CC BY
65УДК 577.21:631.527
А.М. Кудрявцев
МАРКЕР-ОПОСРЕДОВАННАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ
Учреждение российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва
Стремительное развитие молекулярной генетики в последние полтора-два десятилетия, связанное, в первую очередь, с технологическим прорывом в области секвенирования геномов высших организмов, позволило уже сейчас применять на практике такие методы работы с биологическими объектами, о которых совсем недавно еще не приходилось и мечтать. В 2004 году был завершен крупномасштабный проект «Геном человека», связанный с расшифровкой полной нуклеотидной последовательности ДНК человека, а уже в 2005 году финишировал проект «Геном риса», позволивший прочитать и выстроить нуклеотидную последовательность ДНК этого вида, состоящую из более чем 450 млн. пар оснований (Matsumoto Т., J. Wu, Н. Капатоп, et al, 2005). Не менее интенсивно ведутся работы с геномами других важнейших видов сельскохозяйственных растений, постоянно стартуют новые проекты. Так по данным сайта NCBI к октябрю 2008 года были в той или иной степени закончены четыре проекта полного секвенирования геномов высших растений (арабидопсис, рис, люцерна и тополь), девять же проектов находились в стадии реализации. Уже к марту 2009 году по данным того же сайта законченных проектов стало 14, а в стадии выполнения - 48 (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/). Для большинства важнейших сельскохозяйственных видов созданы подробные генетические карты, на которые нанесены сотни молекулярно-генетических маркеров. Многие из этих данных находятся в свободном, публичном доступе, еще больше данных по генетическим маркерам можно получить на специально оговоренных условиях и для коммерческого использования. Этот последний факт свидетельствует сам за себя: генетические маркеры начинают все шире использовать в практике и, в первую очередь, с целью применения их как нового и многообещающего инструмента
в селекционных программах. Для такого нового подхода в селекции в англоязычной научной литературе был выработан специальный термин- Marker assisted selection (MAS), для которого еще нет устоявшегося русского эквивалента, но мы в своих работах предпочитаем использовать термин Маркер - опосредованная селекция (МОС). Раскрывая этот термин, попытаемся дать определения самому понятию, которое соответствовало бы общепринятым взглядам. Итак: Маркер — опосредованная селекция — это метод селекции при котором отбор нужных признаков и индивидуумов ведется не по морфотипу организма, но непосредственно по генотипу. Селекционер опирается не на морфологические признаки, но на данные, полученные при анализе полиморфизмов ДНК в районах генов, детерминирующих проявление хозяйственного признака, или, иными словами, на маркеры. К наиболее используемым в настоящее время в МОС полиморфизмам и маркерам относятся:
1. Однонуклеотидный или точечный полиморфизм (SNP-маркеры).
2. Инсерционно-делеционный полиморфизм (INDEL-маркеры).
3. Полиморфизм копийности геномных сегментов (CNP-маркеры).
4. Вариабельное число тандемных повторов (SSR-маркеры).
Полиморфизмы 1-3 типов - целевые маркеры селекции: могут влиять и на наличие /отсутствие признака и на степень его выраженности (маркер может находиться непосредственно внутри гена). Полиморфизм 4 типа, как правило, не влияет на наличие / отсутствие признака, но изредка может влиять на уровень его выраженности (маркеры чаще сцеплены с целевыми генами, чем непосредственно маркируют их).
Принцип маркер - опосредованной селекции, выраженный вышеприведенным
определением, достаточно прост: Если нам известно местоположение гена, влияющего на проявление того или иного хозяйственного признака, то следить за таким признаком
можно не по его собственному проявлению, а по наследованию контролирующего его гена, по наличию нужного аллеля в селекционном материале (Рис. 1).
Рис. 1. Принцип маркер-опосредованной селекции
Такой отбор особенно эффективен при работе с признаками, контролируемыми генами с не полной пенетрантностью, а также с количественными признаками, контролируемыми группами генов с достаточно выраженным влиянием каждого гена группы на проявление признака.
Следует специально оговорить, что работы в области маркер-опосредованной селекции возможны только в тесной кооперации генетиков и селекционеров, поскольку состоят, как минимум, из двух этапов: 1. Подготовительного этапа, в процессе которого генетики накапливают знания относительно генетического контроля интересующего селекционера признака, а также подбирают подходящие генетические маркеры и 2. Собственно этапа селекционной работы, которую селекционер ведет привычными для него методами, но с использованием предложенного генетиками инструментария МОС. Примерный перечень работ, выполняемых на каждом этапе, можно
представить следующим образом:
Предварительные работы (генетики)
• Разработка ДНК-маркеров.
