CC BY
238© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Т.А.Полунина, М.Н.Киреев, Т.А.Храмченкова, А.Н.Спицын, Г.В.Григорьева МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В МЕДИЦИНЕ И БИОТЕХНОЛОГИИ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Дана история развития и совершенствования тандемной масс-спектрометрии, возможности ее применения на современном этапе в различных областях медицины и биотехнологии, включая производство новых лекарственных препаратов, идентификацию биологически активных веществ, патогенных микроорганизмов и возбудителей особо опасных инфекций.
Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 112—119
Ключевые слова: тандемная масс-спектрометрия, фармакология; идентификация биологически активных веществ, патогенных микроорганизмов и возбудителей особо опасных инфекций
T.A.Polunina, M.N.Kireev, T.A.Khramchenkova, A.N.Spitsyn, G.V.Grigorieva MASS SPECTROMETRY IN MEDICINE AND BIOTECHNOLOGY
Russian Research Institute of Plague Control Micrab, Saratov, Russia
History of development and improvement of tandem mass spectrometry, possibilities of its application at the contemporary stage in various fields of medicine and biotechnology including production of novel medicinal preparations, identification of biologically active substances, pathogenic microorganisms and causative agents of especially dangerous infections is given.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 112—119
Key words: tandem mass spectrometry, pharmacology; identification of biologically active substances, pathogenic microorganisms and causative agents of especially dangerous infections
Сегодня в рамках биотехнологии объединены проекты разработки более совершенных методов диагностики и лечения болезней, а также поиск новых лечебных и профилактических препаратов. Однако биотехнологии работают со сложными смесями биологически активных веществ в широком диапазоне концентрации, что требует аппаратуры, способной обеспечить высокую чувствительность, достоверность, быстроту анализов, а также совместимость с различными методами разделения. При решении этих задач масс-спектрометрия (МС) играет ключевую роль как наиболее эффективный аналитический метод [1, 3, 11, 21].
Масс-спектрометрия — это физический метод, основанный на измерении массы заряженных частиц. В отличие от других аналитических физико-химических методов, где детектируется излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, в МС измеряется соотношение массы и заряда частицы (m/z).
Принцип метода заключается в том, что вначале нейтральные частицы (атомы или молекулы) вещества превращают в заряженные частицы — ионы, вид и количество которых или их фрагментов характерны для данной молекулы и зависят от ее структуры. Затем ионы разделяют в пространстве в соответствии с их массой посредством электрического или магнитного поля. Измеряя электрический ток, образуемый направленно движущимися ионами, судят об атомарном и молекулярном составе анализируемого вещества.
Таким образом, МС можно рассматривать как совокупность двух отдельных процессов — ионизации и разделения заряженных частиц по отношениям их массы к заряду с последующей регистрацией их масс-спектров [13].
В 2002 г. были разработаны два новых метода мягкой ионизации (электроспрей и матрично активированная лазерная десорбция), дающих возможность перевести в газовую фазу многие органические вещества без разрушения ковалентных связей. Это открытие было отмечено Нобелевской премией по химии.
При ионизации в электроспрее (ESI) образование ионов идет за счет распыления анализируемого вещества с растворителем под давлением вместе с разогретым газом (азотом) из узкого капилляра в присутствии сильного электрического поля при атмосферном давлении.
Вариантом ESI является химическая ионизация (APCI) при атмосферном давлении, дающая меньшую фрагментацию, когда потенциал прикладывается не к игле, через которую поступает жидкость, а к электроду в области распыления, что приводит к образованию коронного разряда.
При матрично активированной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) анализируемое вещество сокристаллизируется с матрицей, представляющей собой легко летучую слабую органическую кислоту, одновременно являющуюся источником протонов. При облучении полученных кристаллов короткими лазерными импульсами происходит совместный переход образца и матрицы в газообразное состояние [11].
К началу 90-х годов методы MALDI и ESI полностью заменили своих предшественников, кроме того, в это время создается ряд тандемных или многостадийных приборов, ориентированных на особенности этих методов, которые позволили значительно увеличить чувствительность и расширить диапазон анализируемых соединений.
