CC BY
65УДК 621,384.8:576.32;
МАЬВЬТОР МАСС-
СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
МЕДИЦИНСКИ
ЗНАЧИМЫХ
МИКРОМИЦЕТОВ (ОБЗОР)
Полищук А.Г. (ведущий научный сотрудник)*
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Полищук А.Г., 2011
Времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-акти-вированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЬВ1-ТОР МС)
- это метод идентификации микроорганизмов, основанный на анализе их белкового содержимого. Высокая точность идентификации бактерий этим методом была подчеркнута в большом количестве публикаций. Метод экономичен по затратам времени и финансовых средств, в сравнении с обычно применяемыми биохимическими системами идентификации (БСИ), и подходит для рутинной диагностики, базирующейся на высокой пропускной способности. В статье описано текущее состояние МАЬВ1-ТОР МС систем для идентификации медицински значимых микроми-цетов. Для нитчатых грибов метод МАЬВ1-ТОР МС находится на ранней стадии развития.
Ключевые слова: идентификация видов, МАЬ01-Т0Р масс-спектрометрия, медицински значимые микромицеты
IDENTIFICATION OF CLINICALLY RELEVANT FUNGI BY MALDI-TOF MASS-SPECTRO-METRY
Polischuk A.G. (leading scientific collaborator)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after 1.1. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Polischuk A.G., 2011
Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a method for identification of microorganisms based on analysis of their protein content. Numerous studies have demonstrated the accuracy of this technology for bacterial identification. It is a time-saving and less expensive alternative to conventional biochemical identification systems (BIS), and it is suitable for high-throughput routine diagnostics. In this article a current status of development of MALDI-TOF systems for identification of clinically relevant fungi is described. For filamentous fungi, the technique is at early stage of development.
Key words: clinically relevant fungi, MALDI-TOF mass-spectrometry
* Контактное лицо: Полищук Анна Генриховна Тел.: (812) 303-51-40
ВВЕДЕНИЕ
Прямое белковое профилирование с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матричноактивированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS от англ. matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry) является методом быстрой видовой идентификации патогенных микроорганизмов.
Масс-спектрометрия (МС) - измерение молекулярной массы ионов по их поведению в электрических или магнитных полях. Она осуществляется посредством разделения разных масс в пространстве и времени. MALDI-TOF - это вариант МС, в котором применяют технологию «мягкой» ионизации под действием лазерного излучения, позволяющую анализировать молекулы с большой молекулярной массой, в частности, молекулы белков [1]. С помощью метода можно анализировать белковую фракцию микробной клетки без фракционирования и очистки отдельных белков (прямое белковое профилирование) и получать с высокой точностью и разрешением уникальные для данного вида микроорганизма масс-спектры, характеризующие исследуемый объект по типу «отпечатков пальцев», Метод был разработан 23 года назад [2, 3], его начали использовать для идентификации бактерий в научно-исследовательских лабораториях с конца 1990 годов, а для рутинной диагностики бактерий в микробиологических лабораториях - с 2009 г. [4]. Первая публикация по идентификации патогенных грибов с использованием технологии MALDI-TOF МС появилась в 2007 г. [5].
