CC BY
688
УДК 577.21:631.52
ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОМНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И РЕДАКТИРОВАНИЯ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ*
Е.А. САЛИНА, доктор биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: salina@bionet.nsc.ru)
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиГ СО РАН), просп. Лаврентьева, 10, Новосибирск, 630090, Российская Федерация
Резюме. Геномное моделироваие и редактирование - это технологии, базирующиеся на результатах секвенирования генома растений. Прогресс в этом направлении за последние годы очевиден, в том числе в секвенировании и сборке de novo «ре-ференсных» геномов. Для генома пшеницы, в секвенировании которого принимают участие институты Российской Федерации, «референсная» ДНК последовательность будет опубликована в начале 2017 г. К геномному моделированию, а именно, к достижению заданной модели сорта с использованием молекулярных маркеров, можно отнести методы маркер-ориентированной и геномной селекции. Методы маркер-ориентированной селекции (МОС) включают в себя контроль наследования одного или нескольких генов с использованием молекулярных маркеров. В России первые работы с использованием МОС были выполнены на пшенице в 2009 г. при поддержке ФЦП Минобрнауки РФ. В статье описаны особенности применения МОС в селекции растений, предложены схемы скрещивания и отбора на примере пшеницы. Геномная селекция предусматривает контроль в селекционном процессе всего генома, а не только целевого гена, как в МОС. Она позволяет проводить полномасштабное генотипирование сортов растений и прогнозировать передачу количественных признаков (таких как, например, урожайность, холодоустойчивость, засухоустойчивость и др.). В статье представлены основные этапы геномной селекции, на примере пшеницы, и обсуждаются критически точки использования этой технологии в РФ. Если геномное моделирование направлено на расширение возможностей традиционной селекции, то методы геномного редактирования могут быть направлены на создание принципиально новых комбинаций генов. В статье приводится краткая информация о наиболее эффективном на сегодня методе геномного редактирования с использованием системы CRISPR/Cas9. Представлены перспективы использования методов геномного редактирования и возможные проблемы при их интеграции в селекцию.
Ключевые слова: секвенирование, пшеница, референсные геномы растений, маркер-ориентированная селекция, геномная селекция, геномное редактирование, CRISPR/Cas9. Для цитирования: Салина Е.А. Технологии геномного моделирования и редактирования для решения задач селекции расте-ний//Достижения науки и техники АПК. 2016. Т.30. №9. С. 9-14.
В последние годы в селекцию сельскохозяйственных растений интенсивно вовлекают молекулярные маркеры, что, в первую очередь, обусловлено резким скачком в разработке и применении более дешевых и высокопроизводительных методов секвенирования и сборки геномов.
Первый этап секвенирования обычно проводят на
одном выбранном образце (сорт/линия), который берут за основу как «референсный» геном. Секвенирование и сборку «референсного» генома, как правило, осуществляют в течение нескольких лет с использованием различных комбинаций методов и подходов (рис. 1) в несколько этапов от «чернового» варианта до так называемого «золотого» стандарта.
Например, секвенирование генома риса проводили в рамках Международного проекта - International Rice Genome Sequencing Project (IRGSP), который организовали в 1998 г. В 2002 г. IRGSP было доложено о получении высококачественного первого варианта генома риса («чернового» варианта), в 2005 г. опубликовали результаты секвенирования и сборки 95% генома (389 млн.н.). При секвенировании использовали подход предварительного фрагментирования генома путем получения ВАС (bacterial artificial chromosome) и PAC (phage artificial chromosome) клонов [1]. Следует отметить, что для ряда объектов успешно используют секвенирование тотальной геномной ДНК, так называемое полногеномное секвенирование (рис.1). Этот подход стал особенно популярным в результате создания и совершенствования таких приборов нового поколения, как Roche/454 Genome sequencer FLX Instrument (на сегодняшний день уже снят с производства), ABI SOLid System, Illumina Genome Analyser, PacBio RS II.