Первые модели масс-спектрометров отличались громоздкостью, высокой стоимостью и относительно низким разрешением. В 1967 г. профессор Стэндфордского университета Р. Финниган создал первый (хромато) масс-спектрометр с квадрупольным анализатором. Квадруполь представляет собой 4 стержня, к которым попарно в противоположной полярности подается определенная комбинация постоянного и радиочастотного переменного напряжения. Ионы, влетающие параллельно оси этих стержней, попадают в гиперболическое поле и в зависимости от отношения их массы к заряду и частоты пропускаются этим полем дальше или нет. В 1983 г. тем же Р. Финниганом была создана ионная ловушка, в которой одна пара стержней закручена в кольцо, а вторая — превратилась в шарообразные чашки. При этом комбинация радиочастотного и постоянного напряжения, прикладываемого к электродам ионной ловушки, позволяет удерживать внутри нее интересующие ионы, которые подвергают управляемой фрагментации. Это позволило проводить эксперименты в улучшенном режиме, при котором регистрируется более интенсивный массовый спектр по сравнению с режимом тройного квадруполя.
Для повышения качества МС анализа сложных смесей тройной квадруполь был модифицирован, при этом последний масс-фильтр Q3 был заменен на ортогональный времяпролетный анализатор (Q-TOF). Принцип действия прибора заключается в том, что ионы из источника разгоняются электрическим полем, приобретая достаточно большую кинетическую энергию, и вылетают в бесполевое пространство. В зависимости от массы ионы двигаются с разной скоростью и соответственно в разное время достигают детектора, находящегося в конце трубы их пролета. Современные тандемные времяпролетные масс-спектрометры, совмещенные с MALDI, позволяют работать со слабо очищенными образцами, поскольку метод MALDI мало чувствителен к примесям буферов, солей и полимеров из гелей. Кроме того, метод допускает использование роботов для приготовления проб на поверхности, например для коллектора фракций, вырезания пятен из двумерных гелей, ферментативного гидролиза в пробирках и быстрого обессоливания в насадках дозаторов.
Недавно разработан масс-анализатор на основе ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (FTMS), где ионы влетают в сильное магнитное поле и вращаются там по циклическим орбитам. У такого анализатора очень высокое разрешение (от 100 тыс. до 1 млн), широкий диапазон измеряемых масс и возможность определять последовательность аминокислотных остатков в пептидах и белках без предварительного гидролиза. Тандем линейной ловушки и МС с Фурье-трансформацией обладает наиболее мощным набором аналитических характеристик. К недостаткам прибора относятся большой размер, низкая скорость записи спектров и относительно высокая стоимость, т.к. для его работы необходимо использование сильного магнита со сверхпроводящим соленоидом, для функционирования которого необходим жидкий гелий при t° —270°C [3, 11, 14, 21].
Тандемная или многостадийная масс-спектрометрия (МС-МС) используется для структурного анализа и идентификации веществ в составе смесей.
Метод состоит из этапов: 1) разделение в первой МС-ступени первичных или родительских ионов и селекция ионов с единственным значением отношения m/z; 2) фрагментация этих ионов с образованием разнообразных вторичных или дочерних структурно значимых фрагментов; 3) масс-анализ дочерних ионов.
Таким образом, при МС-МС в каждый момент времени из всех ионов, образующихся в источнике, для последующей фрагментации отбираются ионы только одного соединения с заданным масс-зарядовым отношением.
Анализ сложных смесей МС-МС требует пробоподготовки и возможен в результате развития таких методов разделения как ПААГ-SDS и двумерный (2D) гель-электрофорез, газовая и жидкостная хроматография.
В 2D электрофорезе белки разделяются в одном направлении по заряду в соответствии с градиентом pH (при использовании полосок с иммобилизированными буферами), в другом
8. ЖМЭИ 5 № 5186
113
направлении — по подвижности в электрическом поле. В 2D-гелях возможно разделение нескольких тысяч белков, которые окрашиваются серебром или с помощью особого реактива Sypra Ruby. Исследуемое пятно вырезают, с белка удаляют краситель, денатурируют, восстанавливают (разрывая дисульфидные мостики) и подвергают ферментативному гидролизу трипсином. Фермент разрывает пептидные связи в области аминокислот лизина или аргинина и переводит белки в хорошо предсказуемые фрагменты — триптические пептиды, которые экстрагируют из геля с помощью растворителей и вводят в масс-спектрометр.
По сравнению с 2D электрофорезом применение жидкостной хроматографии (ЖХ) позволяет улучшить ряд параметров. Если при 2D электрофорезе разделение на множество пятен может протекать до 2 суток, то длительность ЖХ-разделения составляет 1 — 2 часа. Однако разделительная способность ЖХ существенно ниже, поэтому в случае сложной смеси необходимо проводить многостадийное разделение. Так, на первой стадии смесь белков разделяют аффинной или ионообменной хроматографией на фракции, затем интересующую фракцию белков подвергают трипсическому гидролизу до пептидов, которые, в свою очередь, разделяются ЖХ с обращенной фазой. Далее смесь пептидов анализируют в тандемном МС-МС с ионизацией электроспреем.
