Малоновый диальдегид и система глутатиона в крови у больных хроническим панкреатитом в зависимости от длительности заболевания

Меринова Надежда Иннокентьевна; Козлова Наталия Михайловна; Колесниченко Лариса Станиславовна; Суслова Антонина Ильинична; Ясько Михаил Владимирович; Егорова Ирина Эдуардовна; Бахтаирова Вера Ильинична; Булавинцева Ольга Алексеевна; Леонова Зоя Алексеевна

Информация об авторах: Насонова Марина Владимировна — научный сотрудник, 650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6, e-mail: [email protected]; Лузгарев Сергей Валентинович —старший научный сотрудник,к.х.н.; Бураго Андрей Юрьевич — ведущий научный сотрудник, к.м.н.; Доронина Нина Васильевна — ведущий научный сотрудник, д.б.н.; Ежов Владимир Александрович — старший научный сотрудник, к.т.н.;

Кудрявцева Юлия Александровна — заведующий лабораторией, д.б.н., e-mail: [email protected]

МАЛОНОВЫЙ ДИАЛЬДЕГИД И СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА В КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПАНКРЕАТИТОМ

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Надежда Иннокентьевна Меринова, Наталия Михайловна Козлова, Лариса Станиславовна Колесниченко,

Антонина Ильинична Суслова, Михаил Владимирович Ясько, Ирина Эдуардовна Егорова, Вера Ильинична Бахтаирова, Ольга Алексеевна Булавинцева, Зоя Алексеевна Леонова.

(Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра факультетской терапии, зав. — д.м.н. Н.М. Козлова, кафедра химии и биохимии, зав. — д.м.н., проф. Л.С. Колесниченко)

Резюме. При обострении хронического панкреатита независимо от длительности заболевания установлено повышение уровня малонового диальдегида в плазме и снижение концентрации восстановленного глутатиона (GSH) в эритроцитах. В плазме крови у пациентов с длительностью заболевания от 2 до 10 лет определено повышение концентрации GSН и активности глутатионтрансферазы. В эритроцитах крови при длительности заболевания от

2 до 5 лет сохранена активность глутатионпероксидазы и повышена активность глутатиоредуктазы, при длительности заболевания от 6 до 15 лет активность глутатионпероксидазы снижается и стабилизируется активность глу-татиоредуктазы.

Ключевые слова: хронический панкреатит, глутатион, малоновый диальдегид.

MALONDIALDEHYDE AND GLUTATHIONE ANTIOXIDANT PROTECTION IN THE BLOOD OF PATIENTS WITH AN EXACERBATION OF CHRONIC PANCREATITIS DEPENDING ON THE DURATION OF THE DISEASE

N.I. Merinova, N.M Kozlova, L.S. Kolesnichenko, A.I Suslova, M.V. Jasko,

I.E Egorova, V.I Bahtairova, O.A Bulavintseva, Z.A Leonova (Irkutsk State Medical University, Russia)

Summary. In the erythrocytes a reduction of concentration of reduced glutathione (GSH), increased products of malondialdehyde in plasma was determined in patients with an exacerbation of chronic pancreatitis irrespective of the duration of the disease. Increased GSH concentration and activity of glutathione transferase were revealed in plasma, except for the group with disease duration of 10-14 years. In the group with duration of 2-5 years the activity of glutathione peroxidase in erythrocytes was preserved and the activity of glutathione reductase in the erythrocytes was increased. In the erythrocytes a reduction of activity of glutathione peroxidase was determined in patients with chronic pancreatitis with a disease duration of 6-15 years.

Key words: chronic pancreatitis, glutathione, malondialdehyde.

Несмотря на достижения в области диагностики и фармакотерапии хронического панкреатита (ХП), проблема этого заболевания на сегодняшний день является одной из самых сложных и актуальных в гастроэнтерологии. Между тем, патогенез ХП во многом остается неясным, недостаточно эффективны применяемые методы лечения. В последнее время большую роль в патогенезе ХП отводят активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), ведущих к повреждению мембран панкреацитов. Продукты свободнорадикального пере-кисного окисления блокируют экзоцитоз в клетках аци-нусов поджелудочной железы, что приводит к аутофа-гии, кринофагии, попаданию ферментов в межклеточное пространство, а вследствие этого — дегрануляции тучных клеток, воспалению из-за хемотаксиса и боли [1,5]. В противовес свободнорадикальным процессам в организме существуют антиоксидантные системы (АОС), направленные на сохранение и поддержание гомеостаза в организме. Система глутатиона представляет одну их самых мощных АОС клетки, взаимодействующих со свободными радикалами [3]. При хроническом панкреатите комплексного исследования системы глутатиона раздельно в плазме и в эритроцитах (ЭР) крови ранее не проводилось.