• Построение геномных молекулярно-генетических карт.
• Поиск функционально значимых генов (candidate gene);
поиск генов количественных признаков; поиск адаптивно-значимых генов; определенице положения целевого гена на хромосомной карте; подбор полиморфных ДНК-маркеров.
•. Анализ генетического разнообразия селекционного материала, поиск уникальных аллелей.
Селекционные работы (селекционеры)
• Тестирование генов в исходном материале (подбор доноров).
• Бекроссирование с отбором по маркерам.
• Объединение аллелей в потомстве; целенаправленное введение аллелей
в потомство ('genepyramiding').
• Отбор гомозигот по доминантным генам в гибридах.
Список этот далеко не полон, но отражает, на наш взгляд, сам принцип «разделения труда» в процессе МОС.
Из всех вышеперечисленных задач генетиков наиболее сложной и затратной является задача поиска функционально-значимых генов и их аллелей (хотя в случае отсутствия достаточной информации по сиквенсам ДНК изучаемого вида, создание самих маркеров и их картирование может обернуться большой и дорогостоящей работой).
Поиск нужных генов (аллелей) обычно ведется тремя путями, посредством:
• Позиционного картирования.
• Анализа синтении геномов близких видов и модельных объектов.
• Анализа функционально-значимых генов, или генов-кандидатов.
При позиционном картировании положение гена (-ов), определяющего проявление того или иного хозяйственно-значимого признака, на хромосомной карте вида устанавливают по результатам анализа сцепления этого гена с ранее локализованными генетическими маркерами. Такое сцепление может быть выявлено при анализе расщепляющегося потомства гибридных комбинаций, анеуплоидных линий, линий с хромосомными делециями, интрогрессиро-ванным чужеродным материалом и.т.д. Главным ограничением позиционного подхода является низкая разрешающая способность генетических карт - впрочем, как уже упоминалось выше, для большинства важнейших сельскохозяйственных видов к настоящему моменту имеются хромосомные карты с высоким насыщением генетическими маркерами. В настоящее время выполнено огромное количество работ, в которых на разных видах сельскохозяйственных растений проведен поиск функционально-значимых генов хозяйственных признаков именно методом позиционного картирования (Babu et al, 2008).
В практике маркер - опосредованной селекции особое распространение получило маркирование моногенных или олигогенных признаков. В основном это гены вертикальной устойчивости к фитопатогенам, а также некоторые другие гены (устойчивости риса к засо-
лению, твердозерности пшеницы и т.д) (Collard et al, 2008; Gupta et al, 2008). Разновидностью позиционного картирования является и картирование QTL (quantity trait loci), при котором статистическими методами ищется сцепление между генетическими маркерами и множеством генов, каждый из которых по отдельности имеет слабо выраженный эффект, но в своей совокупности сильно влияющих на формирование количественного признака. Реальных успехов МОС в картировании генов QTL достигнуто не было. В первую очередь это связано с тем, что даже в одном генотипе при выращивании его в разных агроклиматических условиях или под воздействием стрессов, количественный признак формируется под влиянием разных генов (Quarrie et al., 2005). Здесь уместно привести заключение FAO в области MAS, опубликованное в 2007 году: «До тех пор, пока комплексные признаки не будут полностью разложены по вкладам индивидуальных генов, применение МОС будет ограничено только генами с сильным или умеренным влиянием на признак... .До этих пор наблюдаемый фенотип останется важнейшим компонентом в селекционных работах, поскольку он отражает суммарный эффект всех генов» (Ruane and Sonnino, 2007).
Как же можно «разделать» количественный признак на составляющие его части? Один из подходов связан с изучением генетической синтении сельскохозяйственных видов и модельных объектов генетики. Можно привести такой гипотетический пример: В геноме риса найдены ортологи (гомологи) практически для всех генов, выявленных на модельном объекте (арабидопсис), как определяющие устойчивость к болезням или стрессовым условиям среды. Поскольку геном риса секвениро-ван, то гены риса, выявленные биоинформатиче-ски по гомологии с генами арабидопсиса, сразу и без экспериментальной работы точно ложатся на физическую и генетическую карту риса и доступны для изучения уже в рамках программ МОС.