При газовой (ГХ) хроматомасс-спектрометрии образец (исследуемая газовая смесь) смешивается с газом-носителем (обычно гелий) на входе в хроматограф. Смесь проходит через длинную капиллярную хроматографическую колонку, причем скорость диффузии компонентов смеси зависит от их химической природы, поэтому из хроматографа порции разделенных компонентов смеси поступают последовательно одна за другой в масс-спектрометр. Таким образом, получается набор масс-спектров, каждый из которых соответствует индивидуальному компоненту смеси [3].
Для идентификации белков средствами МС-анализа стандартом является методика, получившая название peptide mass fingerprinting, PMF [41], основанная на том, что набор пептидов, полученных ферментативным гидролизом, уникален для каждого белка подобно отпечаткам пальцев человека. Суть метода в том, что для каждого белка с известной последовательностью рассчитываются теоретические массы пептидов с учетом возможных модификаций. Далее фактический масс-спектр продуктов гидролиза определяемого белка сравнивается со всеми теоретическими спектрами белков таких поисковых программ как Mascot [42], Sequest [30], Tandem [28], и выдается список белков по мере убывания степени соответствия. Эта оценка всегда носит вероятностный характер и поэтому никогда не достигает 100 %. Для представления результатов 2D-электрофореза используется собственное программное обеспечение и базы данных ProteographTM и ROSET-TATM [32, 38].
Вопрос выбора базы данных для сопоставления данных масс-спектрометрического эксперимента — это всегда компромисс между надежностью и полнотой информации. Одной из самых надежных баз, содержащей информацию примерно о 190 000 аминокислотных последовательностях белков, является SWISS-PROT [26], курируемая группой Швейцарского института биоинформатики. Все данные базы тщательно верифицированы, включают информацию о вариациях структуры и функциях белка в организме, ссылки на публикации и многое другое. Базы TREMBL и PIR-PSD [27] содержат информацию о миллионах последовательностей и составляются автоматически, как правило, из гипотетических данных, предоставленных исследователями. Поскольку исследования белков ведутся сразу во многих научных центрах, информация при передаче в базу данных проходит автоматическую проверку и аннотацию. Базы данных, проверенные таким способом, например NCBInr, называются неизбыточными и гарантируют, что для каждого белка есть только одна последовательность [33].
Кроме белковых баз данных при обработке данных масс-спектрометрии могут быть использованы и генетические, например EST, Expressed Sequence Tags [40], содержащие последовательности, полученные на основе матричных РНК. Однако идентификация белков по этой информации осложняется неопределенностью рамки считывания, сложным механизмом трансляции белковой последовательности и другими факторами. Наиболее полный список биологических баз данных разного назначения можно найти в электронном каталоге DBCat [29].
Сегодня без масс-спектрометрии немыслима разработка и контроль производства новых лекарственных и профилактических препаратов, биохимические исследования, контроль за распространением токсинов, наркотических и психотропных средств, анализ взрывчатых веществ.
Тандемная масс-спектрометрия в сочетании с ГХ и ЖХ оказалась более эффективной на всех стадиях фармацевтических исследований и заменила используемые ранее методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР), оптической и ИК-спектроскопии. Раньше большинство лекарств экстрагировали из натуральных источников (например, пенициллин), экстракты разделяли на фракции и выбирали из них наиболее активные и менее токсичные. По мере развития аналитической техники удалось определить активные начала этих фракций, идентифицировать химические формулы, синтезировать, определить их активность и токсичность на
определенном наборе биологических тестов. На этой стадии масс-спектрометрия используется не только как инструмент по контролю результата, но и как инструмент поиска. На следующей стадии проводят предварительные испытания на культурах клеток и мышах, кроме того, определяют химические свойства соединения и его метаболиты в биосредах. Определение метаболизма лекарств является важным анализом, при котором эффективны (LC-MS-MS)-методы, чаще всего с использованием 3-Q прибора. На стадии клинических испытаний проводят количественный анализ метаболизма и накопления лекарств в органах нескольких сот пациентов (LC-MS-MS), что совмещают с общими клиническими исследованиями терапевтического эффекта, возможными побочными действиями и определяют оптимальную дозу препарата. После утверждения лекарства проводят оптимизацию его производства, определение микропримесей и контроль качества методами GC-MS и LC-MS [3].