Целью нашей работы было комплексное определение сдвигов в системе глутатиона раздельно в ЭР и в плазме крови у больных с обострением ХП средней степени тяжести в зависимости от длительности заболевания.

Материалы и методы

Было обследовано 70 больных с ХП в фазе обострения, средней степени тяжести с болевым синдромом. В зависимости от длительности заболевания выделено 3 группы: группа 1 — длительностью 2-5 лет (n=28), группа 2 — длительностью 6-9 лет (n=22), группа 3 — длительностью 10-15 лет (n=20). Группу клинического сравнения (ГКС) составили 23 практически здоровых человека. Медиана возраста — 49,1 [38-55] лет. Длительность заболевания у всех больных была свыше 2 лет. В лизатах эритроцитов (ЭР) и плазме крови определяли восстановленный глутатион (GSH) и активность ферментов глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР), глутатиопероксидазы (ГПО) стандартными спектрофотометрическими методами. Определение МДА в плазме исследовалось по методу J. Stocks и соавт. (1974).

Статистическую обработку проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ Microsoft Eхсel и Statistica for Windows*? (версия 8, 2007 г). Проверка характера распределения значений в выборке проводилась с помощью теста Shapiro-Wilk’s. Так как распределение признаков не подчинялось закону нормального распределения, использовались непараметрические методы статистического анализа. Данные представлены как Ме [0,25; 0,75]. Статистическую значимость различий определяли по критерию u-Манна-Уитни. Показатели считали значимыми при p<0.05.

Результаты и обсуждение

В плазме крови (табл. 1) наиболее высокие показатели МДА выявлены у больных ХП при длительности заболевания 6-9 лет с повышением на 216% (р<0,001), однако, статистически значимых различий с группой 1 не получено. В группе с длительностью заболевания 10-15 лет уровень МДА повышен на 50% (р<0,002), что значимо ниже, чем в первые 9 лет заболевания (р<0,05).

При исследовании системы глутатиона в плазме крови (табл. 1) при обострении ХП отмечено повыше-

Таблица 1

Система глутатиона и уровень МДА в плазме крови у больных с хроническим панкреатитом средней степени тяжести в фазе обострения в зависимости от длительности заболевания (медиана, нижний и верхний квартиль)

№ Группы n GSH ГТ ГПО ГР МДА

1 Группа 1 28 19 (13-35) 0,37 (0,28-0,47) 2,6 (1,4-4,7) 0,31 (0,23-0,38) 28 (20-36)

p — группа 1 и ГКС 0.01** 0,02 0,4 0,9 0.002**

% — группа 1 и ГКС +58 +28 + 141

2 Группа 2 22 24 (12-36) 0,34 (0,29-0,44) 3.3 (1,4-4,5) 0,28 0,18-0,43) 36,7 (17-58)

p — группа 2 и ГКС 0,002*** 0,04 0,9 0,4 0,001***

% — группа 2 и ГКС + 100 + 17 +216

3 Группа 3 20 12 (12-24) 0.35 (0,26-0,49) 2,6 (1,06-4,06) 0,28 (0.22-0.42) 17,4 (14,5-19)

p — группа 3 и ГКС 0,4 0,07 0,2 0,7 0,002

% — группа 3 и ГКС +50

4 ГКС 23 12 (12-18) 0.29 (0,23-0,31) 2,8 (2,4-3,1) 0,29 (0,26-0,34) 11,6 (3,9-21,3)

GSH - глутатион (мкмоль/л); ГТ - глутатионтрансфераза (нмоль/мин на 1 мг белка); ГПО - глутатионпероксидаза (нмоль/мин на 1 мг белка); ГР - глутатионредуктаза (нмоль/мин на 1 мг белка).

Примечание: * — обозначена статистическая значимость различий показателей между группами 1 и 2; ** между группами 1 и 3; *** между группами 2 и 3 (р<0,05).

ложения, что с увеличением длительности заболевания ХП процессы воспаления постепенно стихают и сменяются процессами фиброза ПЖ.

При исследовании системы глутатиона в эритроцитах (табл. 2) определено снижение ОвИ в группе 1 и в группе 2 на 20% (р<0,005), при длительности заболевания более 10 лет — на 15% (р<0,04). Дефицит этого 8И-содержащего трипептида в эритроцитах может свидетельствовать о напряжении антиоксидантной защиты, выступая в качестве наиболее раннего показателя усиления окислительных процессов в клетках и может

способствовать прогрессированию заболевания.

