИ Фтизиопулъ-монологии, СПб, Россия;

Ликопид является синтетическим аналогом универсальной структурной субъединицы клеточной стенки всех известных бактерий, в т. ч. микобактерий, и представляет

собой гликозилированный дипептид. В последние годы высказано предположение о том, что действие ликопида, как и других гликопептидов, относящихся к молекулам бактериального «паттерна», опосредовано через То11-по-добные рецепторы (TLR). Поскольку TLR экспрессированы в основном на фагоцитах, в том числе и на грануло-цитах, наиболее вероятными клетками-мишенями ликопида в крови являются гранулоциты. Ранее нами была показана недостаточность некоторых функций грануло-цитов крови больных туберкулезом легких. При туберкулезной инфекции ликопид используется при лечении, однако сравнительно мало работ касается изучения влияния препарата на фагоцитирующие клетки. Целью работы было сравнительное изучение непосредственного влияния ликопида на гранулоциты здоровых людей и больных туберкулезом легких in vitro. Мы изучали изменения функциональной активности гранулоцитов крови здоровых доноров (п= 14) и больных туберкулезом легких (п=17) при инкубации в присутствии различных концентраций ликопида in vitro. В качестве показателей функциональной активности гранулоцитов оценивали окислительный взрыв (спонтанный и индуцированный зи-мозаном НСТ-тест), а также фагоцитарную способность по активности захвата дрожжевых клеток. Нами показано, что ликопид оказывает нормализующее действие на спонтанный окислительный взрыв гранулоцитов доноров. Ликопид стимулировал индуцированный окислительный взрыв гранулоцитов доноров, однако у 3 из 6 доноров данный эффект ликопида in vitro не проявился. Корректирующее действие ликопида на спонтанный окислительный взрыв гранулоцитов больных проявилось не у всех больных и не зависело от исходных уровней этого показателя. В отношении индуцированного окислительного взрыва у больных преобладал извращенный ответ на ликопид, проявлявшийся подавлением этой функции. Хотя ликопид оказывал в целом стимулирующее влияние на фагоцитоз гранулоцитов, изменения фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса в присутствии ликопида в некоторых случаях не наблюдалось: среди здоровых доноров у 5 и 4 человек, а среди больных у 7 и 5 человек соответственно. Это позволило нам высказать предположение о существовании индивидуальной чувствительности гранулоцитов людей, в том числе больных туберкулезом легких, к действию ликопида.

ДИНАМИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ГЛУГОКСИМОМ

КнорингБ.Е.. Елькин А.В., Аветисян А.О.

ГУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопулъмонологии Минздрава, Санкт-Петербург, Россия

Развитие тяжелых форм туберкулеза сопровождается выраженными нарушениями в иммунном статусе, требующими проведения иммунокоррекции. В настоящее время ведется активный поиск доступных и эффективных средств, способных улучшить работу иммунной системы при туберкулезе легких. Новый отечественный препарат

- метаболический иммуномодулятор Глутоксим показал высокую иммунологическую эффективность при вторичных иммунодефицитных состояниях у больных онкологическими заболеваниями. Иммуномодулирующее действие глутоксима при туберкулезе легких не изучалось.

Целью данной работы было исследование влияния глутоксима на некоторые иммунологические показатели у больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких. Клинико-иммунологическое обследование выполнено у 92 человек. Из них распространенный процесс (>6 сегментов) выявлен у 52 пациентов, ограниченный (<=6 сегментам) - у 40 человек. 47 больных получали глутоксим, 45 составили контрольную группу. У всех больных исходно имелись те или иные нарушения иммунитета, в основном выражающиеся в подавлении факторов клеточного ответа и повышении гуморального. Наиболее резко выраженная недостаточность клеточного иммунитета и активация гуморального, а также снижение продукции 1Ь-2, индуцированного ФГА, в сочетании с высоким синтезом при стимуляции ППД, соответствовали нарастанию тяжести процесса. Препарат вводился внутримышечно в дозе 60 мг ежедневно в течение 15 дней. Анализ иммунологических сдвигов после лечения глутоксимом выявил отчетливую тенденцию к нормализации измененных показателей иммунитета. Наиболее выраженное стимулирующее действие глутоксим оказывал на параметры клеточного звена иммунитета. Повышение количественных и качественных показателей клеточных факторов иммунитета отмечено у 60-75% больных против 38-52% в контроле. Исходно низкие или слабо выраженные показатели специфического клеточного ответа (<5% бластов), функциональной активности лимфоцитов (<40% бластов) и продукции 1Ь-2, индуцированной ФГА (<=10 у.е.) возросли соответственно с 1,8±0,24% до 3,2±0,6%, с 29,3±1,3% до 36,8±0,2% и с 0,85±0,2 у.е. до 11,4±3,6 у.е., р<0,05. Выявленный при поступлении процент больных с исходно сниженным содержанием СОЗ+-клеток (50% пациентов), значительным угнетением пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на ППД (78,6% пациентов), на ФГА (45% больных) и сниженной продукцией индуцированного ФГА 1Ь-2 (77% больных) уменьшился соответственно до 28,9, 68,6, 32,3,59,0% (р<0,05). Нарастание исходно низкой продукции 1Ь-2, стимулированной ППД, отмечено у 40% больных контрольной группы и лишь у 10% - основной. В 1,5 раза увеличилось число больных с высокой продукцией 1Ь-2, индуцированного ФГА, и низкой в ответ на ППД. При этом аналогичные показатели в группе контроля в те же сроки исследования либо оставались без изменения, либо продолжали снижаться. Существенных различий в динамике средних значений содержания СБ4 '- и СБ8+ - клеток у больных основной и контрольной групп не имеется. Заметного влияния глутоксима на показатели гуморального иммунитета (уровень ПТАТ, иммуноглобулинов, ЦИК) не обнаружено.

Наиболее отчетливо стимулирующее действие препарата на показатели клеточного иммунитета проявляется у больных с ограниченным процессом. При распространенном процессе иммуномодулирующий эффект глутоксима был значительно меньше. Установлено, что у больных с исходно выраженными нарушениями в иммунном статусе, соответствующими тяжести процесса, при лечении глутоксимом прогрессирование процесса происходит в 1,5-2 раза реже, а стабилизация в 2-4 раза чаще, чем в контрольной группе. Гладкое послеоперационное течение после курса глутоксима наблюдалось у 82,1% больных (в контроле у 63 %). Лечение глутоксимом ни в одном случае не сопровождалось развитием осложнений, а клинический эффект отмечен в 51,1% случаев против 33,3% в контроле. Таким образом, результаты исследования сви-

детельствуют о иммуномодулирующем действии глуток-сима и о перспективности его использования в качестве эффективного препарата, способствующего восстановлению исходно низких параметров клеточного иммунитета у больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, преимущественно при ограниченных процессах.

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТАУ БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

КнорингБ.Е., Елькин А.В.. БасекТ.Ф.. Иванова Л.А., Арчакова Л.И., Сахарова И.Я.