Применение методов протеомики позволяет решить еще одну из задач фармакологии — определение участков связывания лекарственного препарата на изучаемом белке крови как в случае электростатических взаимодействий белок — лиганд, так и в случае образования кова-лентных связей. При исследовании возможности взаимодействия ацетилсалициловой кислоты (АСК) с очищенным глобином человека и крысы in vitro методом MALDI-ТОF было показано, что глобин крысы способен модифицироваться АСК по аминокислотным остаткам К-17 и К-57 в а-субъединице и по К-96 в ß-субъединице, а глобин человека — по К-17, К-41, К-57 в а-субъединице и К-18, К-121 в ß-субъединице [7].
Недавно появившийся метод масс-спектрометрии DART (прямой анализ в реальном времени) сразу привлек внимание исследователей, так как не требует пробоподготовки. Метод позволяет проводить сверхбыструю идентификацию низкомолекулярных компонентов любых объектов, которые вносят пинцетом (твердые образцы) или палочкой (жидкие образцы) в ионный источник DART, где происходит испарение и ионизация вещества. Через несколько секунд на мониторе компьютера регистрируется масс-спектр полученных ионов. Наиболее широкое применение метод МС-DART нашел в анализе фармацевтических субстанций: контроль прохождения органического синтеза новых препаратов, идентификации запрещенных лекарственных веществ в продуктах питания, контроль качества лекарственных препаратов [23].
Масс-спектрометрия в комбинации с ГХ зарекомендовала себя как надежный метод контроля загрязнений окружающей среды различными хлорорганическими соединениями, пестицидами, фенолами и др. [13].
Для ретроспективной диагностики воздействия на человека отравляющих веществ (ОВ), таких как сернистый иприт (HD) и фосфорорганические соединения (ФОС), предложена универсальная методика выделения и идентификации MALDI-ТОF пептидов сывороточного альбумина, модифицированных HD и ФОС [4,10].
У больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом выявлена взаимосвязь между концентрацией микроэлементов в плазме крови, которую определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS; Elan-9000, PerkinElmer, США) и атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES; 0ptima-2000 DV, PerkinElmer, США), и уровнем циркулирующих цитокинов [22].
Масс-спектрометрия эффективна для исследования широкого спектра БАВ (белков, коротких пептидов, олигосахаридов, олигонуклеотидов, липидов), позволяющих идентифицировать бактерии, вирусы и грибы, так как отличается высокой чувствительностью (1 — 10 нг), экс-прессностью (анализ 1 пробы — 1 — 5 мин) и требует минимального количества исследуемого материала (1 — 10 мкл).
Диагностика заболевания может основываться на обнаружении нарушения метаболизма, вызванного конкретной болезнью, которая приводит к изменению количественного содержания некоторых веществ, называемых биомаркерами. Методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) отработана методика определения в биологическом материале концентраций химических маркеров микроорганизмов (например, 10-оксистеариновой кислоты для Clostridium perfringens и 2-гидроксилауриновой кислоты для Pseudomonas aeruginosa) для получения информации о составе инфекции при гангренозно-перфоративном аппендиците [2]. MALDI-МС эффективно использовали для диагностики заболеваний и предрасположенности к ним на основании определения биомаркеров как факторов риска. Показано, что сывороточный амилоид А является маркером при диагностике рака яичников [15], а по данным L. Anderson [24] около 177 белков плазмы крови можно использовать в качестве диагностических маркеров при сердечно-сосудистых заболеваниях и нарушении мозгового кровообращения. Одним из способов подготовки проб является использование MALDI-TOF картриджей, которые специфично связывают от 6 до 80 белков или пептидов, после сорбции картридж помещают в MALDI-ТОF масс-спектрометр. Так, с помощью мультикомпонентного МС-анализа можно одновременно охарактеризовать комплекс протеинов, например, содержание в биологических жидкостях всех диагностически значимых онкомаркеров, а сопоставление количественных параметров масс-спектров белков в динамике может быть методом оценки эффективности терапии [21].
С помощью протеомных методов анализа, включающих энзиматическое расщепление белков образца, ЖХ-МС/МС и поиск белков в базе данных SwissProt, получена информация о локализации и функциях 147 уникальных белков внутренней мембраны митохондрий сердца Bos taurus [19]. Усовершенствованный метод 2D-электрофореза и МАLDI-ТОF успешно применен для изучения экспрессии 25 белков в кардиомиоцитах крыс при гипертрофии сердца, вызванной воздействием агонистов адренергических рецепторов а- и ß-типов [17].