Процедура идентификации
Первый этап видовой идентификации патогенных грибов с использованием MALDI-TOF МС - получение чистой культуры гриба из клинического материала. Следующими этапами являются пробоподготов-ка, получение белковых спектров лизированного материала с применением масс-спектрометрического оборудования, обработка полученных спектров с использованием специального программного обеспечения и сравнение полученного спектрального профиля с теми, что имеются в белковой спектральной базе данных. В спектральной базе данных каждому виду микромицета соответствует специфический набор масс-спектров, в чем и заключается принцип видовой идентификации грибов. Процесс пробопод-готовки включает в себя лизис клеток гриба и кокри-стализации на подложке лизированного материала с веществом-матрицей, функция которой заключается в способствовании перехода молекул лизата в газовую фазу и их ионизации. Подложку затем помещают в MALDI-TOF МС инструмент, в котором под воздействием импульсов лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом происходят его десорбция (переход в газовую фазу) и ионизация, образовавшиеся ионы разделяются в электрическом
поле и детектируются, а их масса анализируется с помощью специального программного обеспечения. В настоящее время для рутинной идентификации микроорганизмов используют MALDI-TOF МС оборудование производства компаний Bruker Daltonik GmbH (Германия) и Shimadzu (Япония). Bruker Daltonik GmbH предлагает, в сочетании с MALDI-TOF МС инструментом, свое программное обеспечение и белковую спектральную базу данных (Biotyper). В MALDI-TOF МС систему от Shimadzu входит программное обеспечение этой компании (Launchpad software) и база данных SARAMIS, разработанная компанией AnagnosTec GmbH (Германия) и недавно приобретенная компанией BioMerieux (Франция). Описана и другая система (программное обеспечение с базой данных) - Andromas (Франция), которая может быть использована с масс-спектрометрами обеих компаний Bruker Daltonik и Shimadzu.
Для получения чистой культуры патогенных микромицетов требуется от трех-пяти дней (дрожжевые организмы) до трех недель (дерматомице-ты), в то время как для всех остальных этапов масс-спектрометрической идентификации - ~1-2 часа. Поэтому исключение этапа получения культуры гриба из процедуры идентификации является ключевым моментом для существенного сокращения времени идентификации. Получение четкой белковой масс-спектральной картины, специфичной для патогенного микроорганизма, непосредственно в клинических образцах методически затруднено из-за наличия в лизированном материале комплекса белковых молекул, принадлежащих клеткам пациента, а также в случае использования жидких сред для выращивания патогена, белковых компонентов сред. В связи с этим в настоящее время проводят интенсивные исследования с целью разработки способа очистки белков гриба от контаминирующего материала, присутствующего в клинических образцах. Ко времени написания этой статьи опубликованы три работы, в которых представлены результаты усовершенствования этапа пробоподготовки для идентификации дрожжеподобных микромицетов непосредственно в образцах крови. В работе Marinach-Patrice С. с соавторами использовали кровь здоровых людей, инокулирован-ную определенным количеством клеток Candida sp. Образцы крови культивировали в гемокультиваторе Bactec до тех пор, пока они не регистрировались прибором как положительные, и, затем, проводили МС анализ. Для получения масс-спектров, достаточных для анализа качества, авторы использовали 2 мл положительной культуры и 1,5 мл 0,1% додецилсульфа-та натрия в качестве лизирующего агента. Используя этот метод пробоподготовки, они смогли правильно идентифицировать все образцы Candida spp. [6]. Fer-roni А. с коллегами использовали 5% раствор сапонина для селективного разрушения эритроцитов крови и высвобождения интактных дрожжевых клеток, которые затем концентрировались центрифугированием. Клеточный концентрат далее анализировали
в масс-спектрометре. Таким образом значительно снижался белковый спектральный фон от клеточных компонентов крови и обеспечивался читаемый масс-спектр, специфичный для анализируемого микроми-цета. В этой работе была успешно проведена идентификация Candida spp. не только в инокулированных клетками дрожжей образцах крови здоровых людей, но и в положительных образцах крови пациентов [7]. И, наконец, Yan Y. с соавторами использовали набор реактивов для пробоподготовки (MALDI Sepsityper kit), разработанный Bruker Daltonik и предназначенный для идентификации бактерий и дрожжеподобных микромицетов непосредственно из образцов крови. С применением этого набора не была получена надежная видовая идентификация. Авторы статьи добавили к процедуре пробоподготовки две отмывки образцов водой (до этапа лизиса с использованием Sepsityper) и с помощью этой модификации добились 100% корректной идентификации Candida spp. в 43 образцах крови пациентов, зарегистрированных в Bactec FX культиваторе как положительные [8].