ГУ Санкт-Петербургский

НИИ фтизиопульмонологии Минздрава,

Санкт-Петербург, Россия

Возникновение и развитие туберкулеза легких практически всегда сопровождается явлениями дисфункции со стороны иммунной системы. Спектр иммунологических нарушений при этом в каждом отдельном случае отличается большим разнообразием.

Настоящая работа посвящена сравнительному исследованию нарушений иммунитета и продукции некоторых цитокинов (ІЬ-ір, ІЬ-8, ТОБ-а, 1Ь-2) у больных туберкулезом с последующей оценкой их роли в патогенезе различных форм туберкулеза легких.

Клинико-иммунологическое обследование выполнено у 193 больных активными формами туберкулеза легких. В их число вошло 87 пациентов с инфильтративным туберкулезом легких (И.Т.), 49 - с фиброзно-кавернозным (Ф.К.Т.), 25 - с диссеминированным (Д.Т.), 32 - с казеозной пневмонией (К.П.). Выявление наиболее значимых отличий в характере иммунного ответа у больных различными формами туберкулеза выполнено при оценке особенностей цитокинового статуса и выраженности факторов клеточного и гуморального иммунитета.

Интенсивность выработки цитокинов при различных вариантах течения туберкулезного процесса неоднозначна. Содержание и частота выявления ІЬ-ір, индуцированного ЛПС, были максимально высокими при И.Т. и Д.Т. и минимальными при К.П. Спонтанная и индуцированная ЛПС продукция ТОТ-а достоверно чаще и в более высокой концентрации выявлялась у больных Д.Т. Наиболее низкими эти показатели были при К.П. Наиболее высокий синтез 1Ь-8 зарегистрирован у лиц с И.Т. легких. Наименее интенсивная спонтанная выработка всех провоспалительных цитокинов, отмечалась при К.П. Максимальный индекс стимуляции ІЬ-ір и ТОТ-а выявлен у больных И.Т., минимальный - у больных К.П. Максимальный индекс стимуляции 1Ь-8 отмечался среди больных К.П., минимальный - у пациентов с И.Т. и Д.Т. Частота выявления 1Ь-2 оказалась наиболее высокой у больных Ф.К.Т. Наиболее низкое содержание 1Ь-2 отмечено у больных К.П. Выраженная активация гуморального звена иммунитета характерна для больных Д.Т. Клеточный иммунодефицит наиболее резко был выражен у больных К.П. Эта группа пациентов характеризуется выраженным угнетением пролиферативной активности Т-лимфоцитов, низким содержанием Т-хелперов в сочетании с повышенной экспрессией НЬА-И+ антигенов. Ф.К.Т. напротив, отличался высоким содержанием зрелых Т-клеток, В-лимфоцитов, рецепторов к 1Ь-2. При И.Т. степень активации факторов гуморального иммунитета и повышения числа CD16* и СБ25+ достоверно ниже, чем при других формах туберкулеза.

Изменения со стороны показателей специфического иммунного ответа имели место у большинства больных. Наиболее интенсивное продуцирование ПТАТ характерно для больных Ф.К.Т. и К.П, наименее выраженное -для больных И.Т. Низкие показатели пролиферативного ответа на туберкулин значительно чаще определялись при К.П и реже всего - при Ф.К.Т. Независимо от формы заболевания выявлена отчетливая зависимость в изменениях иммунного и цитокинового статуса от степени тяжести туберкулезного процесса. Тяжесть заболевания коррелирует со степенью депрессии Т-клеточного иммунитета и активацией гуморального звена, угнетением продукции IL-2, интенсивностью синтеза провоспалительных цитокинов и уменьшением соотношения индуцированной и спонтанной продукции IL-1P, TNF-a, IL-8. Отмечено значительное возрастание продукции IL-8 при появлении деструктивных изменений. Снижение продукции не только IL-2 , но и IL-1P и TNF-a, наряду с высоким уровнем IL-8, соответствует крайне тяжелому состоянию больных. Одновременно нарастанию патологических изменений в легких соответствовало повышение уровня CD8+-, CD25+-, HLA-IP-клеток. Особенности иммунного статуса, выявленные при каждой из изученных форм туберкулеза легких, дают более полное представление о патогенезе заболевания. Развитие Д.Т. и К.П. сопровождается наиболее выраженными нарушениями в системе иммунитета. Для этих форм туберкулеза характерен преимущественно гуморальный тип иммунного ответа, не имеющий при туберкулезе протективного значения. Значительное повышение индекса стимуляции в продукции IL-8 указывает на существенную роль IL-8 в патогенезе развития казеозной пневмонии. У больных Ф.К.Т. наряду с увеличением индуцированной продукции IL-8 и высокого синтеза ПТАТ имеют место значительно более высокий специфический клеточный ответ и уровень продукции IL-2, играющие протективную роль при туберкулезе. Наименьшая степень нарушений в показателях иммунитета у больных И.Т. согласуется с меньшей выраженностью клинико-рентгенологических проявлений заболевания по сравнению с другими пациентами. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о существенных различиях в патогенезе формирования различных форм туберкулеза легких и о роли иммунологических механизмов в развитии процесса.

ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

Кондратьева Т. К.. Рубакова Э. И., Петровская С. Н.

Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, Москва, Россия

Индукция протективного иммунитета против Mycobacterium tuberculosis во многом зависит от эффективности презентации антигена антиген-презентирующими клетками легких, в результате которой индуцируется специфический Т-клеточный ответ. Известно, что эффективность защиты людей от легочной формы туберкулеза единственной имеющейся на сегодня противотуберкулезной вакцины BCG не превышает 50%, а в некоторых случаях эффективность вакцинации почти нулевая. Этот факт, а также рост заболеваемости туберкулезом во всем мире за последнее десятилетие стимулировал активные поиски более совершенной противотуберкулезной вакцины.

В нашей работе мы исследовали эффективность использования дендритных клеток, нагруженный рекомбинантными антигенами микобактерий (Ag85B, ESAT6), для индукции длительного специфического противотуберкулезного иммунитета при экспериментальной туберкулезной инфекции у линейных мышей линии С57В1/6. На первом этапе работы были изучены условия выращивания DC из клеток костного мозга мышей в присутствии ростового фактора GM-CSF, определены оптимальные дозы нагрузки мико-бактериальными антигенами in vitro для стимуляции иммунного ответа наивных и примированных Т-лимфоцитов in vivo и in vitro. С помощью метода проточной цитофлюоро-метрии показано, что к 8-10 дню инкубации клеток костного мозга в присутствии 200 ед/мл GM-CSF и последующей активации 50цд/мл антигена в присутствии lug/мл ЛПС или 500ед/мл TNF-a на большей части исследуемых клеток наблюдается высокий уровень экспресси маркеров активированных DC: CDllc, CDllb, антигены гистосовместимости II класса, CD86. С помощью пролиферативного теста in vitro выявлено, что при подкожном введении DC, нагруженных антигенами микобактерий, индуцируется специфический иммунный ответ, который сохраняется не менее 3-х недель после иммунизации. В настоящий момент мы изучаем протективный эффект вакцин на основе дендритных клеток после 2-кратной иммунизации на модели летальной туберкулезной инфекции.