МАLDI-МС незаменима при анализе токсинов пептидной природы, продуцируемых бактериями, некоторыми растениями, насекомыми, членистоногими, змеями [7], а также пептидов мха Physcomitrella patens [20]. В сочетании с Ш-электрофорезом МАLDI-ТОF изучен белковый профиль эмбрионов рыб вида Danio rerio как альтернативной модели для исследования токсичности лекарственных препаратов в связи с высокой степенью соответствия между геномами рыб и человека [8].
С помощью многопараметрического типирования, включающего этапы разделения белков с помощью 2D-электрофореза и их идентификации МАLDI-ТОF, получены протеомные карты клинических изолятов патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих развитие язвенной болезни и злокачественных новообразований желудка и двенадцатиперстной кишки [5]. Также с помощью протеомной характеристики МАLDI-ТОF проведена быстрая идентификация и внутривидовая классификация микроорганизмов Neisseria gonorrhoeae [12].
Методы протеомики позволяют исследовать структурные особенности антигенов патогенных микроорганизмов, включая возбудителей особо опасных инфекций. У всех грамотрицательных бактерий специфичность определяется тонкой структурой О-специфического полисахарида (О-ПС), входящего в состав липополисахарида (ЛПС) — основного компонента внешней мембраны клеточной оболочки. О-ПС построен из линейных или разветвленных повторяющихся олигосахаридных звеньев, содержащих чаще от двух до шести моносахаридных остатков, кроме того, может содержать неуглеводные компоненты, такие, как аминокислоты, ацетали пирови-ноградной кислоты, эфиры молочной кислоты, фосфатные и О-ацетильные группы [9].
Полная структура гексасахаридного повторяющегося звена О-ПС, полученного мягкой кислотной деградацией ЛПС бактериальных клеток Providencia alcalifaciens O46, установлена при изучении ГХ-МС на приборе TermoQuest Finnigan (модель Trace GC 2000), оснащенном колонкой ЕС-1, и ЯМР-спектроскопией [18].
Современный масс-спектрометр Apex Qe (США) с ионизацией электроспреем и ионцикло-тронным резонансом с преобразованием Фурье (FTMS), снабженный магнитом 7Т и источником ионов «Apollo II Dual», был использован для исследования строения ЛПС нокаутного мутанта вакцинного штамма Francisella tularensis. Показано, что мутантный штамм не синтезировал заметного количества ЛПС с высокомолекулярным О-ПС, что явилось результатом нарушения биосинтеза повторяющегося звена, заключающегося в потере способности включать в него формильную группу [16]. Эффективный и чувствительный анализ в режиме многоступенчатой фрагментации масс (MSn) на платформе MALDI-LIT-MS в вакуумной установке был применен для определения структуры нескольких редко встречающихся видов липида А, присутствующих у ЛПС F. tularensis, F. novicida и F. philomiragia, которые ранее не были охарактеризованы. Обнаружено, что большинство видов минорных липидов А состоят из множества изотопов с ацильными цепями различной длины, кроме того, небольшая часть этих видов липида А может быть модифицирована гексозой, гексозамином или выявленным ранее галак-тозамином [44].
Строение и температурозависимые структурные вариации ЛПС штаммов Yersinia pestis КМ218, КМ260(11), KIMD1 и мутанта EV1^, относящихся к основному подвиду (ssp. pestis), а также штаммов 1146, 1680p (ssp. caucasica) и И-2377 (ssp. altaica) были исследованы химическими методами, ЯМР-спектроскопией и FTMS на приборе Apex Qe. Установлены структуры олигосахарида кора, липида А, подтверждено отсутствие боковых цепей О-антигена в ЛПС, а также выявлены внутривидовые структурные различия в строении ЛПС штаммов Y. pestis, выращенных при 25°С и 37°С [6, 35, 46]. Новым методом биотинилирования с использованием гранул, меченных NeutrAvidin, и LC-MS-MS также исследованы некоторые поверхностные белки Y. pestis [39]. С помощью ESI-TOF, позволяющей сохранить растворенный протеин в нативном состоянии, получены новые данные о стехиометрическом составе и упаковке субъединиц капсульного антигена F1 Y. pestis. Показано, что антиген по массе соответствует 7- и 14-членным молекулам, которые взаимодействуют с соседними субъединицами за счет 1 — 4 поверхностных боковых цепей [45].
Для лучшего понимания роли токсин-корегулируемых пилей (TCP) в патогенезе холеры при помощи масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обмена и компьютерного моделирования охарактеризована их структура. TCP — это длинные тонкие гибкие нити, состоящие из субъединиц TcpA. Показано, что чрезвычайная их гибкость объясняется тем, что субъединицы пилина удерживаются вместе благодаря плотной упаковке N-концевых а-спиралей [37].