Для ряда сельскохозяйственных культур «референсные» геномы уже в той или иной степени собраны. Это относится к томатам, картофелю, рису, кукурузе, винограду и др. Институты Российской Федерации принимали участие в консорциумах по секвенированию генома картофеля и пшеницы [2, 3].
Для культур с большими и сложными по структуре геномами, например, мягкой пшеницы (аллогексапло-ид с геномной формулой BBAADD, число хромосом в гаплоидном геноме - 21, размер её генома превышает геном человека в 5 раз, геном риса - в 40 раз), построе-
U •Ï
00
рис
арабидопсис
кукуруза
2000 2001 2002
2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
По Сэнгеру
виноград
папайя
ль
сорго
персик
Несколько подходов яблоко огурец картофель ячмень томат банан
Технлогии нового поколения -NGS дыня земляника арбуз пшеница
Рис. 1. Прогресс в секвенировании генома растений.
*Работа выполнена в рамках государственного задания по проекту № 0324-2015-0005. Достижения науки и техники АПК. 2016. Т 30. № 9 - 9
ние референсного генома - процесс достаточно долгий и трудоемкий. В 2012 г. английские учёные получили первые данные по полногеномному секвенированию пшеницы, которые заключалась в 5-и кратном покрытии её генома размером ~17 млрд.п.н., последовательностями ДНК протяженностью 300-400 нуклеотидов [4]. Это позволило разработать новый пул SNP (single nucleotide polymorphism) маркеров, но до расшифровки генома было ещё далеко.
Важным этапом в изучении генома пшеницы стало проведение работ по секвенированию отдельных хромосом, а первый «черновой» вариант его сборки опубликовали в 2014 г. [5]. Проводимое Международным консорциумом (IWGSC) построение «референсного» генома пшеницы, которое включает в себя стадии построения ВАС библиотек индивидуальных хромосом планируется завершить к 2017 г. [3].
«Референсный» геном впоследствии служит основой для более эффективной сборки геномов других сортоо-бразцов этого же вида, отличающихся от секвенирован-ного образца растения присутствием ряда аллелей генов, определяющих хозяйственно-ценные признаки.
Для интеграции результатов геномного секвениро-вания в селекционный процесс требуется проведение серии генетических экспериментов, которые включают стадии генотипирования и фенотипирования растений и позволяют установить основополагающую связь для всей дальнейшей работы - сцепленность маркера и гена/генов, определяющих хозяйственно-ценные признаки. Основные подходы к определению связи «маркер-ген-признак» у сельскохозяйственных видов растений включают комплекс методов прямой (от признака к гену) и обратной (от гена к признаку) генетики, в том числе методы генетического и ассоциативного картирования, трансформации растений и др.
Традиционная селекция всегда базировались на фенотипической оценке качественных и количественных признаков. Использование молекулярных маркеров, помимо преимуществ, которые будут изложены в следующих разделах, позволяет расширить инструментарий селекционеров благодаря оценке с помощью маркеров тех признаков, выявить которые в полевых условиях не всегда возможно.
Геномное моделирование. Формирование модели сорта в соответствии с зонами возделывания сельскохозяйственных растений всегда было важной составляющей работы селекционеров. Особенно актуально её четкое описание при интеграции в селекцию растений методов, разработанных на основе геномного секвенирования.
Маркеры, созданные по результатам секвенирования, можно использовать в селекции по двум направлениям -это «маркер-ориентированная» (от английского «marker-assisted selection») и «геномная» селекция [6]. Оба подхода требуют четкого описания той модели сорта, которую селекционер хочет увидеть после их применения.