М. TUBERCULOSIS PERSISTANCEAND IMMUNE RESPONSES OF LUNG INFILTRATING LYMPHOCYTES IN HUMAN TUBERCULOSIS

Kosmiadi G.A., Ulrichs T.*, Mishenko V.V., Gushina N.N., Kaufmann S.H.E.

Central Research Institute for Tuberculosis RAMSci, Moscow, Russia;

* Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany

Mycobacterium tuberculosis infection in man induces the disease with a wide spectrum of clinical manifestations, from asymptomatic to disseminated and rapidly progressing tuberculosis. Protective immune response in tuberculosis is associated with CD4 lymphocytes, elaborating IFNy and activating macrophage bactericidal function. However, many aspects of immune response, developing at the site of infection in human lung, as well as the effect of mycobacterial load on the immune response, are not clear. To study these we employed both immunological and bacteriological approaches.

Lung tissue samples were obtained at surgery from patients with either tuberculoma or cavity tuberculosis and caseous pneumonia, who differ significantly in severity of disease and lung affection. Infected lung tissue was minced and the concentration of live mycobacteria (CFU per gram tissue) was determined by plating onto Dubos agar. The tissue was further digested with collagenase/DNAse, following which macrophages were obtained by adhesion to plastic surface and lymphocytes-by nylon wool column purification. Following subpopulation analysis, responses to mitogens and mycobacterial antigens were determined with lymphocytes. The macrophages were infected with 2-20-fold quantities of H37Rv strain of mycobacteria and macrophage killing effect was assessed by inhibition of 3H-uracil uptake by growing mycobacteria.

The study showed that the mycobacterial load in the lungs of sputum-negative treated patients varied from 108

CFU/g in caseous pneumonia to 103 CFU/g in tuberculoma patients. High levels of intralung mycobacteria correlated with the level of their multi-drug resistance. The intensity of lymphocyte and macrophage infiltration into the lung was variable, but tended to be less expressed in the cavity-adjacent areas of the lung; Intralung lymphocytes were represented mainly by CD4 cells, containing significant numbers of memory CD4 CD45R0 cells. Lymphocytes, derived from pericavital lung tissue expressed a strong spontaneous and antigen-induced response in vitro and macrophages exerted a regulatory effect onto lymphocyte responses. Bactericidal effect of lung macrophages was strongly dependent on the presence of exogenic IFNy.

The interrelations of immune response with mycobacterial load and the severity of lung immunopathology are discussed.

ПЕРСИСТЕНЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА У ЧЕЛОВЕКА И ИММУННЫЙ ОТВЕТ ВНУТРИЛЕГОЧНЫХ ЛИМФОЦИТОВ

Космиали Г.А.. Ульрихе Т.*, Мищенко В.В., Гущина Н.Н., Кауфманн С.*

ГУ Центральный НИИ туберкулёза РАМН, Москва, Россия;

* Институт биологии инфекции им. Макса Планка, Берлин, Германия

Инфекция М.tuberculosis у человека вызывает заболевание с широким спектром клинических проявлений - от бессимптомного до распространённого и быстро протекающего туберкулёза. Протективный иммунный ответ при туберкулёзе принято связывать с CD4 лимфоцитами, которые вырабатывают IFNy и стимулируют бактерицидную активность макрофагов. В то же время детали формирования иммунного ответа в зоне развития инфекции в легком человека, а также влияние микобактериаль-ной нагрузки на иммунный ответ не изучены. Для исследования локального иммунного ответа в легких человека мы использовали несколько методических подходов.

Ткань легкого получали от больных, существенно различающихся по степени поражения легкого - с диагнозами туберкулома, фиброзно-кавернозный туберкулёз и ка-зеозная пневмония. Из ткани делали высев на плотную питательную среду Дюбо и определяли содержание микобактерий в 1 г ткани ( КОЕ/г). Далее ткань переваривали в р-ре коллагеназы /ДНКазы и из полученной суспензии клеток выделяли лимфоциты и чистые легочные макрофаги. Определяли субпопуляционную принадлежность лимфоцитов, а также способность к пролиферативному ответу на митогены и антигены микобактерий, которую учитывали по включению ЗН- тимидина. Макрофаги заражали 2 - 20 кратным количеством М.tuberculosis лабораторного штамма H37Rv и определяли бактериостати-ческую активность клеток по угнетению включения ЗН-урацила в растущие микобактерии.

Установлено, что удельная микобактериальная нагрузка на легкое у леченных больных, не выделяющих бациллы с мокротой, может составлять от 108 КОЕ/г ткани при казеозной пневмонии до 103 КОЕ/г ткани при туберкуло-ме, причём высокое содержание микобактерий сопровождалось усилением их устойчивости к противотуберкулёзным препаратам. Инфильтрация легочной ткани макрофагами и лимфоцитами варьировала и была более выражена в зонах, отдалённых от каверны. Внутрилегочные

лимфоциты были представлены главным образом CD4 клетками, значительная часть которых являлась клетками памяти CD4 CD45RO . Лимфоциты, инфильтрирующие прикавернозную ткань, отличались сильным спонтанным и антиген-индуцированным ответом in vitro, а макрофаги оказывали регуляторное влияние на ответ. Бак-териостатическая активность легочных макрофагов in vitro зависела от присутствия экзогенного IFN-y.

Обсуждается связь иммунного ответа с микобактери-альной нагрузкой и выраженностью туберкулёзной патологии легкого у человека.

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ CD4+ CD44HICD62LL0 ПРИ ОТВЕТЕ НАМИКОБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ

Лядова И.В.1>2, Сэйлз П.2, Ерусланов Б.В.2, Свэйн С. Л.2 Апт А.С.1

1 Центральный институт туберкулеза РАМН, Москва, Россия;

2 Институт Трюдо, Саранак Лэйк, США

Эффективность протекции против инфекций, вызванных М. tuberculosis, в значительной степени зависит от генерации клеток CD4+, способных продуцировать IFN-y и, таким образом, стимулировать антимикобактериаль-ную активность макрофагов. Установление Т-клеточно-го ответа обычно регистрируется по появлению клеток CD4+, экспрессирующих фенотип клеток-эффекторов/ клеток-памяти (CD44h'CD62Ll0/CD45RBl0), отвечающих на стимуляцию микобактериальными антигенами пролиферацией, и продуцирующих IFN-y. Взаимосвязь между этими процессами, однако, до сих пор окончательно не установлена. Для ее выяснения мы использовали два экспериментальных подхода.