Другой подход связан с анализом и детальным изучением генов, участие которых в формировании того или иного признака уже хорошо известно, то есть Анализ функционально-значимых генов или генов-кандидатов. Примером таких работ может послужить работа, связанная с созданием высо-коамилозных сортов пшеницы, то есть сортов, характеризующихся высоким процентным
содержанием амилозной фракции в крахмале (более 80%). Такие сорта в настоящее время очень востребованы на международном рынке. Известно, что крахмал состоит из двух типов полисахаридов: амилозы - линейного полимера и амилопектина - полимера разветвленного. Оба этих биополимера синтезируются из единого субстрата АДФ-глюкозы разными ферментными системами. Показано, что блокирование работы одного из ветвящих ферментов (SBEIIa), участвующих в биосинтезе амилопектина приводит к относительному снижению синтеза амилопектина и увеличению синтеза амилозы (Regina et al., 2006). Таким образом, ясно, что получение высокоами-лозной пшеницы возможно за счет блокировки (например, путем мутагенеза) работы гена SBEIIa. Проблема работы заключается, однако, в том, что у гексаплоидной мягкой пшеницы все гены триплицированы, и ген SBEIIa представлен тремя гомеологичными копиями. Блокировка только одного гена не приведет к фенотипическим проявлениям, поскольку синтез нужного фермента будет осуществляться за
счет работы двух оставшихся копий. Для получения выраженного фенотипического проявления необходимо получение тройного мутанта по всем трем копиям данного гена. Поскольку мутация даже в одном гене событие чрезвычайно редкое, то случайно получить генотип с тройной мутацией практически невероятно. Именно поэтому подходы классической селекции не сработают в данном случае. Получение высокоамилозной пшеницы возможно только методами МОС. Для этого проводится индивидуальный поиск мутантных генов SBEIIa на каждом из субгеномов пшеницы, маркирование их и последующее объединение путем системы скрещиваний (с отбором нужных гибридов по маркерам) в одном генотипе.
В заключение хотелось бы сказать несколько слов о финансово-экономической стороне вопроса. Методы МОС до сих пор остаются достаточно дорогостоящими. Как отмечается в специально проводимых исследованиях, применять эти подходы следует в основном в тех только случаях, когда отбор по фенотипу затруднен или невозможен (Dreher, K. et al., 2000).
Список использованных источников
1. Integrating marker-assisted selection in crop breeding - Prospects and challenges / R. Babu [et al.] // Current Science. - 2004. -Vol. 87. - P. 607-619.
2. Molecular Breeding Laboratories in the Genomics Era: Current Status and Future Considerations / B.C.Y. Collard [et al.] // International Journal of Plant Genomics. - 2008. Vol. Article ID 524847. - 25 p. doi:10.1155/2008/524847.
3. Is marker assisted selection cost-effective compared to conventional plant breeding methods? The case of Quality Protein Maize / K. Dreher [et al.] // In Proceedings of the 4th Annual Conference of the International Consortium on Agricultural Biotechnology, Ravello, Italy, 2000.
4. Wheat Genomics: Present Status and Future Prospects International Journal of Plant Genomics / P. K. Gupta [et al.] // Vol. - 2008, Article ID 896451, P. 36 doi:10.1155/2008/896451.
5. High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices of large-bowel
health in rats / Regina A. [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. - 2006, Vol. 103(10), P. 3546-3551.
6. Ruane, J. Marker-assisted selection as a tool for genetic improvement of crops, livestock, forestry and fish in developing countries: an overview of the issues / Ruane J., Sonnino А // in book Marker-assisted selection Current status and future perspectives in crops, livestock, forestry and fish (Ed: Guimaraes E. P., Ruane J., Scherf B. D., Sonnino A., Dargie J. D) Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 2007 - P. 10.
7. The map-based sequence of the rice genome / T. Matsumoto, [et al.] // Nature. - 2005.-Vol. 436, №. 7052. - P. 793-800.
8. A high-density genetic map of hexaploid wheat ( Triticum aestivumL.) from the cross Chinese Spring SQ1 and its use to compare QTLs-for grain yield across a range of environments / S. A. Quarrie [et al.] // Theor. Appl. Genet. -2005. - Vol. 110, P. 865-880.
Дата поступления статьи 24 марта 2009 г.