В русскоязычной литературе встречаются следующие переводы «marker-assisted selection»: маркер-вспомогательная селекция; маркер-ассоциированная селекция; маркер-опосредованная селекция; маркер-контролируемая селекция; маркер-ориентированная селекция. Наиболее часто в последние годы используется последний вариант. Маркер-ориентированная селекция (МОС) - это комплекс методов, реализация которого включает несколько этапов: 1) подбор маркеров к генам, определяющим хозяйственно-ценные признаки; 2) верификация маркеров (сопоставление данных о присутствии
маркера и проявлении признака в популяциях); 3) разработка схемы скрещивания и отбора; 4) выбраковка растений, не содержащих целевых генов, контролирующих хозяйственно-ценные признаки, с последующим размножением отобранных растений.
В последние годы по многим сельскохозяйственным культурам разработаны маркеры к генам, контролирующим сроки вегетации, высоту растений, устойчивость к биотическим и абиотическим факторам и др. На сегодняшний день для каждого вида (или группы близкородственных видов) сельскохозяйственных растений можно написать отдельный обзор по использованию маркеров в селекции.
В нашем исследовании основное внимание сосредоточено на направлениях использования геномных технологий (технологий, основанных на данных по секвенированию генома) в селекции пшеницы. Для этой культуры известны маркеры генов, контролирующих такие признаки, как устойчивость к грибным болезням и вредоносным насекомым, высота растения, толерантность к абиотическим стрессорам и др. (табл. 1).
Таблица 1. Перечень признаков пшеницы, которые можно моделировать с использованием метода МОС
Обозна- Опи-
Признак чение сание
гена маркера
Устойчивость к грибным болез- [7]
ням:
листовая ржавчина LR
стеблевая ржавчина SR
желтая ржавчина YR
септориоз STB
фузариоз FHB
Устойчивость к вредоносным на- [7]
секомым:
гессенская муха H
пшеничная тля RWA, DN
Время колошения:
чувствительность к яровизации VRN [7, 8]
чувствительность к фотопериоду PPD [7, 9]
Высота растения RHT [7]
Толерантность к абиотическим [7]
стрессорам
засухоустойчивость (+ биомасса
корней)
толерантность к алюминию
устойчивость к прорастанию на
корню
Качество зерна [7]
глиадины, глютенины GLI, GLU
активность полифенолоксидазы PPO
активность липоксигеназы LOX
желтая окраска зерна PSY
твердозерность, PINA,
характеристики крахмала WX
содержание белка GPC
Второй и третий этап МОС, охарактеризованные ранее, можно объединить, в так называемый предсе-лекционный процесс. Верификацию можно проводить путем анализа распределения маркеров и изучаемого признака в популяциях от скрещивания растений, различающихся по проявлению признака. Значительно ускоряет процесс анализ изогенных линий, различающихся по изучаемому признаку. На современном этапе развития исследований по геному пшеницы большая часть маркеров к признакам, перечисленным в табл. 1, подобрана не непосредственно к структуре гена, а к районам его локализации. Их привлечение в МОС с использованием в качестве доноров признака российских сортов и линий требует особенно тщательной проверки.
Пирамидирование генов
Д1ХД2 \
f
F2 +
F3
отбор молекулярными маркерами
Введение гена/генов в сорт/линию
сорт/линия ХД1
F1BC1 F2BC1
Оценка в поле
О
<
F2BC2
FlBCn
I
F2BCn
i
F3BCn
Размножение
Рис. 2. Варианты схем МОС, в зависимости от поставленной задачи (Д - донор гена)
Например, при анализе опубликованных маркеров к генам устойчивости к стеблевой ржавчине [7] мы выявили, что с помощью некоторых из них идентифицировать Бг гены в российских сортах и линиях не представляется возможным [10], и, соответственно, использовать такие маркеры для генотипирования российских сортообраз-цов и селекционного материала не целесообразно.