Во-первых, мы сравнивали активацию, пролиферацию и продукцию IFN-y лимфоцитами CD4+, выделенными из легких мышей, чувствительных (I/St) и резистентных (A/Sn) к инфекции, вызванной М. tuberculosis. У мышей I/St и A/Sn, зараженных М. tuberculosis, процент лимфоцитов легкого, экспрессирующих фенотип активированных клеток (CD44hiCD62Ll0) был одинаковым. Пролиферативная активность Т-лимфоцитов in vitro и in vivo была выше у мышей I/St, а продукция IFN-y - у мышей A/Sn. Таким образом, была выявлена диссоциация между пролиферацией Т-кле-ток и их способностью секретировать эффекторные цитоки-ны.

Во-вторых, мы непосредственно сравнивали пролиферативную активность и способность секретировать IFN-y Т-клеток, экспрессирующих различный поверхностный фенотип. В качестве модели использовали инфекцию М. bovis BCG у мышей C57BL/6. Активация Т-лимфоцитов, пролиферативный ответ и секреция IFN-y регистрировались, начиная со 2-й недели после заражения. Выраженной пролиферативной активностью обладали только клетки, имеющие фенотип CD44hi CD62L'°, однако, не все они секретировали IFN-y. Одновременная окраска клеток на BrdU и внутриклеточные цитокины показала, что указанные процессы не происходят в клетке одновременно. Используя два различных способа введения BCG (интратра-хеально и подкожно), мы индуцировали инфекцию М. bovis BCG с различной локализацией (легочной либо в дренирующих лимфоузлах) и показали, что в легочную ткань, в том числе и при внелегочной форме инфекции, мигрируют преимущественно клетки CD4+, имеющие фенотип клеток-эффекторов, и продуцирующие IFN-y. Напротив, в лимфа-

тических узлах, инфицированных BCG, скапливаются и клетки-эффекторы, и «наивные» (CD44'°CD62L+) Т-лимфоциты. Таким образом, мы продемонстрировали гетерогенную природу Т-клеточного ответа на микобактерии, отсутствие жесткой корреляции между пролиферацией Т-лимфоцитов и продукцией ими IFN-y и преимущественное накопление высокодифференцированных эффекторов, продуцирующих IFN-y, в легочной ткани.

TRANSCRIPTOME SIGNATURES IN HUMAN TUBERCULOSIS DISEASE

Mollenkopf H. J.1, Jacobsen M.1, Neher A.2, Feldmann K.2, Nietfeld W.3, Schuchard J.4, Eickhoff H.5, KauftnannS.H.E.1

1 Department of Immunology, Max Planck Institute for Infection Biology, D-10117 Berlin, Germany;

2 Central hospital Gauting, Germany;

3 Max Planck Institute for Molecular Genetics,

D-14195Berlin, Germany;

4MicroDiscovery GmbH, D-10405 Berlin, Germany;

5 ScienionAG, D-12489 Berlin, Germany

Mycobacterium tuberculosis is the cause for one of the most prevalent bacterial infections in humans with probably more than two billion latently infected individuals worldwide provoking about three million deaths annually. Two major obstacles hinder eradication of this disease: The lack of an effective vaccine and the long time period needed for diagnosis and chemotherapy. Vaccine candidates which show efficacy in animal models have to be tested in humans and therefore tools to assess the degree of protection evoked by vaccine candidates is absolutely needed (correlates of protection). To develop a method that meets this demand we selected a global approach using oligonucleotide micro-arrays to determine the transcriptome of freshly isolated human immune cells from ТВ patients, healthy contacts of ТВ patients, and a reference RNA-Pool. We identified discrete genes which differed significantly between patients and controls. Differentially expressed genes comprised molecules directly involved in antimicrobial host response, chemokines, and chemokine receptors. Three different types of pattern could be identified, (a) genes highly expressed only in ТВ patients, (b) molecules expressed to a lower level in Tb patients, and (c) genes strongly expressed in the RNA-Pool, less in patients and least of all in protected controls. Out data support the notion that transcriptome analysis can reveal key gene expression pattern correlated with the degree of protection against disease. Further studies are aimed at defining a custom made array for measuring correlates of protection.

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕЙТРОФИЛ ЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ КРОВИ ДЕТЕЙ ПРИ ПЕРВИЧНОМ ТУБЕРКУЛЕЗЕ

Новикова Н.С.. Перекрест С.В., Алешина Г.М., Сахарова И.Я., Потапенко Е.И., Корнева Е.А.

ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия; ГУ Санкт-Петербургский научно-исследо-вательский институт фтизиопульмонологии М3 РФ, Санкт-Петербург, Россия

Вопросы ранней диагностики туберкулеза и определение лабораторных признаков, позволяющих выявить

группу риска к данному заболеванию, актуальны в настоящее время. Развитие туберкулезного процесса зависит от состояния клеточного звена иммунитета, в первую очередь, от функциональной активности макрофагов и лимфоцитов. В то же время появляется все больше фактов в пользу активного участия нейтрофильных грануло-цитов (НГ) - важного звена врожденного иммунитета - в противотуберкулезной защите организма. Морфо-функ-циональные характеристики НГ периферической крови взрослых людей служат важным показателем при диагностике заболеваний различными формами вторичного туберкулеза (Сахарова И.Я., 1993; Новикова Н.С., 2000; Шендерова Р.И., 2001). Однако нет однозначных данных

о состоянии врожденного иммунитета при первичном туберкулезе.

Цель данной работы — исследование основных морфологических и функциональных характеристик НГ периферической крови при первичном туберкулезе легких.

Материалом исследования являлась периферическая кровь детей с туберкулезом внутригрудных лимфоузлов (32 человека) в возрасте от 6 до 16 лет. В работе были использованы следующие методы: 1) лизосомально-ка-тионный тест (ЛКТ), предложенный В.Е. Пигаревским (1979); 2) цитологический НСТ-тест в двух вариантах, спонтанном и стимулированном, по стандартной методике в модификации Ю.А. Мазинга (1995); 3) реакция фагоцитоза (В.Е. Пигаревский, 1987). При микроскопи-ровании просматривали 100 нейтрофилов, определяли процент фагоцитировавших клеток, и вычисляли коэффициент бактерицидной активности (КБА) катионных белков, оцениваемый в процентах, как отношение числа мертвых бактерий к их общему числу. Кроме того, использовали данные клинического анализа крови (общее количество лейкоцитов и лейкограмма).

В результате были получены следующие данные. При незначительной нейтропении и количестве лейкоцитов, соответствующем норме, в группе больных наблюдали снижение значения среднего цитохимического коэффициента (СЦК) при ЛКТ: 1,28±0,16 (норма 1,56±0,19). Анализ результатов реакций НСТ-теста позволил выявить достаточно высокий уровень значений СЦК в спонтанном варианте (0,55±0,21, по сравнению с нормой 0,15-0,25) и низкий — в стимулированном варианте (1,05±0,26 при норме 1,5-2,0). Количество НСТ-позитивных нейтрофилов при стимуляции возрастало в 1,5-2 раза, при этом их процент значительно превышал норму: в спонтанной пробе 33-67% (норма 2-20%); в стимулированной пробе 63-95% (норма 23-32,4%). Анализ реакций фагоцитоза показал, что количество фагоцитировавших клеток через 1 час инкубации возрастало по сравнению с тем же количеством после 15 минут инкубации; при этом происходило увеличение значений КБА (с 6,42-15,58% до 18,75-29,25%). После 3 часов инкубации количество фагоцитировавших клеток оставалось на том же уровне, что и после 1 часа инкубации, при продолжающих возрастать значениях КБА (до 26,87-37,13%).