MALDI-TOF также применяется как быстрый и эффективый метод идентификации возбудителей ООИ.
Отработана методика быстрой идентификации и типирования Y pestis от других видов Yersinia путем определения профиля специфического белка. На первом этапе была создана база данных из 39 штаммов рода Yersinia, представляющих 12 различных видов, включая 13 изо-лятов Y pestis биоваров antiqua, medievalis и orientalis. Микроорганизмы предварительно инак-тивировали этанолом, размещали на пластине MALDI-TOF, через 6 мин получали уникальный профиль белка для каждого вида Yersinia. На втором этапе анализа дифференцировали Y. pes-tis на уровне вида и биотипа путем сравнения профилей белков изолятов Y. pestis и Y. entero-colitica с базой данных [25].
MALDI-TOF также успешно применяется для определения микроорганизмов рода Brucella из агаровых и бульонных культур после создания референс-профилей для базы данных Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics, Germany) штаммов, принадлежащих к B. melitensis биотипы 1,2 и 3; B. abortus биотипы 1,2,5 и 9; B. suis, B. canis, B. ceti и B. рinnipedialis [31].
Параллельно с секвенированием гена 23S rRNA как эталонного метода выявления штаммов рода Francisella проведена быстрая идентификация MALDI-TOF 50 различных штаммов F tularensis на уровне видов и подвидов при помощи измерения массы пептидов и небольших белков целых клеток. Предварительно созданная база данных включала спектры специфических белков для штаммов рода F. philomiragia, F. tularensis подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida [43].
Составлена база данных масс-спектров бесспоровых клеток 374 штаммов Bacillus и родственных видов, включающих 102 штамма B. anthracis и 121 штамм B. œreus, с помощью MALDI-TOF и искусственных нейронных сетей (ANNs) [36].
Сегодня масс-спектрометрию рассматривают как наиболее быстрый и информативный метод протеомного анализа. Однако лимитирующим звеном в развитии протеомики являются не собственно методы идентификации белков, а биоинформатика [1]. Так, без соответствующего анализа последовательностей белковых молекул, без их декодирования протеомный анализ является просто цепочкой аминокислотных остатков. Поэтому создание эффективных алгоритмов, позволяющих анализировать существующие базы данных и создавать новые, содержащие информацию о структурно-функциональных характеристиках белков, сегодня является основным достижением. Однако в настоящее время такие быстро развивающиеся области науки как геномика и протеомика активно курируются коммерческими фирмами, а биоинформатика по-прежнему сохраняет свои ведущие позиции в рамках государственных структур.
Л ИТЕРАТУРА
1. Арчаков А.И. Что за геномикой?- Протеомика. Вопр. мед. химии. 2000; 4: 335-343.
2. Бойко Н.Б., Осипов Г.А., Белобородова Н.В., Курчавов В.А. Сравнительное хроматомасс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и перитонеальном экссудате брюшной полости при гангренозно-перфоративном аппендиците. Инф. в хирургии. 2009; 2: 58-62.
3. Веренчиков А.Н., Краснов Н.В., Галль Л.Н. Тандемные масс-спектрометры в биохимии. Науч. приборостроение. 2004; 14 (2): 4-23.
4. Гладилович В.Д., Краснов И.А., Подольская Е.П. и др. Идентификация пептидов сывороточного альбумина, модифицированных фосфорорганическими соединениями, с применением методов хроматографии и масс-спектрометрии. Науч. приборостроение. 2010; 20 (4): 84-92.
5. Говорун В.М., Мошковский С.А., Тихонова О.В. и др. Сравнительная характеристика протеомных карт клинических изолятов Helicobacter pylori. Биохимия. 2003; 68 (1): 52-60.
6. Дентовская С.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М. и др. Структурное разнообразие и эндотоксическая активность липополисахарида Yersinia pestis. Биохимия. 2008; 73 (2): 237-246.
7. Дубровский Я.А., Гладилович В.Д., Подольская Е.П. и др. Взаимодействие глобина крысы и человека с ацетилсалициловой кислотой in vitro: масс-спектрометрическая идентификация ацети-лированных лизинов. Науч. приборостроение. 2010; 20 (4): 71-76.
8. Кисриева Ю.С., Петушкова Н.А., Чернобровкин А.С. и др. Исследование белкового профиля эмбрионов рыб вида Danio rerio с использованием одномерного электрофореза и масс-спектрометрии. Биомед. химия. 2011; 57 (6): 593-603.
9. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Структура О-специфических полисахаридов. Биохимия. 1994; 59 (12): 1847-1851.