Диагностическая чувствительность MALDI-TOF MC
В одиннадцати из двенадцати исследований чувствительность масс-спектрометрической идентификации микромицетов была 95-100% и только в одном исследовании - 85%. Чувствительность идентификации измеряли как процент совпадения результатов масс-спектрометрического анализа с результатами референсного метода идентификации. Референсным методом для идентификации нитчатых Aspergillus spp., Fusarium spp. и дерматомицетов было сикве-нирование определенных фрагментов их ДНК и исследование морфологии этих грибов [5, 9-11]. Для дрожжей и дрожжеподобных грибов в качестве референсного метода использовали либо определение эффективности метаболических процессов в клетках грибов (биохимический метод), либо сочетание этого метода с сиквенированием фрагментов генов рибо-сомальной ДНК грибов [8, 12-17]. В последнем случае, сначала сравнивали результаты биохимических тестов и МС анализа, а затем, в случае несовпадения результатов этих двух анализов, использовали метод сиквенирования для подтверждения результата. В качестве биохимических систем идентификации использовали API тесты и VITEK колориметрические карты компании BioMerieux, Murex/Remel (США) и Auxacolor тест компании Bio-Rad (США). С применением API и VITEK биохимических систем измеряют способность дрожжевых грибов утилизировать углеводы, кроме этого, с помощью VITEK анализируют активность некоторых ферментов углеводного, белкового и жирового обменов и способность утилизировать некоторые источники азота (всего 63 биохимические реакции). В случаях несовпадения результатов МС и биохимической идентификации, сиквенированием обычно подтверждали видовую идентификацию, полученную МС методом, что сви-
детельствовало о его большей чувствительности по сравнению с биохимическим методом. Еще раз подчеркнем, что в случае дрожжевых изолятов сиквени-ровались только те образцы, для которых результаты МС и биохимической идентификации не совпадали (5-9% всех проанализированных образцов), и, таким образом, истинный процент совпадения результатов МС и сиквенирования не известен. Однако в случае нитчатых микромицетов сиквенировались все образцы, которые проходили МС идентификацию, и доля совпавших результатов этих двух анализов составила 98,5-100%.
MALDI-TOF МС обладает большей дискриминационной способностью по сравнению с биохимическими методами идентификации. Например, с помощью API/VITEK системы не удается разделить генетически гетерогенную популяцию Candida parapsilosis на группы, в то время как с помощью MALDI-TOF МС были выделены 3 группы, составляющие вид С. parapsilosis: С. parapsilosis, С. metapsilosis и С. ог-thopsilosis [12]. Разделение вида С. parapsilosis на три новых вида подтверждено результатами сиквенирования и других молекулярных методов [12]. Дискриминация между этими видами может быть важна с терапевтической точки зрения, поскольку недавно было показано, что С. parapsilosis, С. metapsilosis и С. orthopsilosis имеют разные профили чувствительности к эхинокандинам [18].
Аналитическая чувствительность MALDI-TOF МС
Yan Y. с соавторами оценили минимальную концентрацию обнаруживаемых дрожжевых клеток в позитивных культурах крови пациентов, которая обеспечивает надежную видовую идентификацию методом MALDI-TOF МС. Она оказалась равна 600 000 КОЕ/мл [8]. Для сравнения, MALDI-TOF масс-спектрометрическая чувствительность обнаружения бактерий составляет «1000 КОЕ/мл [19,20], а с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) возможно обнаружить одну клетку патогенного гриба в 1 мл крови [21].