Таким образом, показано, что дети с впервые выявленным первичным комплексом туберкулеза имеют сниженные параметры ЛКТ, повышенный уровень спонтанного НСТ-теста и сниженные показатели завершенности фагоцитоза, что свидетельствует о сниженной функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов. Ранее было установлено, что дети, имеющие низкий уровень ЛКТ, склонны к частым заболеваниям дыхательных путей, в частности, бронхитами (Мазинг Ю.А., 1995).

Анализ полученных данных позволяет сделать предположение, что сниженные показатели морфо-функцио-нальной активности нейтрофильных гранулоцитов крови могут являться одним из факторов риска заболевания первичным туберкулезом и часто рецидивирующими респираторными заболеваниями.

Работа поддержана грантом РГНФ № 03-06-00140

GENE EXPRESSION IN THE LUNGS FOLLOWING ТВ CHALLENGE: COMPARATIVE ANALYSIS IN SUSCEPTIBLE AND RESISTANT MOUSE STRAINS

Orlova M.O., SchurrE.*, Lyadova I.V., Majorov K.B., Eruslanov E.B., Apt A.S.

Laboratory forlmmunogenetics, Central Institute for Tuberculosis, Moscow, Russia *McGill Center for the Study of Host Resistance, Montreal, Canada

Earlier it was shown in our laboratory that mice of I/St and A/Sn strains display, respectively, the highest and the lowest susceptibility to ТВ infection among 30 strains studied. Comparative studies in these two strains revealed the differences in survival time, lung pathology level, and bactericidal activity of macrophages. The results of [3H]-uracil assay indicated a lower level of antimycobacterial effector function of lung macrophages from susceptible I/St than from resistant A/Sn mice. A/Sn lung macrophages, being cultured in vitro, also demonstrate a 2-fold higher TNF-a and IL-12 production.

As far as ТВ is a polygenically controlled disease, we focused our study on assessment of gene expression patterns, anticipating to find significant differences between lung macrophages from I/St and A/Sn mice. Interstitial lung macrophages obtained from lungs of non-infected mice were cultured for 24 hours with (infected) or without (control) administration of M. tuberculosis H37Rv at MOI 5:1 and subjected to RNA extraction. Gene expression patterns in the probes were assessed using Affymetrix Genechip® U74Av2 that contain probes for approximately 12,000 mouse genes. Preliminary analysis of hybridization data indicates that the infection caused up-regulation of IL-10Ra, Csf-2, hsp70, iNOS and MMP10, but down-regulation of MMP8, genes. A 3-fold increase in post-infection IL-6 production was detected in A/Sn but not in I/St macrophages, although the general level of its expression in the latter cells was 2-fold higher. Interestingly, the most profound interstrain difference observed was that in the expression level of anti-inflammatory cytokine IL-11: non-infected I/St macrophages synthetize 30-fold more IL-11 mRNA than their A/Sn counterparts. Even though its level increased 12-fold in A/Sn macrophages following infection, it remained 2.5- and 7-fold lower than that in control and infected I/St cells, respectively.

To confirm microarray data, TaqMan real-time PCR analysis of RNA samples obtained from the whole lung tissue of control and infected mice of these strains was performed. In contrast to the results obtained using purified lung macrophages, both MMP10 and MMP8 genes were up-regulated. The interstrain difference in the level of IL-11 expression was readily confirmed: 3- and 6-fold higher levels of corresponding mRNA were found in I/St lungs compared to control and infected A/Sn lungs, respectively. Taken together, our results provide some new insights into regulation of defensive and/or pathogenic mechanisms of

response in the lung tissue, suggesting an important role of IL-11 and macrophage metalloproteinases, i.e. pathways that are poorly characterized yet.

ГЕННАЯ ЭКСПРЕССИЯ В ЛЕГКИХ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ И РЕЗИСТЕНТНОЙ ЛИНИЙ МЫШЕЙ

Орлова М.О., Шурр Э.*, Лядова И.В., Майоров К.Б., Ерусланов Е.Б., Апт А.С.

Лаборатория иммуногенетики туберкулеза, ЦНИИ Туберкулеза РАМН, Москва, Россия

* Центр Изучения Резистентности Хозяина, Университет МакГилл, Монреаль, Канада

Ранее в нашей лаборатории было показано, что мыши линии I/St и A/Sn проявляют, соответственно, наибольшую и наименьшую чувствительность к туберкулезной инфекции среди 30 изученных линий. Сравнительный анализ мышей этих двух линий выявил различия в продолжительности жизни, тяжести патологических изменений легких, бактерицидной активности макрофагов. Результаты оценки включения [3Н]-урацила указывают на более низкий уровень антимикобактериальной эффек-торной функции легочных макрофагов чувствительных мышей I/St, чем резистентных A/Sn. Также, легочные макрофаги A/Sn, культивированные in vitro, продуцируют в два раза большее количество TNF-a и IL-12.

Так как туберкулез - полигенно контролируемое заболевание, мы сфокусировали наши исследования на изучении генной экспрессии, в надежде найти достоверные различия между легочными макрофагами мышей линий I/St и A/Sn. Полученные из нормальных легких интерстициальные макрофаги культивировались in vitro в течение 24 часов с добавлением (зараженные) или без добавления (контрольные) М. tuberculosis H37Rv с соотношением 5:1 и использовались для получения проб РНК. Результаты по уровням экспрессии генов были получены с помощью Affymetrix Genechip® U74Av2, содержащих около 12000 мышиных генов. Предварительный анализ данных показал, что инфекция ведет к увеличению экспрессии генов IL-10Ra, Csf-2, hsp70, iNOS и MMP10, но понижению экспрессии ММР8. Также, при заражении наблюдалось 3-кратное увеличение продукции IL-6 в макрофагах A/Sn, хотя исходный уровень его экспрессии у макрофагов I/St в 2 раза выше и не меняется после заражения. Интересно, что наибольшее межлинейное отличие наблюдалось в уровне экспрессии противовоспалительного цитокина IL-11: не-зараженные макрофаги I/St синтезируют в 30 раз больше мРНК IL-11, чем макрофаги A/Sn .Даже, несмотря на рост его уровня в зараженных макрофагах A/Sn в 12 раз, он оставался в 2,5 и 7 раз ниже, чем у контрольных и зараженных клеток I/St соответственно.