Этап МОС, связанный с разработкой схемы скрещивания, зависит от цели и направления селекции. Пи-рамидирование генов, а именно объединение в одном генотипе нескольких целевых генов, занимает четыре вегетационных периода (год и три месяца при искусственном выращивании в осенне-зимний период). Это можно сделать при условии, что линии, привлеченные к скрещиванию, были ранее изучены, в них идентифицированы искомые гены и определены маркеры к таким генам. При включении в скрещивание гибридных форм или сортообразцов пшеницы, несущих множественные интрогрессии, или при стремлении перенести как можно больше признаков от одного из родителей методом бек-кроссирования, процесс получения целевого генотипа удлиняется. Согласно схеме скрещивания МОС, которую мы предлагаем и используем для решения различных задач (рис. 2), можно рассчитать и размер популяций, необходимый при работе с маркерами.
При создании генетических моделей, а именно изо-генных линий, то есть линий, отличающихся только по одному генному локусу, обычно используют схему с беккроссированием, числом беккроссов не менее 9 и привлечением маркеров на нескольких этапах[11]. В случае создания селекционного материала на основе введения в сортообразцы целевых генов, согласно нашему опыту работы, достичь запланированной модели сорта при отборе и анализе растений с использованием маркеров можно уже на этапе F2BC2.
На последнем этапе МОС при размножении растений в полевых условиях требуется дополнительная оценка соответствия полученных образцов заданной модели сорта и выбраковка материала, в случае необходимости.
Первые публикации, указывающие на эффективность использования маркеров для отбора целевых генотипов появились еще 1983 г. [12, 13]. Наибольший интерес к этим работам проявился после открытия метода ПЦР, что позволило существенно увеличить число маркеров на геном (рис. 3) и упростить систему детекции маркеров.
В США финансовую поддержку со стороны государ-
ства это направление исследований получило с 2001 г. [7]. В Европе селекционеры, испытывающие линии сельскохозяйственных растений, созданные методами MOC, получают дополнительное субсидирование. В Австралии и в СИММИТ при крупных селекционных центрах созданы группы, проводящие оценку селекционного материала молекулярными маркерами. В 2007 г. появилось сообщение, что австралийские ученые перенесли гены устойчивости к бурой ржавчине и качества зерна из сорта Annuelo в селекционные линии Stylet, а процесс от скрещивания до производства составил 5 лет [14].
В России первые работы по МОС были выполнены на пшенице в 2009 г. [15] благодаря поддержке федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Первые сорта, полученные по одной из схем МОС [16], сегодня проходят Конкурсное сортоиспытание в Челябинском НИИСХ (Тюнин В.А., персональное сообщение).
За более чем 15-летнюю историю существования МОС можно выделить следующие её достоинства, дополняющие традиционные методы селекции:
возможность, используя знания об аллельном составе генов, добиться более быстрого и точного результата по достижению заданной модели сорта;
сокращение объёма полевых работ (в расчете на один созданный сорт) благодаря выбраковке растений
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0 . 1
1993 2000 2004 2012
Рис. 3. Основные этапы разработки молекулярных маркеров для генома пшеницы: до 1993 г.- морфологические и биохимические маркеры, 2000 г. - + ПЦР маркеры (SSR), 2004 г. - + EST маркеры, 2012-2015 гг. + SNP маркеры.
по данным распределения маркеров на первых этапах отбора;
эффективная выбраковка гетерозигот, получение однородного материала уже на первых этапах самоопыления отобранных образцов растений;
возможность пирамидирования генов, близких по своему проявлению;
возможность более быстрого переноса целевых генов из новых источников с минимальными изменениями основного типа развития растений, адаптированного к конкретному региону;
использование результатов анализа, не подверженных влиянию варьирование условий окружающей среды.
Для проведения МОС необходима организация лабораторного анализа образцов и правильная интерпретация полученных данных (обучение специалистов), что иногда служит препятствием для её использования в селекционных центрах.
К недостаткам следует отнести тот факт, что область контроля генотипа при МОС имеет ограниченный характер (один или несколько генов), в отличии, например, от более масштабного метода «геномной селекции».
