CC BY
42
М235Т ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА АНГИОТЕНЗИНА И Е298Р ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА У ЖЕНЩИН С ГЕСТОЗОМ
И.П. Князева, Л.М. Самоходская, Т.А. Косикова
Лаборатория генных и клеточных технологий Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Ломоносовский пр., 31-5, Москва, Россия, 119192
В.Е. Радзинский, Т.В. Галина, Ф.М. Есенеева
Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, Москва, Россия, 117198
К.М. Рябцев
Городская клиническая больница № 29 Госпитальная площадь, 2, Москва, Россия, 111020
При оценке генетического анализа крови (методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с рестрикцией и ПЦР в реальном времени) 59 пациенток с гестозом и 50 женщин с физиологической беременностью обнаружено, что частота встречаемости генотипа ТТ полиморфизма М235Т гена ангиотензина (ЛОТ) значительно ниже у женщин с гестозом (Р = 0,0472). У женщин с гестозом обнаружена и более низкая частота аллеля Т (р = 0.0776). Генотип ОО полиморфизма 894О > Т гена эндотелиальной синтазы оксида азота (N083) выше в основной группе (р > 0.05). Частоты Т- и О-аллелей и гетеро-зигот в обеих группах не имеют статистически значимых отличий. Достоверность значений определялась в программе БТЛТ18Т1СЛ при подсчете значения р по точному двустороннему тесту Фишера. Таким образом, генотип ТТ полиморфизма М235Т гена ЛОТ оказывает протективную роль в развитии гестоза. Полиморфизм 894О > Т гена N083 не причастен к развитию гестоза среди русских женщин.
Ключевые слова: беременность, гестоз, полиморфизмы, генотип, факторы риска.
Гестоз остается одной из наиболее актуальных проблем в современном акушерстве. В мире частота гестоза варьирует в широких пределах и составляет от 3 до 14-21% [1, 6]. Ежегодно в мире от гестоза погибают 14% женщин (50 000-75 000), а перинатальная смертность составляет 900 000 детей [3; 14]. В структуре материнской смертности по РФ частота гестоза составляет 6,2% и занимает 4-е место после кровотечений (23,4%), экстрагени-
тальных заболеваний (22,3%) и септических состояний (13,1%) (по данным Росздравнадзора за 2008 г.). Гестоз остается основной причиной заболеваемости новорожденных (640-780%о) и перинатальной смертности (18-30%о) [2]. По данным ВОЗ, у каждого 5-го ребенка, родившегося от матери с гестозом, в той или иной степени происходит нарушение физического и психоэмоционального развития, значительно выше уровень заболеваемости в младенческом и раннем детском возрасте.
Признанными факторами риска этого осложнения беременности являются: предыдущие беременности с гестозом, семейный анамнез гестоза, первые роды, множественная беременность, возраст матери более 40 лет, интервал между беременностями более или равный 10 годам, беременности от разных отцов, антифосфолипидный синдром, хроническая артериальная гипертензия, сахарный диабет, заболевания почек, аутоиммунные заболевания, дислипидемия и ожирение [3; 7; 10; 13].
Чаще гестоз развивается у беременных с предшествующей хронической артериальной гипертензией, сахарным диабетом, заболеваниями почек, дис-липидемией. С другой стороны, известно, что у женщин, не страдавших до беременности экстрагенитальными заболеваниями, высока вероятность ее развития после беременности, осложненной гестозом. Отмеченная связь экстрагенитальной сердечно-сосудистой, эндокринной и другой заболеваемости с гестозом предполагает наличие единых патогенетических факторов [3; 11].
Согласно современным представлениям, гестоз рассматривают как генетически детерминированную недостаточность процессов адаптации материнского организма к новым условиям существования, которые возникают с развитием беременности [1; 10]. Роль генетических факторов в развитии гестоза составляет более 50%, и вклад материнских генов в этот процесс превышает генетическую компоненту плода [4; 5; 12].