Факторы, влияющие на эффективность идентификации
Одним из основных условий для успешной видовой идентификации микроорганизмов является качество референсной масс-спектрометрической базы данных. В качестве референсных баз данных в работах использовали или коммерческие базы данных - Biotyper 2.0, SARAMIS, Andromas [7, 8, 11-14, 17], или базы данных, созданные самими авторами работ [5, 6, 9, 10]. Был и промежуточный вариант, когда коммерческие базы данных дополняли в ходе выполнения работы [15,16]. Ярким примером, иллюстрирующим влияние наполненности референсной базы данных на эффективность видовой идентификации, является работа Marklein G. с соавторами по видовой идентификации дрожжевых изолятов. При
первом раунде идентификации, когда авторы использовали коммерческую масс-спектральную базу данных Biotyper 2.0 в качестве референсной, удалось правильно идентифицировать 90% образцов. Однако после того, как авторы дополнили Biotyper 2.0 масс-спектрометрическими «фингерпринтингами» тех видов рода Candida, которые отсутствовали в этой базе, но присутствовали (по результатам сиквенирования) в анализируемой выборке, оставшиеся 10% образцов были также успешно идентифицированы [16].
Качество референсной базы масс-спектров также зависит от того, насколько она полно отражает физиологические особенности грибов. Каждую минуту в клетке живых организмов происходят мириады событий, изменяющих ее белковый состав качественно и количественно. Эти изменения необходимы для пространственной и временной регуляции физиологических процессов в клетке, в частности, для перехода гриба из одного физиологического состояния в другое (например, из фазы активного роста в фазу споруляции). Учитывая это, Alanio А. с коллегами создали масс-спектральную базу Aspergillus spp., которая включила спектры белков, полученных из материала молодых и спорулирующих колоний. Таким образом, стало возможным получение высоко воспроизводимых результатов в независимости от зрелости тестируемого изолята [9].
Еще одним важным фактором, влияющим на качество получаемых спектров и на воспроизводимость результатов, является изменение спектрального состава клетки в ходе адаптации грибов к различным условиям существования. Так, например, было показано, что масс-спектральная картина клеток гриба изменяется в зависимости от температуры и времени выращивания, а также состава питательной среды [10, 22, 23]. Таким образом, стандартизация условий выращивания является еще одним ключом к успешной видовой идентификации микромицетов с использованием масс-спектрометрического анализа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Технология MALDI-TOF масс-спектрометрической идентификации микромицетов имеет ряд преимуществ перед биохимическими методами идентификации. Она обладает высокой скоростью измерения, низкой стоимостью используемых реактивов и материалов и простой пробоподготов-кой. В экспериментальных работах показано, что MALDI-TOF МС обладает высокой диагностической чувствительностью и дискриминационной способностью. Хотя пока не оценено, как MALDI-TOF МС функционирует в рутинной диагностике микромицетов, эти ее качества отвечают требованиям, предъявляемым к технологиям, используемым в рутинной диагностической практике. Технология имеет, однако, на данном этапе развития существенный недостаток - она обладает низкой аналитической чувствительностью, поэтому идентификация микро-
мицетов напрямую в клиническом материале остает- деленные успехи в этом направлении, а принимая во
ся проблемой. Для повышения порога обнаружения внимание стремительность развития MALDI-TOF
патогенных грибов необходимо введение допол- МС технологии, вполне вероятно, что идентифи-
нительной процедуры в процесс пробоподготовки, кация микромицетов в клиническом материале без
позволяющей «обогащать» материал клинического предварительного получения чистой культуры гриба
образца грибными белками. Уже достигнуты опре- будет возможна в скором будущем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Sauer S., Kliem М. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria //Nat. Rev. Microbiol. -2010. - Vol. 8. - P. 74-82.
2. Tanaka K., Waki H., Ido Y., et al. Protein and polymer analyses up to nYz 100000 by laser ionization time-of-flight mass
spectrometry //Rapid Commun. Mass Spectrom. - 1988. - Vol. 2. - P. 151-153.
3. Karas М., Bachmann D., BahrD., Hillenkamp F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. - 1987. - Vol. 78. - P. 53-68.
4. Emonet S., Shah H.N., Cherkaouil A., Schrenzel J. Application and use of various mass spectrometry methods in clinical
microbiology //Clin. Microbiol. Infect. - 2010. - Vol. 16. - P. 1604-1613.
5. Erhard М., Hipler U-C., Burmester A., et al. Identification of dermatophyte species causing onychomycosis and tinea pedis by MALDI-TOF mass spectrometry // Exp. Dermatol. - 2008. - Vol. 17. - P. 356-361.