10. Краснов И.А., Подольская Е.П., Гончаров Н.В. и др. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии. Науч. приборостроение. 2008; 18 (4): 46-53.
11. Краснов Н.В., Лютвинский Я.И., Подольская Е.П. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в протеомном анализе. Науч. приборостроение. 2010; 20 (4): 5-20.
12. Кубанова А.А., Говорун В.М., Ильина Е.Н. и др. Первый опыт применения метода прямого
белкового профилирования для идентификации и типирования N. gonorrhoeae. Вестник дерма-тол. и венерол. 2006; 5: 25-29.
13. Лебедев А.Т Масс-спектрометрия в органической химии. М., БИНОМ, 2003.
14. Лебедев А.Т., Заикин В.Г. Задачи и достижения современной масс-спектрометрии. Заводская лаборатория диагн. материалов. 2007; 73 (2): 21-29.
15. Манойлов А.В., Торопыгин И.Ю., Козьмин Ю.П. и др. Клиническая протеомика: новые диагностические возможности масс-спектрометрии. Науч. приборостроение. 2008; 18 (4): 16-23.
16. Мокриевич А.Н., Кондакова А.Н., Валаде Э. и др. Биологические свойства и строение липопо-лисахарида вакцинного штамма Francisella tularensis, полученного при инактивации гена системы «чувства кворума». Биохимия. 2010; 75 (4): 539-548.
17. Нин Л., Кей-чжен Г., Юань-бинь Ц., Цзыцзянь Л. Применение методов протеомики для идентификации белков, экспрессирующихся в кардиомиоцитах при гипертрофии сердца, вызванной воздействием агонистов адренергических рецепторов а- и ß-типов. Биохимия. 2011; 76 (10): 1398-1406.
18. Овчинникова О.Г., Кочарова Н.А., Шашков А.С. и др. Антигенные полисахариды бактерий. Структура О-специфического полисахарида бактерии Providentia alcalifaciens О46. Биоорганическая химия. 2009; 35 (3): 408-413.
19. Поляков Н.Б., Барылюк К.В., Франкевич В.Е., Гринкевич В.А. Протеомный анализ митохондрий сердца Bos taurus.1. Использование методов протеомики для идентификации трансмембранных доменов белков внутренней мембраны митохондрий. Биоорганическая химия. 2009; 35 (1): 4054.
20. Скрипников А.Ю., Аниканов Н.А., Казаков В.С. и др. Поиск и идентификация пептидов мха Physcomitrella patens. Биоорганическая химия. 2011; 37 (1): 108-118.
21. Титов В.Н., Дугин С.Ф., Крылин В.В. Протеомика, метаболомика и будущее клинической лабораторной диагностики (лекция). Клин. лаб. диагн. 2007; 1: 23-34.
22. Хасанова Г.М. Взаимосвязь уровня циркулирующих цитокинов и микроэлементов у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом. Саратовский науч.-мед. журн. 2011; 7 (4): 863-865.
23. Чернецова Е.С., Абрамович Р.А. Масс-спектрометрия DART: быстрый скрининг таблетирован-ных лекарственных препаратов на наличие действующего начала. Вестник Росздравнадзора. 2010; 2: 51-53.
24. Anderson L. Candidate-based proteomics in the search for biomarkers of cardiovascular disease. J. Physiol. 2005; 563 (1): 23-60.
25. Ayyadurai S., Flaudrops C., Raoult D., Drancourt M. Rapid identification and typing of Yersinia pestis and other Yersinia species by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass-spectrometry. BMC Microbiol. 2010; 12 (10): 7.
26. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000. Nucleic Acids Res. 2000; 28 (1): 45-48.
27. Bairoch A., Apweiler R., Wu C.H. et al. The Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 2005; 33 (1): 154-159.
28. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 2004; 20 (9): 1466-1467.
29. Discala C., Benigni X., Barillot E., Vaysseix G. DBcat: a catalog of 500 biological databases. Nucleic Acids Res. 2000; 28 (1): 8-9.
30. Eng J.K., McCormack A.L., Yates III J.R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. JASMS. 1994; 5 (11): 976-989.
31. Ferreira L., Vega Castano S., Sanchez-Juanes F. et al. Identification of Brucella by MALDI-TOF mass spectrometry. Fast and reliable identification from agar plates and blood cultures. PLoS One. 2010; 6: 5 (12): е l4235-e 14243.
32. Grouford M.E., Cusick M.E., Garrels J.I. In: Proteomics: A trends guide. Blackstock W., Mann M. ^d). Elsevier Science, 2000, p. 17-21.