В настоящее время было изучено более полусотни генов-кандидатов, предположительно связанных с развитием гестоза, однако около 70% опубликованных исследований сосредоточено на 8 из них. Это гены, кодирующие элементы ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (ангиотензино-ген, ангиотензин-превращающий фермент, рецепторы к ангиотензину II); элементы системы гемостаза (V фактор свертывания крови, протромбин, ме-тилентетрагидрофолатредуктаза); эндотелиальную N0 синтазу, связанную с функцией эндотелия; цитокин ФНО (фактор некроза опухоли) а, участвующий в воспалительном ответе [3].
Учитывая связь гестоза с экстрагенитальными заболеваниями, для получения более достоверных результатов в основную группу были включены пациентки с «чистым» гестозом. Задачей нашего исследования явилось изучение аллельного состава генотипов беременных с «чистым» гестозом по генам М235Т ЛОТ и Б298Б N083.
Материал и методы исследования. В проспективное исследование вошло 59 беременных и родильниц с чистой формой гестоза, 50 родильниц составили контрольную группу. Критерии включения для контрольной группы: физиологическое течение беременности, родов и послеродового периода; доношенная беременность сроком 37-42 нед. с нормальной массой плода; одноплодная беременность; отсутствие симптомов гестоза; оба родителя принадлежат к европеоидной (кавкасиоидной) расе (к славянской народности); удовлетворительный социально-экономический уровень жизни семьи. Критерии включения для группы гестоза: наличие у беременных симптомов гестоза различной степени тяжести («чистый» гестоз); одно-плодная беременность; оба родителя принадлежат к славянской народности; удовлетворительный социально-экономический уровень жизни семьи. Критерии исключения для группы контроля: экстрагенитальные заболевания и наличие специфических инфекций; фетоплацентарная недостаточность и задержка роста плода во время настоящей беременности; гестоз в анамнезе (и в анамнезе близких родственниц). Критерии исключения для группы женщин с гестозом: сопутствующие экстрагенитальные заболевания, диагностированные вне беременности; наличие специфических инфекций; ней-роинфекции, черепно-мозговые травмы в анамнезе; нейродегенеративные заболевания, опухоли головного мозга; наличие у плода аномалий развития; вредные привычки женщины (курение, злоупотребление алкоголем, наркотиками).
Критерии диагноза «гестоз»: артериальная гипертензия (повышение систолического давления > 135 мм рт. ст., диастолического > 85 мм рт. ст.), при гипотензии - увеличение систолического АД на 30 мм рт. ст. и более от исходного до беременности, а диастолического - на 15 мм рт. ст. и выше; протеинурия - от 300 мг/сутки; отеки ног, рук, живота, лица (не пропадают после ночного отдыха), патологическая прибавка массы тела (> 350 г за неделю, неравномерно). Оценка тяжести состояния пациенток проводилась по шкале Goecke в модификации Г.М. Савельевой.
Беременные основной и контрольной групп были сопоставимы по возрасту, количеству беременностей и родов в анамнезе.
Для генетического исследования выполнялась экстракция геномной ДНК на сорбенте из лимфоцитов периферической цельной крови при помощи коммерческого набора «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Москва).
Характеристика исследованных аллельных вариантов генов приведена в табл. 1.
Определение аллельных вариантов гена AGT (M235T полиморфизм) проводили методом ПЦР в реальном времени (real time PCR) при помощи real time амплификатора «Rotor-Gene RG-3000» («Corbett research», Австралия). Определение аллельных вариантов гена NOS3 (E298D полиморфизм) проводили методом ПЦР при помощи амплификатора «Mastercycler
gradient» («Eppendorf», Германия) с последующей рестрикцией полученных ампликонов эндонуклеазой согласно рекомендациям фирмы-изготовителя («Fermentas», США) (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика исследованных генов и их аллельных вариантов
Ген, локализация Название белкового продукта гена Полиморфизм Эндону-клеаза
ДНК продукта
AGT (1q42-q43) Ангиотензиноген 803T > C M235T (Met235Thr)
NOS3 (7q36) Эндотелиальная NO-синтаза (NO-синтаза 3-го типа) 894G > T Е298D (Glu298Asp) MboI (KzoI)
Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов выбирали из интернет-баз «Nucleotide» и «Ensembl» (США). Праймеры, необходимые для проведения ПЦР этих фрагментов, подбирали с использованием программы «BLAST» (NCBI, США).