Одновременно наблюдались изменения активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах. В группе с длительностью заболевания 2-5 лет дефицит ОвИ в ЭР сопровождается активацией ГР в ЭР на 30% (р<0,02). Следует отметить, что сопряженное увеличение активности ГР с одновременным снижением ОвИ в ЭР и при нормальном функционировании ГПО и ГТ в ЭР может указывать на значительный расход ОвИ и отражать процессы адаптации. Активность ГТ в ЭР была стабильна. Отмечено прогрессирующее снижение активности ГПО в ЭР с увеличением длительности заболевания. При длительности до 5 лет активность ГПО в ЭР со-

ние ОвИ в группе 1 и группе 2 на 58% (р<0,01) и 100%

(р<0,02), повышение активности ГТ на 28% (р<0,02) и 17% (р<0,04) соответственно, вследствие выхода из клетки, обусловленного повреждением клеток поджелудочной железы или повышением проницаемости сосудов [3]. Однако, статистически значимых различий между группой 1 и группой 2 не получено. Активность ГР, ГПО в плазме была стабильна, вероятнее всего, вследствие большей молекулярной массы, чем ГТ. Полученные результаты свидетельствуют в пользу предпо-

Табпица 2

Система глутатиона в эритроцитах крови у больных с хроническим панкреатитом средней степени тяжести в фазе обострения (медиана, нижний и верхний квартиль)

№ Группы n GSH ГТ ГПО ГР

1 Группа 1 28 1,27 (1,03-1,5) 5,6 (4,5-7,3) 13,7 (6-19,6) 2.8 (1,9-3,99)

p — группа 1 и ГКС 0,001 0,8 0,07* 0,02*

% — группа 1 и ГКС -20 +30

2 Группа 2 22 1,27 (0,96-1,46) 4,94 (4,4-7,2) 12,9 (4,6-16,5) 2,24 (1,45-3,5)

p — группа 2 и ГКС 0,003*** 0,5 0,01*** 0,6

% — группа 2 и ГКС -20 -21

3 Группа 3 20 1.34 (0,97-1,43) 11,3 (4.3-14,2) 1,9 (1,1-3,06)

p — группа 3 и ГКС 0,001 0,2 0,001** 0,6

% — группа 3 и ГКС - 15 -31

4 ГКС 23 1.58 (1,31-1,62) 5.9 (4.62-6.27) 16,4 (13,5-20,2) 2,15 (2.88-3.38)

GSH - глутатион (мкмоль/л); ГТ - глутатионтрансфераза (нмоль/мин на 1 мг белка); ГПО - глутатионпероксидаза (нмоль/мин на 1 мг белка); ГР — глутатионредуктаза (нмоль/мин на 1 мг белка).

хранена, при длительности от 6 до 9 лет — снижена на 21%, от 10 до 15 лет — на 31%, что, возможно, связано с дефицитом селена, который в последнее время считается важным аспектом развития панкреатита на фоне нарушения утилизации и абсорбции микроэлемента вследствие дефицита пищеварительных ферментов при ХП и соблюдения пациентами диетических рекомендаций, в которых ограничены продукты, богатые селеном [2, 4]. Снижение глутатионпероксидазной активности может приводить к накоплению свободных радикалов и усугублять развитие окислительного стресса с негативным влиянием на клетки и ткани.

Таким образом, полученные нами результаты указывают, что на момент диагностики заболевания имеются признаки активного окислительного стресса, сопровождающегося в первые годы адаптивными компенсато-рыми изменениями глутатионовой системы в ЭР, а в последующие годы течение заболевания характеризуется механизмами дезадаптации и дисбалансом глутатионперокси-дазной активности, что способствует прогрессированию заболевания. Изменения системы глутатиона в плазме крови отражают интенсивность воспалительной реакции при обострении ХП и свидетельствуют в пользу предположения, что с увеличением длительности заболевания ХП процессы воспаления постепенно стихают и сменяются процессами фиброза ПЖ.

ЛИТЕРАТУРА

Примечание: * — обозначена статистическая значимость различий показателей между группами 1 и 2;

** между группами 1 и 3; *** между группами 2 и 3 ( р<0,05).

1 Барабой В.А. Механизмы стресса и пере-кисное окисление липидов // Успехи современной биологии. — 1991. — Т. 111. № 6. — С. 923-932.

2 Барабой В. А., Шестакова Е.Н. Селен в питании человека // Украинский био-

химический журнал. — 2004. — Т. 76, № 1. — С. 23-31.

3 Купинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона // Биомедицинская химия. — 2009. — Т. 55. Вып. 3. — С.255-277.

4 Фадеенко Г.Д., Дубров К.Ю. Селенсодержащие препара-

ты в лечении больных хроническим панкреатитом // Частная гастроэнтерология — 2010. — №5 (55). — С. 69-74.