Геномнаяселекция (контролирование в селекционном процессе всего генома, а не только целевого гена) требует большого числа маркеров, плотно покрывающих все хромосомы сельскохозяйственного объекта. Это позволяет проводить массовое полномасштабное гено-типирование сортов растений, осуществлять ассоциативное картирование, картировать и прогнозировать передачу количественных признаков (таких как, например, урожайность, холодоустойчивость, засухоустойчивость, сроки колошения и др.) [6, 16-19].
Анализа литературных данных и первых этапов нашей работы в этом направлении свидетельствует, что, как и в случае с МОС, при геномной селекции один из необходимых этапов для достижения планируемых признаков модели сорта - стадия предселекции (рис. 4). При проведении геномной предселекции - первого цикла работ, для идентификации локусов количественных признаков требуется подбор сортообразцов из данного или нескольких регионов с использованием при обработке результатов SNP-анализа методов ассоциативного картирования. Возможно также проведение анализа популяций от скрещивания двух сортообразцов, контрастных по проявлению признака, наиболее часто вовлекаемых в селекционные программы региона с привлечением для обработки результатов программ для генетического картирования.
Выявленные на стадии предселекции маркеры к локусам количественных признаков, на следующем цикле работ будут использованы для отбора растений с целевыми признаками в соответствии с моделью сорта, планируемой при проведении гибридизации растений. Перенос маркеров к локусам количественных признаков, полученных для других регионов, не рекомендуется.
Препятствием для широкого распространения методов геномной селекции служит доступность одной из ключевых стадий - SNP анализ. Его проведение за рубежом или покупка чипов и анализ их в Российской Федерации обходится не менее 2500 руб. за образец (например, при анализе по 13000 маркерам), что затрудняет массовое использование таких подходов в селекции не только в России, но и за рубежом. При наличии альтернативных более дешевых технологий (традиционная селекция, селекция с использованием методов хромосомной инженерии и получения дигаплоидов, МОС) метод геномной селекции растений требует дополнительной оптимизации для широкого использования. В России такие работы начаты в 2015 г. в рамках проектов РНФ.
Методы МОС и геномной селекции, в качестве дополнительного инструмента традиционной селекции, позволяющего более целенаправленно достигать запланированной модели сорта, имеют ряд общих черт и различий:
использование изложенных подходов обеспечивает более эффективную оценку генетического разнообразия сортов и гибридов сельскохозяйственных растений, созданных ранее, а также вовлечение этого разнообразия в селекцию;
МОС и геномная селекции, если не учитывать работы по предселекции, позволяют сократить до 1-2 лет такие этапы традиционной селекции, как гибридизация и отбор, и до 2-х лет - отбор в питомниках (при наличии возможностей размножения семян в закрытом грунте);
оба подхода позволяют сокращать объём посевов благодаря выбраковке неперспективных генотипов растений в первый год на этапе гибридизации и отбора;
МОС можно организовать в каждом селекционном центре при закупке небольшого количества бюджетного оборудования и наличии одного специалиста по этому направлению; к работе можно привлекать опубликованные маркеры; стоимость исследованийможно регулировать, увеличивая или уменьшая объёмы анализа. Метод эффективен для отбора растений по кратному числу генов от1до 4, контролирующих хозяйственно-ценные признаки;
для геномной селекции необходимы дорогостоящее оборудование и высококвалифицированные специалисты на стадии проведения SNP- анализа; на сегодняшний день метод дорогостоящий и доступный только
1 цикл - Подбор сортообразцов/линий
2 цикл- Подготовка популяций от скрещивания отобранных сортообразцов/линий
SNP анализ
Illumina
90КВ- 90000 маркеров 15КВ-15000 маркеров (TraitGenetics GmbH) Affymetrixм др.
1 Цикл (год) - геномная предселекции
2 Цикл (год) - геномная селекция
Размножение и оценка в полевых условиях
Обработка данных
1 цикл - Маркирование генных локусов
2 цикл - Отбор растений [выбраковка растений ) по маркерам к генам, определяющих хозяйственно-ценные признаки
Рис. 4. Основные этапы геномной селекции.