Для подтверждения данных, полученных с помощью микрочипов, мы провели дополнительный TaqMan Real-Time PCR анализ проб РНК, выделенных из цельных легких зараженных и контрольных мышей тех же линий мышей. В отличие от результатов, полученных с использованием выделенных легочных макрофагов, наблюдалось увеличение экспрессии как ММР10 так и ММР8. Была подтверждена межлинейная разница в уровне IL-11: в 3 и

6 раз более высокие уровни соответствующей мРНК были найдены в легких мышей I/St, в сравнении с контрольными и зараженными легкими A/Sn соответственно. Таким

образом, наши результаты рождают новые взгляды на регуляцию защитного и/или патогенного механизмов иммунного ответа в легочной ткани, предполагая важную роль таких пока еще слабо изученных факторов, как IL-11 и макрофагальные металлопротеиназы.

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ МИКОБАКТЕРИОЗА

Оттен Т.Ф.

ГУ « Санкт-Петербургский НИИ фтизиопулъмоно -логии Минздрава России»

Микобактериоз - инфекционное заболевание, вызываемое нетуберкулезными микобактериями (НТМБ). В регионе Северо-Запада России среди возбудителей микобактериоза (М-за) преобладают М.avium комплекс, M.malmoense и Mxenopi. Для своевременной и достоверной диагностики М-за необходимы выделение и идентификация возбудителя. НТМБ обладают высокой резистентностью к большинству антибактериальных препаратов, поэтому поиск новых лекарственных препаратов для лечения М-за является актуальной задачей современной фтизиатрии.

Цель исследования - совершенствование старых и разработка новых методов диагностики и лечения М-за.

Нами разработаны 3 этапа бактериологической и биохимической идентификации микобактерий, включающие оптимальный набор диагностических тестов, которые позволяют отделить микобактерии туберкулезного комплекса от НТМБ и идентифицировать 10 из 18 наиболее часто встречающихся в регионе НТМБ. Совместно с сотрудниками НИИЭМ им.Пастера проведена идентификация НТМБ с помощью ПЦР-риботипирования и ПЦР с универсальными праймерами, что позволило дать дополнительную характеристику некоторых видов НТМБ. Так, подтверждена филогенетическая удаленность M.fortuitum от других испытанных видов, выделены существенные различия между M.avium и M.intracellulare, относящимися с клинической точки зрения к одному комплексу.

Разработаны клинико-бактериологические критерии диагностики М-за, в основе которых лежит одновременность появления клинико-рентгено-лабораторных признаков, характерных для микобактериозного процесса и выделение культуры НТМБ.

Исследована активность левофлоксацина (препарат фторхинолонового ряда) против 10 видов НТМБ. К критической концентрации (10мкг/мл) были чувствительны 8 из 10 испытанных видов. 16,7% шт. M.avium и 30% M.chelonei были устойчивы к этой концентрации. Следовательно, ле-вофлоксацин можно рассматривать как эффективный препарат в составе комбинированной терапии больных М-зом.

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ЛИМФАДЕНИТОМ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКИХ ВМЕШАТЕЛЬСТВАХ

Потапенко Е.И.. Баринов B.C., Прохорович Н.А., Якунова О. А., Семенченко П.В.

ГУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии М3 РФ

За последние годы отмечается увеличение количества осложнений туберкулезного лимфаденита (ТЛА) до

36%,что в основном объясняется слабым выявлением больных в общей лечебной сети и объективными трудностями дифференциальной диагностики TJIA.

Специфическое поражение лимфатических узлов, важнейших периферических органов иммунной системы, вызывает изменения иммунореактивности больных на местном и системном уровнях. Углубленное изучение иммунного гомеостаза у больных ТЛА при хирургических вмешательствах до настоящего времени не проводилось.

Целью работы явилось изучение количественных и функциональных показателей клеток иммунного ответа (КИО) у оперированных больных ТЛА. Обследованы 42 больных (30 женщин, 12 мужчин; средний возраст 42,9±2,9 лет) до и через 3 мес. после операции. При изучении динамики иммунитета особое внимание уделили показателям КИО на специфический антиген. Иммунологические данные сопоставили с гематологическими и клиническими данными.

Установили, что нормальный уровень лимфоцитов (>35% ), Т-клеток (>1000 в 1 мкл) и умеренное содержание циркулирующих противотуберкулезных антител (ПТАТ в ИФА > 0,30 ед.ОП), характерные для больных ТЛА, не зависят от локализации и распространенности специфического поражения лимфоузлов. По мере снижения СОЭ (до операции >18 мм/час, после > 15 мм/час) отметили падение титра ПТАТ в ИФА до > 0,26 ед.ОП. Определили зависимость между наличием (отсутствием) абсцедирования лимфоузлов и лабораторными показателями. До операции у больных абсцедирующим ТЛА (11 пациентов), по сравнению с больными без абсцедирования (31), имеются достоверные различия (р<0,05) в СОЭ (24,3 мм/час против 15,7 мм/час), содержании лейкоцитов (6,0-109 кл/л против 4,6-109 кл/л), лимфоцитов (>34% против 40%), Т-клеток (>1250 кл. против >1550 кл.), уровне ПТАТ в РПК (>20 у.е. против > 14,5 у.е.) и РПГ (> 15 у.е. против 9 у.е.). Специфическая пролиферативная активность Т-клеток и содержание ПТАТ в ИФА были одинаковы (РБТЛ с ППД >6,0%, ИФА - 0,30-0,35 ед.ОП). В послеоперационном периоде по мере стабилизации клинической картины заболевания и нормализации СОЭ у всех больных снижалась специфическая пролиферация Т-клеток и титров ПТАТ в РПК и РПГ.

Полученные новые данные показателей КИО отражают исходное клиническое состояние больных ТЛА и результаты выполненного хирургического вмешательства.

LATENT AND CHRONIC FORMS OF EXPERIMENTAL TUBERCULOSIS: COMPARISON BETWEEN CORNELL-LIKE AND LOW-DOSE CHALLENGE MODELS

Radaeva T.V.. Nikonenko B.V., Mischenko V.V., Apt A.S.

Laboratory for Immunogenetics, Central Institute for Tuberculosis, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia

In adults, many cases of lung tuberculosis (ТВ) are thought to develop as a reactivation disease which occurs due to relapse of infection which initially had affected the individual during childhood. The cause of ТВ relapse remains mostly unknown, and there is no reliable experimental model that reproduces a spontaneous ТВ

reactivation in humans as yet. In mice, the best characterized model of ТВ relapse (Cornell model) does not mimic normal physiological conditions, since it includes treatment of animals with corticosteroids following withdrawal of antibiotic therapy.