33. Holm L., Sander C. Removing near-neighbour redundancy from large protein sequence collections. Bioinformatics.1998; 14 (5): 423-429.
34. Jiang J., Parker C.E., Fuller J.R. et al. An immunoaffinity tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for detection of Francisella tularensis. Anal. Chem. Acta. 2007; 12; 605 (1): 70-79.
35. Knirel Y.A., Linder B., Vinogradov E.V. et al. Temperature-dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopolysaccaride of Yersinia pestis. Biochemistry. 2005; 44: 1731-1743.
36. Lasch P., Beyer W, Nattermann H. et al. Identification of Bacillus anthracis by using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and artificial neural networks. Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (22): 7229-7242.
37. Li J., Lim M.S., Li S. et al. Vibrio cholerae toxin-coregulated pilus structure analyzed by hydrogen/ deuterium exchange mass spectrometry. Structure. 2008; 16 (1): 137-148.
38. Lueking A., Horn M., Eickhoff H. et al. Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Anal. Biochem. 1999; 270 (1): 103-111.
39. Myers-Morales T, Cowan C., Gray M. et al. A surface-focused biotinylation procedure identifies the
Yersinia pestis catalase KatY as a membrane-associated but non-surface-located protein. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73: 5750-5759.
40. Neubauer G., King A., Rappsilber J. et al. Mass spectrometry and EST-database searching allows characterization of the multi-protein spliceosome complex. Nat. Genet. 1998; 20 (1): 46-50.
41. Pappin D.J., Hojrup P., Bleasby A.J. Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. Curr.Biol. 1993; 3 (6): 327-332.
42. Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 1999; 20 (18): 3551-3567.
43. Seibold E., Maier T, Kostrzewa M. et al. Identification of Francisella tularensis by whole-cell matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: fast, reliable, robust and cost-effective differentiation on species and subspecies levels. J. Clin. Microbiol. 2010; 48 (4): 1061-1069.
44. Schilling В., McLendon M.K., Phillips N.J. et al. Characterization of lipid A acylation patterns in Francisella tularensis, Francisella novicida and Francisella philomiragia using multiple-stage mass spectrometry and matrix-assisted laser desorption /ionization on an intermediate vacuum source linear ion trap. Anal. Chem. 2007; 79 (3): 1034-1042.
45. Tito M.A., Miller J., Griffin K.F. et al. Macromolecular organization of the Yersinia pestis capsular Fl antigen: insights from time of flight mass spectrometry. Protein Sci. 2001; 10 (11): 2408-2413.
46. Vinogradov E.V., Linder B., Kocharova B.A. et al. The core structure of the lipopolysaccaride from the causative agent of plague Yersinia pestis. Carbohydr.Res. 2002; 337: 775-777.
Поступила 12.03.13
Контактная информация: Полунина Т.А.,
410005, Саратов, ул. Университетская, 46, р.т. (8452)51-52-11
©А.П.ЧЕРДАНЦЕВ, 2013 А.П.Черданцев
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГРИППА У БЕРЕМЕННЫХ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ
Ульяновский государственный университет
Анализ заболеваемости беременных гриппом показывает высокую частоту тяжелых вариантов течения инфекции с фатальным исходом. Наибольшее число осложнений гриппа приходится на женщин в случае инфицированности их в третьем триместре беременности, а также имеющих отягощенный преморбидный фон в виде бронхиальной астмы, ожирения и сахарного диабета. Показано, что здоровые женщины, находящиеся на третьем триместре беременности, имеют такой же риск по тяжелому течению респираторной инфекции, как и небеременные женщины с хронической сопутствующей патологией. Вакцинация против гриппа беременных имеет хорошо доказанную безопасность и эффективность. Использующиеся современные вакцины позволяют с высокой достоверностью уменьшить риск развития акушерской и педиатрической патологии, связанной с перенесенным гриппом.
Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 119—126
Ключевые слова: грипп, беременные, вакцинопрофилактика
A.P.Cherdantsev
EPIDEMIOLOGIC FEATURES OF INFLUENZA IN PREGNANT WOMEN AND POSSIBILITIES OF VACCINE PROPHYLAXIS
Ulyanovsk State University, Russia
Analysis of influenza morbidity in pregnant women shows high frequency of severe variants of infection course with fatal outcome. The highest number of influenza complications accounts for women in the case of their infection in the 3rd trimester of pregnancy, as well as having complicated pre-morbidity background in the form of bronchial asthma, obesity and diabetes mellitus. Healthy women at the 3rd trimester of pregnancy were shown to have the same risk of complicated course of respiratory infection as non-pregnant women with chronic concomitant pathology. Vaccination against