для специализированных центров; объёмы анализа всегда кратны размеру чипа (обычно это 96 образцов). В отличие от МОС, позволяет с высокой вероятностью отбирать генотипы растений с высокой урожайностью и по другим количественным признакам.
Суммарные затраты на всю работу при геномной селекции на порядок выше, хотя при расчете затрат на использование одного маркера на один сортообразец, метод геномной селекции оказывается во много раз дешевле, чем МОС. При этом следует отметить, что, во-первых, не всегда нужен весь пул маркеров; во-вторых, сочетание МОС с традиционной оценкой в поле тоже обладает высокой эффективностью. Последний подход представляется наиболее реальным для интеграции геномных технологий в селекцию на современном этапе развития науки РФ.
Геномное редактирование. Говоря о технологиях, базирующихся на данных секвенирования генома растений, нельзя оставить без внимания такое направление как геномное редактирование.
Геномное редактирование - это возможность адресных манипуляций с последовательностями ДНК генов, приводящих к изменению их функционального статуса. Комплекс методов, позволяющих проводить геномное редактирование, постоянно расширяется [20], в том числе в направлении увеличения точности редактирования при снижении сложности и стоимости проводимых работ. Применительно к геному растений методы редактирования позволяют расширить генетическое разнообразие благодаря активации или замолканию генов, что приводит к формированию новых генотипов, необходимых для адаптации к быстро меняющимся условиям окружающей среды или последствиям техногенным загрязнений, а также для решения задач, связанных с потребительскими свойствами продовольственных товаров [21].
Наибольший интерес в последние 5 лет вызвал метод геномного редактирования с использованием системы CRISPR/Cas9, элементами которой служат некодирую-щие РНК, специфически связывающиеся с ДНК, и белки Cas (CR ISPR-associated), вносящие двуцепочечные разрывы в участки ДНК. Он получил быстрое распространение в мире благодаря высокой эффективности в достижении поставленной цели [22, 23].
Разработка метода CRISPR/Cas9 - яркий пример того, как фундаментальные исследования, проводимые на протяжении 25 лет в области изучения прокариот, способствовали разработке инструмента с широкими возможностями практического применения в растениеводстве, животноводстве и медицине.
В ходе проведения исследований, начиная с 1987 г., было обнаружено, что в геноме бактерии Escherichia coli, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) чередуются со спейсерами, различающимися между собой по первичной структуре
(рис. 5). В 2005 г. было установлено, что первичная структура спейсеров соответствует участкам нуклео-тидных последовательностей из геномов различных бактериофагов [27]. По сути ряд повторов-спейсеров CRISPR отражает историю вирусной атаки бактерии E. coli, в результате которой был сформирован механизм борьбы с этими вирусами при участии эндонукле-азы Cas. Система CRISPR/Cas легла в основу наиболее эффективного из известных методов редактирования генома эукариот.
Стратегия геномного редактирования растений включает пять основных этапов [28]:
выбор целевой нуклеотидной последовательности (гена) в геноме;
создание нуклеазной конструкции, направленной на выбранную мишень;
доставка этой конструкции в клеточное ядро; анализ полученных мутаций; регенерация растений.
Проблемы использование геномного редактировании растений в селекции начинаются с первого этапа, в связи с тем, что выделено и изучено не так много генов, влияющих на хозяйственно-ценные признаки, а случаи, когда можно выключить или включить гены с помощью геномного редактирования, вообще единичны. На сегодняшний день фундаментальные исследования по поиску и изучению функциональной организации генов лежат в основе успешного использования системы геномного редактирования CRISPR/ Сав9 в прикладных исследованиях. Кроме того, существуют определенные проблемы на всех этапах этой стратегии, и если для ряда двудольных растений они преодолимы, то для однодольных, например, проблемы трансформации и регенерации очень сильно связаны с генотипом и будут требовать дополнительных усилий при масштабных работах.