Для электрофореза и визуализации результатов продукты амплификации и рестрикции разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном водным раствором бромистого этидия (0,1 мкг/мл). Результаты анализа фиксировали с помощью системы видео-гель-документации «Versa Doc RG 3000» («BioRad», США).
Достоверность значений определялась в программе STATISTICA при подсчете значения p по точному двустороннему тесту Фишера.
Эксперименты соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, разработанной в соответствии с Хельсинкской декларацией «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в РФ», утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 г. № 266. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие на участие в нем.
Результаты исследования и обсуждение. При анализе полиморфизма М235Т AGT у женщин с гестозом и в контрольной группе получено, что частота встречаемости генотипа ТТ значительно ниже у женщин с гестозом (16,95% vs. 34,0% в группе контроля, P = 0,0472). У женщин с гестозом обнаружена и более низкая частота аллеля Т (46,61% vs. 59,0% в группе гесто-за, p = 0,0776) без статистической значимости. Генотип ММ незначительно отличается в обеих группах (23,73% в группе гестоза vs. 16,0% в контрольной группе, р = 0,4850) (рис. 1).
80% -| 60% -40% -20% -0%
Гестоз Контроль
ИТТПМТ НММ
Рис. 1. Частота встречаемости генотипов ММ, МТ, ТТ у женщин с гестозом и без него
Полученные данные противоречат данным мета-анализа словенских исследователей, где утверждается, что генотип ТТ ассоциирован с развитием гестоза [8]. Однако в исследовании Adrian Mondry и соавт. (2005) генотип ТТ гена AGT (M235T) снижает риск развития гипертензии, особенно среди женщин, что также идет вразрез с другими исследованиями роли данного полиморфизма в развитии гипертонии [9].
В нашем исследовании при анализе E298D (894G > T) полиморфизма гена NOS3 обнаружено недостоверное увеличение частоты генотипа GG при гестозе по сравнению с контролем (55,93% vs. 54,0% соответственно, p = 1,0). Частота генотипа ТТ при гестозе ниже (8,47% vs. 10,0% в группе контроля, p = 1,0). Частоты Т- и G-аллелей и гетерозигот в обеих группах не имеют статистически значимых отличий (26,27% vs. 28,00% в группе контроля, 73,73% vs. 72% в группе контроля, 35,59% vs. 36,00% в группе контроля) (рис. 2).
60% -I
40% -
20% -
0%
Гестоз
Контроль ITT
иш пат
Рис. 2. Частота встречаемости генотипов ОО, ОТ, ТТ у женщин с гестозом и без него
Таким образом, в нашем исследовании не обнаружена связь полиморфизма NOS3 (E298D) с развитием у беременных женщин «чистой» формы гестоза.
Данные результаты являются предварительными и позволяют нам акцентировать внимание на протективной роли генотипа ТТ полиморфизма М235Т гена AGT в развитии гестоза.
Для достоверности результатов требуется увеличение выборки участников исследования с учетом частоты встречаемости аллелей в популяции. Кроме описанных выше полиморфизмов, планируется изучить роль гена ан-гиотензинпревращающего фермента в развитии гестоза, а также генов, связанных с оксидативным стрессом, ангиогенезом, межклеточным взаимодействием, с перспективой выявления возможного синергического эффекта различных сочетаний «функционально неблагоприятных» генотипов по данным генам при развитии и прогрессировании гестоза.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Акушерство: Национальное руководство / Под ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского, Г.М. Савельевой. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 1200 с.