6. Marinach-Patrice C., FekkarA., Atanasova R., et al. Rapid species diagnosis for invasive candidiasis using mass spectrometry //PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - e8862.
7. Ferroni A., Suarez S., Beretti J.L., et al. Real-time identification of bacteria and Candida species in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - P. 1542-1548.
8. Yan Y., He Y., Maier Т., etal. Improved identification of yeast species directly from positive blood culture media by combining Sepsityper specimen processing and Microflex analysis with the matrix-assisted laser desorption ionization Biotyper system // J. Clin. Microbiol. - 2011. - Vol. 49. - P. 2528-2532.
9. Alanio A., Beretti J.L., Dauphin B., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for fast and accurate identification of clinically relevant Aspergillus species // Clin. Microbiol. Infect. - 2011. - Vol. 17. - P. 750-755.
10. Marinach-Patrice C., Lethuillier A., Marly A., etal. Use of mass spectrometry to identify clinical Fusarium isolates //Clin. Microbiol. Infect. - 2009. - Vol. 15. - P. 634-642.
11. Seyfarth F., Ziemer М., Sayer H.G., et al. The use of ITS DNA sequence analysis and MALDI-TOF mass spectrometry in diagnosing an infection with Fusarium proliferatum //Exp. Dermatol. - 2008. - Vol. 17. - P. 965-971.
12. Quiles-Melero I., Garcia-Rodriguez J., Gomez-Lopez A., Mingorance J. Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for identification of Candida parapsilosis, C. orthopsilosis and C. metapsilosis //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2011. - doi 10.1007/sl0096-011-1277-z.
13. Bader O., WeigM., Taverne-Ghadwal L., et al. Improved clinical laboratory identification of human pathogenic yeasts by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry //Clin. Microbiol. Infect. - 2011. - Vol. 17.
- P. 1359-1365.
14. Putignani L., Del Chierico F., OnoriM., etal. MALDI-TOF mass spectrometry proteomic phenotyping of clinically relevant fungi // Mol. Biosyst. - 2011. -Vol. 7. - P. 620-629.
15. Stevenson L.G., Drake S.K., Shea Y.R., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of clinically important yeast species II]. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - P. 3482-3486.
16. Marklein G., Josten М., Klanke U., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates // J. Clin. Microbiol. - 2009. -Vol. 47. - P. 2912-2917.
17. van Veen S.Q., Claas E.C.J., Kuijper Ed J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories II]. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - P. 900-907.
18. Lockhart S.R., Messer S.A., Pfaller M.A., Diekema D.J. Geographic distribution and antifungal susceptibility of the newly described species Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis in comparison to the closely related species Candida parapsilosis II]. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 2659-2664.
19. Guo Z., Liu Y., Li S., YangZ. Interaction of bacteria and ion-exchange particles and its potential in separation for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric identification of bacteria in water // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2009. - Vol. 23. - P. 3983-3993.
20. Zhou N, WangN, Xu B., et al. Whole-cell matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for rapid identification of bacteria cultured in liquid media // Sci. China Life Sci. - 2011. -Vol. 54. - P. 48-53.
21. White P.L., Bretagne S., KlingsporL., etal. Aspergillus PCR: One Step Closer to Standardization// J. Clin. Microbiol. - 2010.
- Vol. 48. - P. 1231-1240.
22. Hettick J.M., Green B.J., Buskirk A.D., et al. Discrimination of Penicillium isolates by matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting //Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2008. - Vol. 22. - P. 2555-2560.
23. Qian J., Cutler J. E., Cole R. B., Cai Y. MALDI-TOF mass signatures for differentiation of yeast species, strain grouping and monitoring of morphogenesis markers //Anal. Bioanal. Chem. - 2008. - Vol. 392. -P. 439-449.
Поступила в редакцию журнала 15.10.2011
Рецензент: С.В. Сидоренко