В заключение хотелось бы отметить, что традиционная селекция - это та основа, на которой стоит и будет стоять создание сортов сельскохозяйственных растений. Именно селекционеры должны задавать то направление работ, которое требуется для решения проблем продовольственной безопасности. Современные методы МОС и геномной селекции должны
Рис. 5. История разработки метода геномного редактирования с использованием системы CRISPR/Cas9.
обеспечить более быстрое достижение решения поставленных задач. Геномное редактирование - это особое направление работ. В отличие оттрадиционной селекции и дополняющих его современных методов,
масштабность использования геномного редактирования будет определяться уровнем развития работ по структурно-функциональной организации генов сельскохозяйственных растений в стране и в мире.
Литература.
1. International Rice Genome Sequencing Project. The map-based sequence of the rice genome // Nature. 2005. V. 436. Pp. 793-800.
2. Potato Genome Sequencing Consortium. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato // Nature. 2011. V. 475. Pp. 189-195.
3. International Wheat Genome Sequencing Consortium [Электронный ресурс]. URL: http://www.wheatgenome.org (дата обращения 14.10.2016)
4. Brenchley R. Spannagl M., Pfeifer M. et al. Analysis of the bread wheat genome using whole-genome shotgun sequencing // Nature. 2012. V. 491. Pp. 705-710.
5. The International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome//Science. 2014. V. 345. N. 6194. Pp. 125-178.
6. Nakaya A., Isobe S.N. Will genomic selection be a practical method for plant breeding? // Annals of Botany. 2012. V. 110. Pp. 1303-1316.
7. http://maswheat.ucdavis.edu
8. Shcherban A.B., Efremova T.T., Salina E.A. Identification of a new Vrn-B1 allele using two near-isogenic wheat lines with difference in heading time // Molecular Breeding. 2012. V. 29. No. 3. Pp. 675-685.
9. A pseudoresponse regulator is misexpressed in the photoperiod insensitive PpdD1a mutant of wheat (Triticum aestivum L.) / J. Beales, A. Turner, S. Griffiths, J.W. Snape, D.A. Laurie // Theor. Appl. Genet. 2007. V. 115. No. 5. Pp. 721-733.
10. Genetic diversity of spring wheat from Kazakhstan and Russia for resistance to stem rust Ug99 / V. Shamanin, E. Salina, R. Wanyera, Yu. Zelenskiy, P. Olivera, A. Morgunov// Euphytica. 2016. doi:10.1007/s10681-016-1769-0
11. Marker-assisted development and characterization of a set of Triticum aestivum lines carrying different introgressions from the T. timopheevii genome/E.M. Timonova, I.N. Leonova, M.S. Röder, E.A. Salina//Molecular Breeding. 2013. V. 31. Pp. 123-136.
12. The application of restriction fragment length polymorphism to plant breeding / B. Burr, S.V. Evola, F.A. Burr, J.S. Beckmann // Genetic Engineering/Eds Setlow J.K. et al. N.Y.: Plenum Press. 1983. Pp. 45-59.
13. Tanksley S.D. Molecular markers in plant breeding // Plant Mol. Biology Reports. 1983. V. 1. Pp. 3-8.
14. The successful application of a marker-assisted wheat breeding strategy / H. Kuchel, R. Fox, J. Reinheimer, L. Mosionek, N. Willey, H. Bariana, S. Jefferies // Molecular Breeding. 2007. V. 20. No. 4. Pp. 295-308.
15. Салина Е.А., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Егорова Е.М. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине // Патент №. 2407283. Дата приоритета: 06.07.2009. Дата выдачи: 2010-12-27.
16. Салина Е.А., Леонова И.Н., Щербань А.Б. Способ создания линий яровой мягкой пшеницы с удлиненным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням// Патент №. 2535985. Дата выдачи: 2014-10-20.
17. Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targets of selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars/C.R. Cavanagh, S. Chao, S. Wang et al.//PNAS. 2013. V. 110. No. 20. Pp. 8057-8062.