I/St inbred mouse strain is the most susceptible among approximately 30 strains studied in our lethal ТВ infection models, regarding both the mean survival time and mycobacterial growth in spleens and lungs. On the basis of this mouse strain we have established a novel murine model of spontaneous tuberculosis reactivation in the absence of hormone treatment. Although chemotherapy resulted in a complete lack of culturable mycobacteria in lungs and spleens of mice of both I/St and B6 strains, after a 5-month “resting” period mycobacteria could be recovered from spleens of 100% of animals. In genetically susceptible mice of I/St strain mycobacterial loads were 1,000-10,000-fold higher than in more resistant B6 mice.

Importantly, it was demonstrated that reactivation of ТВ following antibiotic treatment and “resting” period initially occurs in extrapulmonary anatomical sites, predominantly in the spleen.

Interestingly, mice that reactivate ТВ after chemotherapy withdrawal survive much worse than their non-treated syngenic counterparts suffering chronic ТВ infection induced by an extremely low initial M. tuberculosis challenge dose (70 CFU/mouse). Despite a much lower mycobacterial burden in the group of I/St mice with reactivation ТВ (103 - 104 CFUs per lung at 5

- 6 month following therapy withdrawal) compared to non-treated animals challenged with a low dose (106 CFUs per lung at 5 - 6 months of chronic infection), the former died, presumably of lung pathology, whereas chronically infected animals survived their 100-fold higher mycobacterial load more or less indefinetely, without much pathology in the lung tissue.

ЛАТЕНТНАЯ И ХРОНИЧЕСКАЯ ФОРМЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА: СРАВНЕНИЕ МОДЕЛИ НИЗКОДОЗОВОГО ЗАРАЖЕНИЯ И КОРНЕЛЛ-ПОДОБНОЙ МОДЕЛИ

Радаева Т.В.. Никоненко Б.В..

Мищенко В.В., Апт А.С.

Лаборатория иммуногенетики, ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва, Россия

Считается, что большинство случаев туберкулеза легких у взрослых возникает вследствие реактивации инфекции, с которой изначально человек встретился еще в детстве. Причина реактивации туберкулеза остается неизвестной, и все еще не существует надежной экспериментальной модели, которая воспроизводила бы спонтанную реактивацию туберкулеза у человека. На мышах наиболее хорошо охарактеризованная модель (Корнелловская модель) реактивации туберкулеза не отражает нормальные физиологические процессы, так как включает в себя лечение животных кортикостероидами после отмены антибиотиков.

Линия инбредных мышей I/St является наиболее чувствительной среди примерно 30 линий, исследованных в нашей модели летального туберкулеза, оценивая по среднему времени выживания и высеву микобактерий из легких и селезенки. На основе этой ли-

нии мышей мы создали новую мышиную модель спонтанной реактивации туберкулеза, которая не включает применение гормонов. Хотя в результате химиотерапии нам удалось полностью удалить культивируемые формы микобактерий из селезенок и легких мышей обеих линий I/St и В6, через 5 месяцев после отмены химиотерапии микобактерии высевались из селезенок 100% животных. У генетически чувствительных мышей I/St высевалось микобактерий больше в 1000-10000 раз, чем у более резистентных мышей В6. Важно, что после антибиотикотерапии и длительного периода ожидания реактивация туберкулеза начинается внелегочно, преимущественно в селезенке.

Интересно, что мыши, переживающие реактивацию туберкулеза после отмены антибиотиков, выживают значительно хуже, чем животные этих же линий с хронической формой туберкулеза, развившейся в результате введения крайне низкой дозы М. tuberculosis (70 КОЕ на мышь). Несмотря на гораздо более низкую бактериальную нагрузку у мышей I/St с реактивацией туберкулеза (103 - 104 КОЕ на легкое через 5-6 месяцев после отмены антибиотиков) по сравнению с нелеченными животными с хронической формой туберкулеза (106 КОЕ на легкое через 5-6 месяцев хронической инфекции), первые погибают, вероятно, от патологических изменений в легком, тогда как животные с хронической инфекцией переживают в 100 раз большую микобактериальную нагрузку более-менее безразлично и с гораздо менее выраженными патологическими изменениями в легком.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО СТАТУСА У ПАЦИЕНТОВ С АКТИВНЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УРОВНЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ АНТИТЕЛ

Тюлькова Т.Е., Чебышева Е.В.. Кашуба Э.А., Чугаев Ю.П., Каленова Л.Ф.

Городская иммуноаллергологическая консультативно-диагностическая поликлиника;

Тюменская государственная медицинская академия

Серологические методы диагностики туберкулеза, при помощи которых определяли противотуберкулезные антитела (ПТАТ), многие годы привлекали внимание исследователей. Образование ПТАТ основывается, как правило, на результатах комплексного специфического гуморального ответа (Ягафарова Р.К.,2001). Исследования (Кноринг Б.Е.,1991, Стаханов В.А., 2001) свидетельствуют, что уровень ПТАТ изменяется адекватно изменениям клинической картины. В связи с этим определение ПТАТ может служить дополнительным прогностическим критерием течения туберкулезной инфекции (Чуканов В.И., 1991).

Цель: выявление зависимости клинического течения и исходов туберкулеза органов дыхания (ТОД) и

изменений иммунологических показателей от уровня ПТАТ в сыворотке крови.

Материалы и методы. Исследование проведено у 15 больных в возрасте 7-15 лет с инфильтративным ТОД, находящихся на лечении в специализированном стационаре. Выделены следующие группы: 1-я группа

- дети, у которых концентрация ПТАТ была 0,5 и более опт.усл.ед.(п=5); 2-я группа - пациенты с уровнем ПТАТ 0,2-0,49 опт.уел.ед. (п=10). Рецепторный аппарат лимфоцитов (Лф) определяли методом проточной цитофлюориметрии на цитометре ЕАС5сап с моноклональными антителами (“Сорбент”, г. Москва). Оценивали субпопуляционный состав Лф: СБЗ+, СБ4+, СБ20+, СБ16+, СБ23+, СБ54+, СБ11Ь+, С014+. Уровень ^Е, ТОТ-а, IЬ-1Р, 1Ь-4 в сыворотке определяли методом ИФА (ООО “Протеиновый контур”). ПТАТ исследовали в разведении 1/100 в оптических условных единицах (опт.уел.ед) методом ИФА.

В результате исследования выявлено, что высокие титры ПТАТ имеют пациенты, у которых ТОД начинается подостро (в 100%) и выявляется поздно (40% случаев). При этом у одной пятой части пациентов в исходе заболевания формируются фиброзные изменения. Наоборот, у лиц с низким уровнем ПТАТ острое начало ТОД имеет каждый третий пациент, заболевание диагностируется в фазу инфильтрации в 100% случаев и заканчивается более благополучно рассасыванием и уплотнением морфологических элементов в легочной ткани.