5 McCloy R. Chronic pancreatitis at Manchester, UK. Focus on antioxidant therapy // Digestion — 1998. — Vol. 59. Suppl. 4. — P. 36-48.

Информация об авторах: Меринова Надежда Иннокентьевна — аспирант, e-mail: [email protected]; Козлова Наталия Михайловна — д.м.н., заведующий кафедрой, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1, тел. (3952) 243433, e-mail: [email protected]; Колесниченко Лариса Станиславовна — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой, e-mail: [email protected]; Суслова Антонина Ильинична — к.м.н., доцент; Ясько Михаил Владимирович — к.м.н., доцент; Егорова Ирина Эдуардовна — к.м.н., старший преподаватель; Бахтаирова Вера Ильинична — к.м.н., доцент; Булавинцева Ольга Алексеевна — к.м.н., старший преподаватель;

Леонова Зоя Алексеевна — к.м.н., ассистент.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В АНАЛИЗЕ ТАБЛЕТОК «ПИКАМИЛОН»

Наталья Владимировна Чмелевская1, Елена Анатольевна Илларионова1, Галина Афанасьевна Федорова2 ('Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра фармацевтической и токсикологической химии, зав. — д.х.н., проф. Е.А. Илларионова;

2Лимнологический институт Сибирского отделения РАН, директор — д.х.н., акад. РАН М.А. Грачев)

Резюме. Предложены оптимальные условия количественного анализа таблеток «Пикамилон» с использованием метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия анализа: градиентное элюирование в системе перхлорат лития, хлорная кислота и вода — ацетонитрил (МеСЫ), градиент линейный 800 мкл от

5 до 40%; 700 мкл 40% ацетонитрила при скорости потока 150 мкл/мин и температуре 35oC. Относительная ошибка определения по предложенной методике для составила не более 2,04%.

Ключевые слова: пикамилон, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, градиент, ацетонитрил, лития перхлорат.

mGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ANALYSIS OF THE TABLETS «PYCAMILON»

N. V Chmelevskaya1, E. A. Illarionova1, G.A. Fedorova2 ('Irkutsk State Medical University; 2Scientific Institute of Limnology, Siberian Branch of RAS, Russia)

Summary. The optimal conditions for quantitative analysis of the tablets «Pycamilon»using the high-performance liquid chromatography have been proposed. Conditions of analysis: gradient elution in the system of lithium perchlorate, perchloric acid and water [4 M LiCl04-0, 1 M HClOJ — H2O — acetonitrile (MeCN), the gradient line in 800 mcl of 5 to 40%, 700 mcl 40% acetonitrile at a flow rate of 150 ml / min and a temperature of 35oC. The relative error in the determination of the developed technique was no more than 2,04%.

Key words: pycamilon, high-performance liquid chromatography method, gradient, acetonitrile, lithium perchlorate.

Обеспечение населения высококачественными лекарственными средствами — одна из важнейших задач, стоящих перед здравоохранением и фармацевтической наукой.

Одной из главных проблем современной медицины является лечение заболеваний, связанных с нарушением мозгового кровообращения лёгкой и средней тяжести, состояний тревоги, страха, повышенной раздражительности, абстиненции у больных [1, 5].

Объектом настоящего исследования является лекарственное средство, улучшающее мозговое кровообращение: таблетки пикамилона.

Согласно нормативной документации [6] количественное определение пикамилона в таблетках проводят спектрофотометрическим методом с использованием рабочего стандартного образца (РСО). Все большее практическое значение находят хроматографические методы анализа, в том числе высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая обеспечивает высокую чувствительность, специфичность и экспресс-ность анализа.

Целью настоящей работы являлось разработка методики анализа таблеток «Пикамилон» с использованием метода ВЭЖХ.

Материалы и методы

В работе использовали микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова»,

Новосибирск) с ультрафиолетовым спектрофотометрическим детектором, снабженным стальной колонкой (75х2 мм), заполненной сорбентом Silasorb SPH C18 с размером частиц 5 мкм. Эффективность колонки — 3500 т.т. Температура колонки 35°С. Также использовали центрифугу «Eppendorf» (Германия), рН метр «Анион 4100» (РФ), ультразвуковую баню RK 100 «Bandelin electronic» (Германия).

І

о

200 240 280 320 ЗвО

___________________________Длина «о л мы. мм______________________

Рис. 1. Нормированный УФ-спектр пикамилона.

Malondialdehyde and glutathione antioxidant protection in the blood of patients with an exacerbation of chronic pancreatitis depending on the duration of the disease

Текст научной работы на тему «Малоновый диальдегид и система глутатиона в крови у больных хроническим панкреатитом в зависимости от длительности заболевания»