18. High-density SNP genotyping array for hexaploid wheat and its secondary and tertiary gene pool/ M.O. Winfield, A.M. Allen, A.J. Burridge et al. // Plant Biotechnology Journal. 2016. V. 14. Pp. 1195-1206.
19. Identification of new heading date determinants in wheat 5B chromosome / A.A. Kiseleva, A.B. Shcherban, I.N. Leonova, Z. Frenkel, E.A. Salina // BMC Plant Biology. 2016. V. 16. Suppl 1. No. 8. Pp. 36-46.
20. Редактирование генов и геномов / отв. ред. ВС. М. Закиян, С. П. Медведев, Е. В. Дементьева, В. В. Власов. Новосибирск: Издательство СО РАН, 2016. 432 с.
21. Waltz E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation//Nature. 2016. V. 532. Pp. 293.
22. Targeted mutagenesis, precise gene editing, and site-specific gene insertion in maize using cas9 and guide RNA / S. Svitashev, J.K. Young, C. Schwartz, H. Gao, S.C. Falco, A.M. Cigan//Plant Physiology. 2015. V. 169. Pp. 931-945.
23. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew / Y. Wang, X. Cheng, Q. Shan et al. // Nature biotechnology. 2014. V. 32. No. 9. Pp. 947-952.
24. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product/ Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata // J. Bacteriol. 1987. V. 169. No. 2. Pp. 5429-5433.
25. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria / F.J. Mojica, C. Dfez-Villasenor, E. Soria, G. Juez // Mol Microbiol. 2000. V. 36. Pp. 244-246.
26. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes / R. Jansen, J.D. Embden, W. Gaastra, L.M. Schouls // Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 1565-1575.
27. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements / F.J. Mojica, C. Diez-Villasenor, J. Garcia-Martinez, E. Soria// J. Mol. Evol. 2005. V. 60. No. 2. Pp. 174-182.
28. Kumar V., Jain M. The CRISPR-Cas system for plant genome editing: advances and opportunities // Journal of Experimental Botany. 2015. V. 66. No. 1. Pp. 47-57.
GENOME MODELING AND EDITING TECHNOLOGIES FOR SOLVING THE BREEDING CHALLENGES
E.A. Salina
Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, prosp. Lavrent'eva, 10, Novosibirsk, 630090, Russian Federation
Summary. Genome modeling and editing are technologies utilizing plant genome sequencing data. The recent advance in plant genome sequencing is evident, including the sequencing and de novo assembly of reference genomes. The reference DNA sequence for the wheat genome, which was sequenced with the participation of Russian research institutions, will be published in early 2017. Marker-assisted and genomic selection is in the toolkit of genome modeling technology, namely, designing of a target cultivar with the help of molecular markers. Marker-assisted selection (MAS) includes the control of inheritance of one or several genes using molecular markers. The first works utilizing MAS in Russia were performed in 2009 under a federal target program of the Ministry of Education and Science. The article briefs specific features of MAS application in plant breeding, and the breeding schemes for the implementation MAS in wheat are described. Genomic breeding implies the control of overall genome during breeding rather than a target gene alone, as in MAS. It allows for a genome-scale genotyping of plant cultivars and prediction of quantitative trait inheritance (yield, cold and drought resistance, etc.). The main stages in the genomic selection are described by the example of wheat with a discussion of the pivotal points of its application in Russia. Genome modeling expands the capacities of traditional breeding, while genome editing approach is able to create fundamentally new gene combinations. The genome editing using the CRISPR/Cas9 system is overviewed. The prospects of genome editing and potential problems of it use in breeding are described.
Keywords: sequencing, wheat, reference plant genomes, marker-assisted selection, genome selection, genome editing, CRISPR/Cas9. Author Details: E.A. Salina, D. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: salina@bionet.nsc.ru)
For citation: Salina E.A. Genome Modeling and Editing Technologies for Solving the Breeding Challenges. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2016. V.30. No. 9. Pp. 9-14 (in Russ.).