Как видно из табл.1, показатели пациентов 1-й группы отличались от 2-й статистически достоверным повышением относительного количества лф, Т-лф, несущих маркеры СОЗ\ СБ4+и СБ20+ и рецептор межклеточной адгезии (С054+), р<0,05. Помимо этого, в 1-й группе нами выявлены косвенные признаки активации ТЬ2-лимфоцитов: увеличение экспрессии маркера СБ23+ (р<0,01) и повышение концентрации ^Е, (р<0,01). Содержание 1Ь-4 было одинаковым в обеих группах. Для 2-й группы было характерно увеличение экспрессии маркера СБ16+(р<0,01), ТОТ-а и 1Ь-1|3 (р<0,05). Эти цитокины усиливают экспрессию маркера СБ11Ь+, что и было зафиксировано в нашем исследовании у пациентов 2-й группы, р<0,05. На уровень представления молекул межклеточной адгезии 1САМ-1(СБ54+), СБ11Ь+ на мембране лф оказывают влияние бактериальные липополисахариды микобактерий (Фрейдлин И.С.,2001). Рецептор к ним (СД14+) представлен примерно одинаково в обеих группах (86,8+2,7% против 82,7± 1,3%, соответственно, р>0,05).

Заключение. Таким образом, при низком уровне ПТАТ иммунный ответ осуществляется по рациональному пути через активацию ТЫ-лимфоцитов и заканчивается рассасыванием инфильтрации. При наличии высокого уровня ПТАТ имеет место нерациональный путь активации иммунной системы по ТЬ2-пути, что способствует позднему диагностированию туберкулезной инфекции с последующим формированием грубых фиброзных изменений в легочной ткани.

Табл. 1. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УРОВНЯ ПТАТ {М±т)

П-ль лимф CD3* CD4+ CD16* CD20* CD11Ь JgE CD54* CD23+ TNF-a IL-1(3 IL-4

1-я 2-я 52,2±3,1 44,2±5,5 72,5±2,2 63,6±2,7 42,5±2,2 33,4±2,8 9,8±1,7 13,9±1 12,1 ±1 9,9±1,3 16,3±3,9 22,2±3,5* 460±94 136±81 25,8±5,4 13,3±3,1 7,8±2,7 5,2±1,3 40±28 502±99 146±93 1004±64 311±59 257±86

*-достоверное увеличение, р<0,05

IMMUNOPATHOGENESIS OF LUNG GRANULOMAS IN HUMAN TUBERCULOSIS PATIENTS

Ulrichs T.1’2, Kosmiadi G.A.3, Titukhina M.4, Dallenbach F.5, Mishenko V.3, Gushina N.3, Stein H.5 and Kaufmann S.H.E.1

1 Department of Immunology, Max-Planck-Institute for Infection Biology, Berlin, Germany;

2 Department of Medical Microbiology and Infection Immunology, Institute for Infection Medicine, Freie Universitat, Berlin, Germany;

3Department of Immunology, Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russia;

4Department of Thoracic Surgery, Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russia;

5Institute for Pathology, Freie Universitat, Berlin, Germany

The human tuberculous granuloma and the surrounding lung tissue harbor local immune processes central to the outcome of tuberculosis. This study investigates both mycobacterial load in lesions and spread to different tissue locations. Moreover, we analyzed tissue distribution of immune cells throughout the infected lung in order to get information about different stages of Mycobacterium tuberculosis infection. We found that load and spread of mycobacteria significantly differs between active (open) cavities and organized tuberculomas. Active cavities were consistently surrounded by infected pericavital lung tissue, and mycobacteria were even found in histologically normal peripheral lung tissue. Abundance of mycobacteria correlated with severity of their multi-drug resistance. However, sputum abacillarity did not reflect mycobacterial load in lung tissue. From different lung specimens (i.e. cavity, pericavital, peripheral lung tissue, lymph node, peripheral blood) lymphocytes were isolated and their phenotype and effector functions were investigated. Cavity-surrounding tissue and distant unaffected lung tissue were infiltrated by both CD4+ and CD8+ T cells. Among T cell subpopulations, a high level of CD45RO+ cells was identified. T cells isolated from lung tissue showed a significantly higher level of activation upon stimulation with mycobacterial antigens as compared to peripheral blood lymphocytes. B cells were found forming follicle-like structures in the tissue surrounding the central lesion of the granuloma, neighboring blood and lymphatic vessels.

Taken together, immunohistological analysis of the lung tissue revealed a cell distribution and frequency similar to that found in draining lymph nodes. Our data suggest the establishment of a lymphoid organ-type organization

surrounding granulomas, the immunological focus where the main immune response against M. tuberculosis takes place.

УРОВЕНЬ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ АНТИТЕЛ, КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ЛАТЕНТНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ В ГРУППАХ РИСКА

Яковлева Л.Ф.. Суркова Л.К., Лысенко А.П., Федорович С.В.

Белорусское общество иммунологов и аллергологов.

Цель исследования. Изучение уровня противотуберкулезных антител в группах риска.

Материалы и методы. Для определения противотуберкулезных антител (ПТАТ) использовали иммунофер-ментную тест-систему „ИФА-ТУБ“ производства „НПЦ „Красная капля" (специфичность - 98%, чувствительность

- 68%). Исследовали 153 сыворотки крови лиц из разных групп риска (нетранспортабельные больные, психические заболевания, хронические неспецифические заболевания легких, хронический алкоголизм, сахарный диабет, контакты с туберкулезными больными в учреждениях социального обеспечения, язвенная болезнь желудка, переселенцы из зоны, загрязненной радионуклидами).

Результаты исследований определения уровня противотуберкулезных антител представлены в таблице.

По числу положительных реакций (20,8%) выделялась группа лиц из учреждений социального обеспечения, имевшая контакты с больными с открытой формой туберкулеза. Однако более значимым фактором явилось наличие патологии, протекающей с развитием иммунодефицита, нарушением барьерных функций слизистых оболочек или асоциальным поведением. В таких случаях частота активизации иммунного ответа на антигены возбудителя возрастала в 6,8-14 раз. Обращают внимание высокий уровень ПТ АТ в группе переселенцев из зон загрязненных радионуклидами.

Заключение. У лиц из обследованных групп риска отмечаются значительные нарушения в работе иммунной системы, способствующие развитию туберкулезной инфекции. Полученные данные подтвердили достоверно более высокий уровень иммунного ответа на антигены возбудителя туберкулеза в группах риска как показателя латентной протекающей туберкулезной инфекции. Определение уровня специфических антител может использоваться для углубленного изучения эпидемической ситуации, быть обязательным тестом для выявления лиц с активизирующейся туберкулезной инфекцией и проведения ранней профилактики болезни.

Табл. УРОВЕНЬ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ АНТИТЕЛ В ГРУППАХЛИЦС РАЗНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

Группа лиц Исследовано проб Реагировало положительно

проб %

Нетранспортабельные больные 21 3 14,3

Психические заболевания 17 5 29,4

Хронические неспецифические заболевания легких 10 2 20

Хронический алкоголизм 19 4 21,1

Сахарный диабет 4 1 25

Язвенная болезнь желудка 16 4 25

Контакты с туберкулезными больными в учреждениях социального обеспечения 24 5 20,8

Переселенцы из зоны, загрязненной радионуклидами 42 7 16,7