[2] Руководство по амбулаторно-поликлинической помощи в акушерстве и гинекологии / Под ред. В.И. Кулакова, В.Н. Прилепской, В.Е. Радзинского. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 1056 с.
[3] Chappell S., Morgan L // Clinical Science. - 2006. - Vol. 110. - P. 443-458.
[4] Cnattingius S., Reilly M., Pawitan Y., Lichtenstein P // Am. J. Med. Genet. A. - 2004. -Vol. 30A. - № 4. - P. 365-371.
[5] GoddardK.A., Tromp G., Romero R. et al // Hum. Hered. - 2007. - Vol. 63. - P. 1-16.
[6] Irminger-Finger I., Jastrow N., Irion O //Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2008. - Vol. 40. -№ 10. - P. 1979-1983.
[7] Kaaja R //Minerva Ginecol. - 2008. - Vol. 60. - № 5. - P. 421-429.
[8] Medica I., Kastrin A., Peterlin B // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 2007. -Vol. 131. - № 2. - P. 115-126.
[9] Mondry A., Loh M., Liu P. et al//BMC Nephrology. - 2005. - Vol. 6. - P. 1-11.
[10] Mütze S., Rudnik-Schöneborn S., Zerres K., Rath W// J. Perinat. Med. - 2008. - Vol. 36. -P. 38-58.
[11] Myatt L., Webster R.P // J. Thromb. Haemost. - 2009. - Vol. 7. - № 3. - P. 375-384.
[12] Roten L.T., Johnson M.P., Forsmo S. et al // Eur. J. Hum. Genet. - 2009. - Vol. 17. -№ 2. - P. 250-257.
[13] Serrano N.C. Immunology and genetic of preeclampsia // Clinical & Developmental Immunology. - 2006. - Vol. 3. - № 2/4. - P. 197-201.
[14] Lim K-H., Steinberg G. Preeclampsia // http://emedicine.medscape.com/article/1476919-overview#Angiogenic. Updated: Jul 2009.
THE (M235T) POLYMORPHISM OF ANGIOTENSINOGEN GENE AND THE (E298D) POLYMORPHISM OF ENDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE IN WOMEN WITH GESTOSIS
I.P. Knyazeva, L.M. Samokhodskaya, T.A. Kosikova
Laboratory of genetic and cell's technologies Faculty of Basic Medicine Moscow State University named after M.V. Lomonosov Lomonosovsky Av., 31-5, Moscow, Russia, 119192
V.E. Radzinsky, T.V. Galina, F.M. Eseneeva
Department of Obstetrics and Gynecology with the course of Perinathology Peoples' Friendship University of Russia Mikluho-Maklaya Str., 8, Medical Faculty, Moscow, Russia, 117198
K.M. Ryabcev
Clinical Hospital № 29 Gospitalnaya sq., 2, Moscow, Russia, 111020
After genetic analysis of blood samples (by using polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism (PCR/RFLP) and real time PCR) from 59 patients with gestosis and from 50 healthy pregnant women we obtained a lower frequency of mutated TT genotype of M235T polymorphism of angiotensinogen gene (AGT) in gestosis group (p = 0,0472). The T-allele is also lower in gestosis group (p = 0,0776) but without statistical significance. The GG genotype of 894G > T polymorphism of endothelial nitric oxide synthase gene (NOS3) is higher in gestosis group without statistical significance (p > 0,05). No differences are observed in G- and T-alleles and heterozygous of E298D polymorphism in both groups (all p > 0,05). We used a two-tailed p-value for Fisher's exact test in statistics. The overrepre-sentation of TT genotype of M235T polymorphism in controls may point a protective role of the genotype. The NOS3 E298D polymorphism did not affect the incidence of gestosis in Russian women.
Key words: pregnancy, gestosis, polymorphisms, genotype, factors of risk, analysis.
